本申請是申請日為2010年01月22日的題為“改善的用于人乳頭狀瘤病毒的疫苗及其使用方法”的中國專利申請?zhí)?01080005583.7的分案申請。
本發(fā)明涉及改善的人乳頭狀瘤病毒(hpv)疫苗、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的改善的方法、和針對hpv預(yù)防和/或治療地免疫個體。
背景技術(shù)：
該申請要求2009年1月23日提交的美國臨時申請no.61/146,942、2010年1月21日提交的美國專利申請no.12/691,588的優(yōu)先權(quán)，其公開均通過引用的方式并入本文。
乳頭狀瘤病毒是小dna病毒，其包含至多7個早期基因和兩個晚期基因。通常，乳頭狀瘤病毒早期基因表示為e1-e7，并且乳頭狀瘤病毒晚期基因表示為l1和l2。數(shù)個物種的動物可被乳頭狀瘤病毒家族的成員感染。
人乳頭狀瘤病毒(hpv)感染是常見的，并且可進(jìn)行性傳播?；赿na序列的同源性，hpv已經(jīng)裂化為56或更多的類型。hpv型16和18(其引起上皮異常增生和其他損害)通常和下列情況有關(guān)：癌癥風(fēng)險增加，特別是子宮頸、陰道、陰戶和肛管的原位和侵入性癌。
dna疫苗法相對于更加傳統(tǒng)的疫苗法具有更多概念上的優(yōu)點，例如活減毒病毒和重組蛋白-基疫苗。dna疫苗是安全、穩(wěn)定、容易生產(chǎn)和在前期臨床的人中具有良好忍耐性的，這表明質(zhì)粒整合的較少證據(jù)[martin,t.,etal.,plasmiddnamalariavaccine:thepotentialforgenomicintegrationafterintramuscularinjection.humgenether,1999.10(5):p.759-68；nichols,w.w.,etal.,potentialdnavaccineintegrationintohostcellgenome.annnyacadsci,1995.772:p.30-9]。另外，dna疫苗非常適用于反復(fù)施用，因為下列事實疫苗的效果不受到對于載體預(yù)存在的抗體滴度的影響[chattergoon,m.,j.boyer,andd.b.weiner,geneticimmunization:anewerainvaccinesandimmunetherapeutics.fasebj,1997.11(10):p.753-63]。然而，在移動至較大動物時，臨床采用dna疫苗的一個主要障礙在平臺免疫原性中減少[liu,m.a.andj.b.ulmer,humanclinicaltrialsofplasmiddnavaccines.advgenet,2005.55:p.25-40]。dna疫苗免疫原的工程化中的近期技術(shù)進(jìn)展例如密碼子優(yōu)化、rna優(yōu)化和免疫球蛋白前導(dǎo)序列的加入已經(jīng)改善了dna疫苗的表達(dá)和免疫原性[andre,s.,etal.,increasedimmuneresponseelicitedbydnavaccinationwithasyntheticgp120sequencewithoptimizedcodonusage.jvirol,1998.72(2):p.1497-503；deml,l.,etal.,multipleeffectsofcodonusageoptimizationonexpressionandimmunogenicityofdnacandidatevaccinesencodingthehumanimmunodeficiencyvirustype1gagprotein.jvirol,2001.75(22):p.10991-1001；laddy,d.j.,etal.,immunogenicityofnovelconsensus-baseddnavaccinesagainstavianinfluenza.vaccine,2007.25(16):p.2984-9；frelin,l.,etal.,codonoptimizationandmrnaamplificationeffectivelyenhancestheimmunogenicityofthehepatitiscvirusnonstructural3/4agene.genether,2004.11(6):p.522-33],以及質(zhì)粒遞送系統(tǒng)的近期開發(fā)的技術(shù)例如電穿孔[hirao,l.a.,etal.,intradermal/subcutaneousimmunizationbyelectroporationimprovesplasmidvaccinedeliveryandpotencyinpigsandrhesusmacaques.vaccine,2008.26(3):p.440-8；luckay,a.,etal.,effectofplasmiddnavaccinedesignandinvivoelectroporationontheresultingvaccine-specificimmuneresponsesinrhesusmacaques.jvirol,2007.81(10):p.5257-69；ahlen,g.,etal.,invivoelectroporationenhancestheimmunogenicityofhepatitiscvirusnonstructural3/4adnabyincreasedlocaldnauptake,proteinexpression,inflammation,andinfiltrationofcd3+tcells.jimmunol,2007.179(7):p.4741-53]。另外，相比于單獨的天然抗原，研究表明共有序列免疫原的使用可能夠增加細(xì)胞免疫應(yīng)答的寬度[yan.,j.,etal.,enhancedcellularimmuneresponseselicitedbyanengineeredhiv-1subtypebconsensus-basedenvelopednavaccine.molther,2007.15(2):p.411-21；rolland,m.,etal.,reconstructionandfunctionofancestralcenter-of-treehumanimmunodeficiencyvirustype1proteins.jvirol,2007.81(16):p.8507-14]。
仍保留對于改善的疫苗和預(yù)防與治療hpv感染的方法的需要。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
發(fā)明概述
提供包含共有序列hpv型18(hpv18)e6和e7氨基酸序列的蛋白、和包含編碼這些蛋白的核苷酸序列的核酸分子。這些核酸構(gòu)建體和進(jìn)而編碼的蛋白提供針對可產(chǎn)生抗-hpv免疫應(yīng)答的改善的免疫原性靶。
還提供編碼這些蛋白的構(gòu)建體、包含這些蛋白的疫苗、包含編碼這些蛋白的核酸分子的疫苗、以及誘導(dǎo)抗-hpv免疫應(yīng)答的方法。
本發(fā)明的方面包括核酸分子，包含選自下列的核苷酸序列:seqidno:1；seqidno:1的片段；與seqidno:1具有至少90％同源性的序列；與seqidno:1具有至少90％同源性的序列的片段；seqidno:5；包括hpv編碼序列的seqidno:5的片段；與seqidno:5具有至少90％同源性的序列；以及包括hpv編碼序列的與seqidno:5具有至少90％同源性的序列的片段；seqidno:7；包括hpv編碼序列的seqidno:7的片段；與seqidno:7具有至少90％同源性的序列；以及包括hpv編碼序列的與seqidno:7具有至少90％同源性的序列的片段。
本發(fā)明涉及核酸分子，包含選自下列的核苷酸序列:編碼seqidno:2的核苷酸序列；編碼與seqidno:2具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；編碼seqidno:2的片段的核苷酸序列；編碼與seqidno:2的片段具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；編碼seqidno:6的核苷酸序列；包括hpv序列的編碼seqidno:6的片段的核苷酸序列；包括hpv序列的編碼與seqidno:6具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；以及包括hpv序列的編碼與seqidno:6的片段具有至少90％同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供包含這種核酸分子的藥物組合物、以及它們在個體中針對hpv誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法中的用途，該方法包括向個體施用包含這種核酸分子的組合物。
本發(fā)明還提供包含這種核酸分子的重組疫苗、以及它們在個體中針對hpv誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法中的用途，該方法包括向個體施用重組疫苗。
本發(fā)明還提供包含這種核酸分子的活減毒的病原體、以及它們在個體中針對hpv誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法中的用途，該方法包括向個體施用這些活減毒的病原體。
本發(fā)明還提供包含氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列選自：seqidno:2,與seqidno:2具有至少90％同源性的序列；seqidno:2的片段；與seqidno:2具有至少90％同源性的序列的片段；seqidno:6,與seqidno:6具有至少90％同源性的序列；seqidno:6的片段；以及與seqidno:6具有至少90％同源性的序列的片段。
本發(fā)明還提供包含這些蛋白的藥物組合物、以及它們在個體中針對hpv誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法中的用途，該方法包括向個體施用包含這些蛋白的組合物。
本發(fā)明還提供包含這些蛋白的重組疫苗、以及它們在個體中針對hpv誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法中的用途，該方法包括向個體施用包含這些重組疫苗。
本發(fā)明還提供包含這些蛋白的活減毒的病原體、以及它們在個體中針對hpv誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法中的用途，該方法包括向個體施用這些活減毒的病原體。
附圖說明
圖1提供質(zhì)粒構(gòu)建體的描述。
具體實施方式
如本文中所使用的，措詞"嚴(yán)格雜交條件"或"嚴(yán)格條件"是指這樣的條件，在該條件下核酸分子將雜交另外的核酸分子，但不雜交其他序列。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且在不同情況下將是不同的。較長序列在較高溫度下特異性雜交。通常，對于在限定離子強度和ph下的特定序列，嚴(yán)格條件被選擇為低于熱熔點(tm)約5℃。tm是這樣的溫度(在限定的離子強度、ph和核酸濃度)，在該溫度下與靶序列互補的50％的探針與靶序列雜交平衡。由于靶序列通常存在過量，因此在tm下50％的探針被占據(jù)平衡。典型地，嚴(yán)格條件被選擇為其中在ph7.0至8.3下鹽濃度低于約1.0m鈉離子，典型地約0.01至1.0m鈉離子(或其他鹽)，并且對于較短探針、引物或寡核苷酸(例如10至50個核苷酸)溫度為至少約30℃，對于較長探針、引物或寡核苷酸溫度為至少約60℃。嚴(yán)格條件還可使用加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實現(xiàn)。
核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用fasta、blast和gappedblast(altschuletal.,nuc.acidsres.,1997,25,3389，其通過引用全部并入本文)和paup*4.0b10軟件(d.l.swofford,sinauerassociates,massachusetts)來測定?！邦愃瓢俜致省笔褂胮aup*4.0b10軟件(d.l.swofford,sinauerassociates,massachusetts)來計算。共有序列的平均類似度比較于系統(tǒng)樹中的所有序列來計算。
簡言之，代表basiclocalalignmentsearchtool的blast算法適用于確定序列類似性(altschuletal.,j.mol.biol.,1990,215,403-410,其通過引用全部并入本文)。進(jìn)行blast分析的軟件通過nationalcenterforbiotechnologyinformation公開可得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。該算法包括首先通過鑒定在查詢序列中長度w的短字串，該字串與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字串比對時或者匹配或者滿足某些正數(shù)值閾值分值t，從而來鑒定高分序列配對(hsp)。t被稱為鄰近字串閾值(altschuletal.,同上)。這些原始部近字串命中作為起始搜索以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長hsp的種子。只要累積序列比對分值可以增加，字串命中則以兩個方向沿每個序列延伸。字串命中在每個方向的延伸當(dāng)遇到下述情況之一時終止：1)累積序列比對分值比其獲得的最大值低數(shù)量x；2)累積分值為零或零以下，這是由于一個或多個負(fù)打分殘基比對的累積所致；或者3)到達(dá)任一序列的末端。blast算法參數(shù)w、t和x決定所述比對的靈敏度和速度。blastn程序使用的比對(b)為50，缺省字長(w)為11，期望值(e)為10，m＝5，n＝4，并且比較兩條鏈，blosum62打分矩陣(參見henikoffetal.,proc.natl.acad.sci.usa,1992,89,10915-10919,其通過引用全部并入本文)。blast算法(karlinetal.,proc.natl.acad.sci.usa,1993,90,5873-5787，其通過引用全部并入本文)和gappedblast進(jìn)行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計學(xué)分析。blast算法提供的一種相似性測定是最小和概率(p(n))，它提供兩個核苷酸序列或氨基酸序列可能偶然發(fā)生匹配的概率的指標(biāo)。例如，如果待測核酸與參比核酸比較中的最小和概率大約小于1，優(yōu)選大約小于0.1，更優(yōu)選大約小于0.01，最優(yōu)選小于約0.001，則認(rèn)為待測核酸與參比序列相似。
如本文中所使用的，術(shù)語“基因構(gòu)建體"是指dna或rna分子，其包含編碼蛋白的核苷酸序列。編碼序列包括可操作的連接調(diào)節(jié)元件(包括啟動子)的引發(fā)和終止信號、和能夠在個體(其施用核酸分子)細(xì)胞內(nèi)引導(dǎo)表達(dá)的聚腺苷酸化信號。
如本文中所使用的，術(shù)語"可表達(dá)的形式"是指含有可操作地連接編碼序列的必需調(diào)節(jié)元件的基因構(gòu)建體，所述編碼序列編碼蛋白使得當(dāng)存在于個體的細(xì)胞中時，編碼序列被表達(dá)。
公開改善的疫苗，該疫苗源自多階段戰(zhàn)略以增強由免疫原誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。產(chǎn)生修飾的共有序列序列。還公開了基因修飾，包括密碼子優(yōu)化、rna優(yōu)化和添加高效免疫球蛋白前導(dǎo)序列。新的構(gòu)建體已經(jīng)被設(shè)計來誘導(dǎo)比對應(yīng)的密碼子優(yōu)化的免疫原更強和更寬的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
改善的hpv疫苗基于蛋白和編碼具有抗原決定基的蛋白的基因構(gòu)建體，所述抗原決定基使它們作為免疫原特別有效，針對所述所述免疫原可誘導(dǎo)抗-hpv。因此，疫苗可誘導(dǎo)治療或預(yù)防性免疫應(yīng)答。在一些實施方案中，遞送免疫原的方式是dna疫苗,重組疫苗,蛋白質(zhì)亞單位疫苗,包含免疫原、減毒疫苗或滅活疫苗的組合物。在一些實施方案中，疫苗包含選自下列的組合：一種或多種dna疫苗,一種或多種重組疫苗,一種或多種蛋白質(zhì)亞單位疫苗,一種或多種包含免疫原的組合物,一種或多種減毒疫苗和一種或多種滅活疫苗。
根據(jù)一些實施方案，疫苗遞送至個體以調(diào)節(jié)個體的免疫系統(tǒng)的活性并且從而增強針對hpv的免疫應(yīng)答。當(dāng)編碼蛋白的核酸分子被個體細(xì)胞所攝取時，核苷酸序列在細(xì)胞中表達(dá)并且蛋白從而遞送至個體。提供：在核酸分子例如質(zhì)粒(作為重組疫苗的一部分和作為減毒疫苗的一部分，作為分離的蛋白或載體的蛋白部分)上遞送蛋白的編碼序列的方法。
提供預(yù)防和/或治療免疫針對hpv的個體的組合物和方法。
遞送核酸分子(其包含編碼免疫原的核苷酸序列)的組合物可操作地連接調(diào)節(jié)元件。組合物可包含編碼免疫原的質(zhì)粒、包含編碼免疫原的核苷酸序列的重組疫苗、編碼本發(fā)明的蛋白和/或包含本發(fā)明的蛋白的活減毒的病原體、包含本發(fā)明的蛋白的滅活的病原體、或組合物例如包含本發(fā)明的蛋白的脂質(zhì)體或亞單位疫苗。本發(fā)明還涉及包含組合物的可注射的藥物組合物。
seqidno:1包含編碼hpv18e6和e7蛋白的共有序列免疫原的核苷酸序列。seqidno:5包括seqidno:1，并且還包含連接編碼hpv18e6和e7蛋白的共有序列免疫原的核苷酸序列的ige前導(dǎo)序列。seqidno:2包含hpv18e6和e7蛋白的共有序列免疫原的氨基酸序列。seqidno:6包含seqidno:2并且還包含連接共有序列免疫原序列的ige前導(dǎo)序列。ige前導(dǎo)序列是seqidno:4，并且可被seqidno:3編碼。seqidno:7是質(zhì)粒pgx302的核酸序列，其中引入seqidno:5以用于表達(dá)。
在一些實施方案中，疫苗包括seqidno:2或編碼seqidno:2的核酸分子。在一些實施方案中，疫苗包括seqidno:1作為編碼seqidno:2的核酸分子。在一些實施方案中，疫苗優(yōu)選包含seqidno:6或編碼其的核酸分子。在一些實施方案中，疫苗優(yōu)選包含seqidno:5作為編碼seqidno:6的核酸分子。在一些實施方案中，疫苗優(yōu)選包含seqidno:7。
seqidno:1的片段可包含90或更多個核苷酸。在一些實施方案中，seqidno:1的片段可包含180或更多個核苷酸；在一些實施方案中可包含270或更多個核苷酸；在一些實施方案中可包含360或更多個核苷酸；在一些實施方案中可包含450或更多個核苷酸；在一些實施方案中可包含540或更多個核苷酸；在一些實施方案中可包含630或更多個核苷酸；在一些實施方案中可包含720或更多個核苷酸；以及在一些實施方案中可包含770或更多個核苷酸。在一些實施方案中，seqidno:1的片段例如本文中闡述的那些還可包含用于ige前導(dǎo)序列的編碼序列。在一些實施方案中，seqidno:1的片段不包含用于ige前導(dǎo)序列的編碼序列。seqidno:1的片段可包含少于180個核苷酸,在一些實施方案中可包含少于270個核苷酸,在一些實施方案中可包含少于360個核苷酸,在一些實施方案中可包含少于450個核苷酸,在一些實施方案中可包含少于540個核苷酸,在一些實施方案中可包含少于630個核苷酸,在一些實施方案中可包含少于690個核苷酸,在一些實施方案中可包含少于760個核苷酸、以及在一些實施方案中可包含少于780個核苷酸。
seqidno:2的片段可包含30或更多個氨基酸。在一些實施方案中，seqidno:2的片段可包含60或更多個氨基酸；在一些實施方案中可包含90或更多個氨基酸；在一些實施方案中可包含120或更多個氨基酸；在一些實施方案中可包含150或更多個氨基酸；在一些實施方案中可包含180或更多個氨基酸；在一些實施方案中可包含210或更多個氨基酸；以及在一些實施方案中可包含240或更多個氨基酸。片段可包含少于90個氨基酸,在一些實施方案中可包含少于120個氨基酸,在一些實施方案中可包含少于150個氨基酸,在一些實施方案中可包含少于180個氨基酸,在一些實施方案中可包含少于210個氨基酸,以及在一些實施方案中可包含少于240個氨基酸。
seqidno:5的所有片段包含編碼hpv序列的編碼序列，即seqidno:5的片段必須包含除了那些編碼ige前導(dǎo)肽之外的序列。在一些實施方案中，seqidno:5的片段包含90或更多個核苷酸。在一些實施方案中，seqidno:5的片段可包含180或更多個核苷酸；在一些實施方案中包含270或更多個核苷酸；在一些實施方案中包含360或更多個核苷酸；在一些實施方案中包含450或更多個核苷酸；在一些實施方案中包含540或更多個核苷酸；在一些實施方案中包含630或更多個核苷酸；在一些實施方案中包含720或更多個核苷酸；在一些實施方案中包含810或更多個核苷酸；以及在一些實施方案中包含830或更多個核苷酸。seqidno:5的片段可包含少于180個核苷酸,在一些實施方案中包含少于270個核苷酸,在一些實施方案中包含少于360個核苷酸,在一些實施方案中包含少于450個核苷酸,在一些實施方案中包含少于540個核苷酸,在一些實施方案中包含少于630個核苷酸,在一些實施方案中包含少于690個核苷酸,在一些實施方案中包含少于720個核苷酸,在一些實施方案中包含少于780個核苷酸,以及在一些實施方案中包含少于840個核苷酸。
seqidno:6的片段可包含30或更多個氨基酸包含hpv序列。在一些實施方案中，seqidno:6的片段可包含60或更多個氨基酸包含hpv序列；在一些實施方案中，90或更多個氨基酸包含hpv序列；在一些實施方案中，120或更多個氨基酸包含hpv序列；在一些實施方案中，150或更多個氨基酸包含hpv序列；在一些實施方案中，180或更多個氨基酸包含hpv序列；在一些實施方案中，210或更多個氨基酸包含hpv序列；在一些實施方案中，240或更多個氨基酸包含hpv序列；以及在一些實施方案中，270或更多個氨基酸包含hpv序列。片段可包含少于90個氨基酸包含hpv序列,在一些實施方案中包含少于120個氨基酸包含hpv序列,在一些實施方案中包含少于150個氨基酸包含hpv序列,在一些實施方案中包含少于180個氨基酸包含hpv序列,在一些實施方案中包含少于210個氨基酸包含hpv序列,在一些實施方案中包含少于240個氨基酸包含hpv序列,以及在一些實施方案中包含少于270個氨基酸包含hpv序列。
根據(jù)一些實施方案，在個體中誘導(dǎo)針對免疫原的免疫應(yīng)答的方法包括向個體施加hpv18e6和e7蛋白、或其功能片段、或其可表達(dá)的編碼序列的共有序列免疫原的氨基酸序列。一些實施方案包括分離的核酸分子，其編碼hpv18e6和e7蛋白或其片段的共有序列免疫原的氨基酸序列。一些實施方案包括重組疫苗，其編碼hpv18e6和e7蛋白或其片段的共有序列免疫原的氨基酸序列。一些實施方案包括亞單位疫苗，其包含hpv18e6和e7蛋白或其片段的共有序列免疫原的氨基酸序列。一些實施方案包括活減毒疫苗和/或滅活疫苗，其包含hpv18e6和e7蛋白的共有序列免疫原的氨基酸序列。
改善的疫苗包含蛋白和編碼具有抗原決定基的蛋白的基因構(gòu)建體，所述抗原決定基使它們作為免疫原特別有效，針對所述所述免疫原可誘導(dǎo)抗-hpv免疫應(yīng)答。因此，可提供疫苗以誘導(dǎo)治療或預(yù)防性免疫應(yīng)答。在一些實施方案中，遞送免疫原的方式是dna疫苗,重組疫苗,蛋白質(zhì)亞單位疫苗,包含免疫原、減毒疫苗或滅活疫苗的組合物。在一些實施方案中，疫苗包含選自下列的組合：一種或多種dna疫苗,一種或多種重組疫苗,一種或多種蛋白質(zhì)亞單位疫苗,一種或多種包含免疫原的組合物,一種或多種減毒疫苗和一種或多種滅活疫苗。
本發(fā)明的方面提供在核酸分子例如質(zhì)粒(作為重組疫苗的一部分和作為減毒疫苗的一部分，作為分離的蛋白或載體的蛋白部分)上遞送蛋白的編碼序列的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供預(yù)防和/或治療免疫個體的組合物和方法。
dna疫苗描述于美國專利no.5,593,972,5,739,118,5,817,637,5,830,876,5,962,428,5,981,505,5,580,859,5,703,055,5,676,594和本文中引用的優(yōu)先權(quán)申請，其均通過引用并入本文。除了這些申請中所述的遞送方案，遞送dna的可替換的方法描述于美國專利no.4,945,050和5,036,006，其都通過引用并入本文。
本發(fā)明涉及改善的減毒活疫苗,改善的滅活疫苗、和改善的疫苗(其使用重組載體以遞送編碼抗原的外部基因)、以及亞單位和糖蛋白疫苗。減毒活疫苗、使用重組載體以遞送外部抗原的那些疫苗、亞單位疫苗和糖蛋白疫苗的例子描述于美國轉(zhuǎn)利no.:4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319和6,589,529，其均通過引用的方式并入本文。
當(dāng)被細(xì)胞攝取時，基因構(gòu)建體可保持在細(xì)胞中作為功能染色體外分子和/或整合到細(xì)胞的染色體dna中。dna可引入細(xì)胞中，在該細(xì)胞中其保持為一種或多種質(zhì)粒形式的單獨的基因材料?？蛇x擇地，可整合到染色體中的線性dna可引入到細(xì)胞中。當(dāng)將dna引入細(xì)胞中時，可以加入這樣的試劑，該試劑促進(jìn)dna整合到染色體中。用于促進(jìn)整合的dna序列還可包括在dna分子中?？蛇x擇地，rna可施加至細(xì)胞。還涵蓋提供基因構(gòu)建體作為線性微型染色體，包括著絲粒,端粒和復(fù)制源?；驑?gòu)建體可在減毒活微生物或在細(xì)胞中存活的重組微生物載體中保持為基因材料的一部分?；驑?gòu)建體可以是重組病毒疫苗的基因組的一部分，其中基因材料整合到細(xì)胞的染色體中或保持染色體外?；驑?gòu)建體包括核酸分子的基因表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)元件。元件包括：啟動子、啟動密碼子、終止密碼子和聚腺苷酸化信號。另外，通常需要增強子進(jìn)行序列的基因表達(dá)，所述序列編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白。必需的是這些元件可操作地連接編碼期望的蛋白的序列、以及調(diào)節(jié)元件在施加它們的個體中是可操作的。
啟動密碼子和終止密碼子通常被認(rèn)為是編碼期望的蛋白的核苷酸序列的一部分。然而，必需的是這些元件在施加基因構(gòu)建體的個體中是發(fā)揮作用的。啟動密碼子和終止密碼子必須和編碼序列在框架內(nèi)。
使用的啟動子和聚腺苷酸化信號必須在個體的細(xì)胞內(nèi)是可發(fā)揮功能的。
用于實施本發(fā)明、特別是用于人的基因疫苗的制備的啟動子的例子包括但不限于：來自猿猴病毒40(sv40)的啟動子,小鼠乳腺腫瘤病毒(mmtv)啟動子,人類免疫缺陷病毒(mv)例如biv長末端重復(fù)(ltr)啟動子,莫洛尼氏病毒,alv,細(xì)胞巨化病毒(cmv)例如cmv即刻早期啟動子,eb病毒(ebv),勞氏肉瘤病毒(rsv)、以及來自人基因(例如人肌動蛋白,人肌球蛋白,人血紅蛋白,人肌肉肌酸和人金屬硫蛋白)的啟動子。
用于實施本發(fā)明、特別是用于人的基因疫苗的制備的聚腺苷酸化信號的例子包括但不限于：sv40聚腺苷酸化信號和ltr聚腺苷酸化信號。特別地，使用在pcep4質(zhì)粒(invitrogen,sandiegoca)中的sv40聚腺苷酸化信號，稱為sv40聚腺苷酸化信號。
除了dna表達(dá)所需要的調(diào)節(jié)元件，其他元件也可包含在dna分子中。這些另外的元件包括增強子。增強子可選自下列組，所述組包括但不限于:人肌動蛋白,人肌球蛋白,人血紅蛋白,人肌肉肌酸和病毒增強子例如來自cmv,rsv和ebv的那些。
為了保持染色體外構(gòu)建和在細(xì)胞中制備構(gòu)建體的多個拷貝，基因構(gòu)建體可設(shè)置有復(fù)制的哺乳動物源。來自invitrogen(sandiego,ca)的質(zhì)粒pvax1,pcep4和prep4含有復(fù)制的eb病毒源和核抗原ebna-1編碼區(qū)域，該編碼區(qū)域產(chǎn)生高拷貝的附加型復(fù)制而沒有整合。
在涉及免疫應(yīng)用的一些優(yōu)選實施方案中，核酸分子被遞送，其包含編碼本發(fā)明的蛋白的核苷酸序列，并且另外包含進(jìn)一步增強針對這些靶蛋白的免疫應(yīng)答的蛋白的基因。這些基因的例子是：編碼其他細(xì)胞因子和淋巴因子的那些例如α-干擾素,γ-干擾素,血小板源生長因子(pdgf),tnfα,tnfβ,gm-csf,上皮生長因子(egf),il-1,il-2,il-4,il-5,il-6,il-10,il-12,il-18,mhc,cd80,cd86和il-15誘導(dǎo)il-15(具有缺失的信號序列并且任選地包含來自ige的信號肽)?？墒褂玫钠渌虬ň幋a下列的那些：mcp-1,mip-l,mip-1p,il-8,rantes,l-選擇蛋白,p-選擇蛋白,e-選擇蛋白,cd34,glycam-1,madcam-1,lfa-1,vla-1,mac-1,pl50.95,pecam,icam-1,icam-2,icam-3,cd2,lfa-3,m-csf,g-csf,il-4,il-18的突變形式,cd40,cd40l,血管生長因子,il-7,神經(jīng)生長因子,血管內(nèi)皮生長因子,fas,tnf受體,flt,apo-1,p55,wsl-1,dr3,tramp,apo-3,air,lard,ngrf,dr4,dr5,killer,trail-r2,trick2,dr6,半胱天冬酶ice,fos,c-jun,sp-1,ap-1,ap-2,p38,p65rel,myd88,irak,traf6,ikb,失活nik,sapk,sap-1,jnk,干擾素應(yīng)答基因,nfkb,bax,trail,trailrec,trailrecdrc5,trail-r3,trail-r4,rank,rankligand,ox40,ox40ligand,nkg2d,mica,micb,nkg2a,nkg2b,nkg2c,nkg2e,nkg2f,tap1,tap2及其功能片段。
可加入另外的元件，如果期望為了任何原因除去接受基因構(gòu)建體的細(xì)胞，該元件起到細(xì)胞破壞的靶的作用?？杀磉_(dá)形式的皰疹病毒胸苷激酶(tk)基因可包含在基因構(gòu)建體中。藥物更昔洛韋可施加至個體并且藥物將引起任何產(chǎn)生tk的細(xì)胞的選擇性殺死，因此提供選擇性破壞具有基因構(gòu)建體的細(xì)胞的方式。
為了最大化蛋白制備，可選擇調(diào)節(jié)序列，其非常適用于在施用構(gòu)建體的細(xì)胞中基因表達(dá)。而且，可選擇密碼子，其在細(xì)胞中最高效地轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域技術(shù)人員可制備在細(xì)胞中發(fā)揮功能的dna構(gòu)建體。
在一些實施方案中，可提供基因構(gòu)建體，其中本文中所述的蛋白的編碼序列連接ige信號肽。在一些實施方案中，本文中所述的蛋白連接ige信號肽。
在使用蛋白的一些實施方案中，例如使用熟知的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用熟知的技術(shù)來制備和分離本發(fā)明的蛋白。在使用蛋白的一些實施方案中，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用熟知的技術(shù)來將編碼本發(fā)明的蛋白的dna分子插入在熟知表達(dá)系統(tǒng)中使用的市售表達(dá)載體。例如，市售質(zhì)粒pse420(invitrogen,sandiego,calif.)可用于制備e.coli中的蛋白。市售質(zhì)粒pyes2(invitrogen,sandiego,calif.)可例如用于在酵母的s.cerevisiae菌株中制備。市售maxbactm完整的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(invitrogen,sandiego,calif.)可例如用于在昆蟲細(xì)胞中制備。市售質(zhì)粒pcdnai或pcdna3(invitrogen,sandiego,calif.)可例如用于在哺乳動物細(xì)胞例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞中制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用這些市售表達(dá)載體和系統(tǒng)或其他載體和系統(tǒng)來通過常規(guī)技術(shù)和容易獲得的起始材料制備蛋白。(例如參見sambrooketal.,molecularcloningalaboratorymanual,seconded.coldspringharborpress(1989)，其通過引用并入本文)。因此，期望蛋白可在真核和原核系統(tǒng)中制備，從而導(dǎo)致蛋白的加工形式的譜。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用其他市售表達(dá)載體和系統(tǒng)或使用熟知方法和容易獲得的起始材料來制備載體。含有需要的控制序列例如啟動子和聚腺苷酸化信號、優(yōu)選增強子的表達(dá)系統(tǒng)對于大部分宿主是容易獲得的和本領(lǐng)域已知的。例如參見sambrooketal.,molecularcloningalaboratorymanual,seconded.coldspringharborpress(1989)?；驑?gòu)建體包括可操作地連接啟動子的蛋白編碼序列，所述啟動子在轉(zhuǎn)染構(gòu)建體的細(xì)胞系中發(fā)揮作用。組成型啟動子的例子包括來自細(xì)胞巨化病毒或sv40的啟動子?？烧T導(dǎo)啟動子的例子包括小鼠乳腺細(xì)胞白血病病毒或金屬硫蛋白啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地制備用于使用dna轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因構(gòu)建體，所述dna編碼來自市售起始材料的本發(fā)明的蛋白。包含編碼蛋白的dna的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化相容性宿主，所述宿主然后培養(yǎng)并保持在這樣的條件，在該條件下發(fā)生外源dna的表達(dá)。
制備的蛋白通過下列方式從培養(yǎng)基中回收：使細(xì)胞胞溶或者使用本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到和已知的培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用熟知技術(shù)分離蛋白，所述蛋白使用這些表達(dá)系統(tǒng)來制備。使用抗體(如上所述特異性結(jié)合特定的蛋白)從天然源純化蛋白的方法可相同地應(yīng)用于通過重組dna方法制備的蛋白的純化。
除了通過重組技術(shù)來制備蛋白，還可以使用自動肽合成來產(chǎn)生分離的基本上純的蛋白。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，并且如果在dna-編碼的蛋白制備中未提供具有置換的衍生物。這些技術(shù)是有用的。
核酸分子可使用數(shù)種熟知的技術(shù)中的任一者來遞送，包括dna注射(也稱為dna接種),重組載體例如重組腺病毒、重組腺病毒相關(guān)的病毒和重組牛痘。
施用途徑包括但不限于肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、眼內(nèi)和口服以及局部、透皮、通過吸入或栓劑、或至粘膜組織例如灌洗陰道、直腸、尿道、面頰和舍下組織。優(yōu)選的施用途徑包括肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)和皮下注射?；驑?gòu)建體可通過這樣的方式來施用，該方式包括但不限于電穿孔方法和裝置、傳統(tǒng)注射器、無針注射裝置或"微彈轟擊基因槍法"。
優(yōu)選用于促進(jìn)dna疫苗的遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法的例子包括下列中描述的那些：美國專利no.7,245,963(draghia-akli,etal.),美國專利公開2005/0052630，由smith,etal.遞交，其內(nèi)容通過引用全部并入本文。還優(yōu)選的是，促進(jìn)dna疫苗的遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法提供于共同待審和共同擁有的美國專利申請序列no.11/874072中，其提交于2007年10月17日，并且在35usc119(e)下要求下列的優(yōu)先權(quán)：2006年10月17日提交的美國臨時申請序列no.60/852,149和2007年10月10日提交的美國臨時申請序列no.60/978,982，其所有通過引用全部并入。
下列是使用電穿孔技術(shù)的實施方案的例子，并且在上述專利文獻(xiàn)中更詳細(xì)地討論：電穿孔裝置可被構(gòu)造為以能量脈沖遞送至哺乳動物的期望組織，從而產(chǎn)生類似于用戶輸入的預(yù)設(shè)電流的恒定電流。電穿孔裝置包括電穿孔組件和電極配件或把手配件。電穿孔組件可包括和引入電穿孔裝置的多種元件中的一個或多個，包括：控制器、電流波形產(chǎn)生器、阻抗試驗器、波形記錄儀、輸入元件、狀態(tài)記錄元件、通信端口、內(nèi)存組件、電源和電源開關(guān)。電穿孔組件可起到電穿孔裝置的一種元件的作用，并且其他元件是和電穿孔組件通信的單獨元件(或組件)。在一些實施方案中，電穿孔組件可起到多于電穿孔裝置的一個元件的作用，其可通信獨立于電穿孔組件的電穿孔裝置的甚至其他元件。使用電穿孔技術(shù)遞送改善的hcv疫苗不受到電穿孔裝置的元件的限制，所述電穿孔裝置現(xiàn)存為一種機電或機械裝置的部分，因為元件可起到和另一種通信的一種裝置或單獨元件的功能。電穿孔組件能夠遞送能量脈沖，其在期望組織產(chǎn)生恒定電流并且包括反饋機構(gòu)。電極配件包括以空間配置具有多個電極的電極陣列，其中電極配件從電穿孔組件接收能量脈沖，并且通過電極將其遞送至期望組織。多個電極中的至少一個在能量脈沖的遞送過程中是中性的，并且在期望組織測量電阻和將電阻通信至電穿孔組件。反饋機構(gòu)可接收測量的電阻，并且可調(diào)節(jié)由電穿孔組件遞送的能量脈沖以保持恒定電流。
在一些實施方案中，多個電極可以分散方式來遞送能量脈沖。在一些實施方案中，多個電極可以以分散方式通過電極控制在編程程序下遞送能量脈沖，并且編程程序由用戶輸入至電穿孔組件。在一些實施方案中，編程序列包含在程序中遞送的多個脈沖，其中多個脈沖中的各脈沖通過至少兩個有源電極(其中一個測量電阻的中性電極)來遞送，并且其中多個脈沖的隨后脈沖通過至少兩個有源電極(其中一個測量電阻的中性電極)中的不同的那個來遞送。
在一些實施方案中，反饋機構(gòu)通過硬件或軟件來進(jìn)行。優(yōu)選地，反饋機構(gòu)通過模擬閉環(huán)電路來進(jìn)行。優(yōu)選地，該反饋發(fā)生每隔50μs,20μs,10μs或1μs發(fā)生，但優(yōu)選是實時反饋或瞬時的(即，如通過用于測定應(yīng)答時間的可得技術(shù)所測定的，其基本上是即刻的)。在一些實施方案中，中性電極測量期望組織中的電阻，并且將電阻通信至反饋機構(gòu)，反饋機構(gòu)應(yīng)答于電阻并且調(diào)節(jié)能量脈沖以使恒定電流保持在類似于預(yù)設(shè)電流的數(shù)值。在一些實施方案中，反饋機構(gòu)在能量脈沖遞送的過程中連續(xù)和瞬間地保持恒定電流。
在一些實施方案中，核酸分子結(jié)合下列物質(zhì)的施用而遞送至細(xì)胞：多核苷酸功能增效子或基因疫苗增效劑。多核苷酸功能增效子描述于美國序列號5,593,972,5,962,428和1994年1月26日提交的國際申請序列號pct/us94/00899，其均通過引用的方式并入本文。基因疫苗增效劑描述于1994年4月1日提交的美國序列號021,579，其通過引用并入本文。結(jié)合核酸分子施用的共同藥劑可以和核酸分子的混合物的方式來施用，或者在核酸分子施用的同時、之前或之后單獨施用。另外，其他藥劑可發(fā)揮轉(zhuǎn)染劑和/或復(fù)制劑和/或消炎劑的作用，并且可和下列物質(zhì)共同施用：gvf包括生長因子,細(xì)胞因子和淋巴因子例如a-干擾素,γ-干擾素,gm-csf,血小板源生長因子(pdgf),tnf,表皮生長因子(egf),il-1,il-2,il-4,il-6,il-10,il-12和il-15以及成纖維細(xì)胞生長因子,表面活性劑例如免疫刺激絡(luò)合物(iscoms),弗氏不完全佐劑,lps類似物包括單磷?；|(zhì)a(wl),胞壁肽,醌類似物和囊泡例如三十碳六烯和角鯊烯，并且透明質(zhì)酸也可結(jié)合基因構(gòu)建體施用。在一些實施方案中，免疫調(diào)節(jié)蛋白可用作gvf。在一些實施方案中，提供和plg相關(guān)的核酸分子以增強遞送/攝取。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約1納克至約2000微克dna。在一些優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約5納克至約1000微克dna。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物含有約10納克至約800微克dna。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物含有約0.1至約500微克dna。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物含有約1至約350微克dna。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物含有約25至約250微克dna。在一些優(yōu)選實施方案中，藥物組合物含有約100至約200微克dna。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物根據(jù)使用的施用方式來進(jìn)行配制。在藥物組合物是可注射的藥物組合物的情況下，它們是無菌、無熱原和無顆粒的。優(yōu)選使用等滲制劑。通常，用于等滲的添加劑可包括氯化鈉、右旋糖酐、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情況下，優(yōu)選等滲溶液例如磷酸鹽緩沖液。穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。在一些實施方案中，將血管收縮劑加入制劑。
根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，提供誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。疫苗可以是蛋白基、活減毒疫苗、細(xì)胞疫苗、重組疫苗或核酸或dna疫苗。在一些實施方案中，在個體中針對免疫原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法包括誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答的方法，包括向個體施加下列中的一種或多種：ctack蛋白,teck蛋白,mec蛋白及其功能片段、或其可表達(dá)的編碼序列，并且聯(lián)合編碼本發(fā)明的蛋白的分離的核酸分子、和/或編碼本發(fā)明的蛋白的重組疫苗、和/或本發(fā)明的蛋白的亞單位疫苗、和/或活減毒疫苗和/或滅活疫苗。ctack蛋白,teck蛋白,mec蛋白及其功能片段中的一種或多種可在下列物質(zhì)施用之前、同時或之后施用：編碼免疫原的分離的核酸分子、和/或編碼免疫原的重組疫苗、和/或包含免疫原的亞單位疫苗、和/或活減毒疫苗和/或滅活疫苗。在一些實施方案中，向個體施加編碼選自下列中的一種或多種蛋白的分離的核酸分子：ctack,teck,mec及其功能片段。
在下列實施例中進(jìn)一步描述了本發(fā)明。應(yīng)該理解，該實施例盡管指出了本發(fā)明的實施方案，但是其僅通過示意性的方式給出。從上述討論和該實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明的實質(zhì)性特性，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明進(jìn)行多種改變和變化，以使其適應(yīng)各種應(yīng)用和條件。因此，除了本文中示出和描述那些，從前面描述，本發(fā)明的各種改變對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的。這些改變也旨在落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
本公開中的美國專利、美國申請和引用文獻(xiàn)均通過引用全部并入本文。
實施例
制備用于人乳頭狀瘤病毒(hpv)病毒蛋白18e6&7的優(yōu)化的共有序列序列。序列被設(shè)計用于高水平的表達(dá)。該序列在我們的基因免疫技術(shù)中是有用的。源自使用共有序列進(jìn)行的試驗的結(jié)果是陽性的。圖1提供質(zhì)粒構(gòu)建體的描述，其包括質(zhì)粒pgx3002中共有序列hpv18-6&7的核酸序列(seqidno:7)。引入質(zhì)粒pgx3002中的共有序列hpv18-6&7的核酸序列包括連接共有序列hpv18-6&7的編碼序列的ige前導(dǎo)肽的編碼序列。
質(zhì)粒pgx3002表達(dá)優(yōu)化的人乳頭狀瘤病毒18-6&7抗原(hpv18e6&7，其使用pvax骨架由具有牛生長因素3’末端和聚腺苷酸化信號(bghpa)的cmv啟動子(pcmv)驅(qū)動，所述pvax骨架包括卡那霉素抗性基因(kan)和復(fù)制質(zhì)粒源(pucori)。
序列表
<110>賓夕法尼亞大學(xué)托管會
d·b·韋納
j·嚴(yán)
<120>改善的用于人乳頭狀瘤病毒的疫苗及其使用方法
<130>133172.02700
<150>us61/146,942
<151>2009-01-23
<150>us12/691,588
<151>2010-01-21
<160>7
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>783
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>hpv共有序列編碼e6和e7
<400>1
gccagattcgaggaccccaccaggagcggctacaagctgcccgatctgtgtaccgagctg60
aacaccagcctgcaggacatcgagatcacctgtgtgtactgtaagaccgtgctggagctg120
accgaggtgttcgagaaggacctgttcgtggtgtacagggacagcatcccccacgccgcc180
tgccacaagtgtatcgacttctacagccggatccgggagctgagacactacagcgacagc240
gtgtacggcgataccctggagaagctgaccaacaccggcctgtacaacctgctgatccgg300
tgcctgagatgccagaagcccctgctgagacacctgaacgagaagcggcggttccacaac360
atcgccggccactacagaggccagtgccacagctgctgtaacagggccaggcaggagaga420
ctgcagcggagaagagagacccaggtgaggggcaggaagagaagaagccacggccccaag480
gccaccctgcaggatatcgtgctgcacctggagccccagaatgagatccccgtggatctg540
ctgggccacggccagctgtccgacagcgaggaggagaacgacgagatcgacggcgtgaat600
caccagcacctgcctgccagaagagccgagcctcagaggcacaccatgctgtgtatgtgc660
tgtaagtgtgaggcccggatcgaactggtggtggagagcagcgccgacgacctgagagcc720
ttccagcagctgttcctgaacaccctgagcttcgtgtgtccttggtgtgccagccagcag780
tga783
<210>2
<211>260
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>具有e6和e7的共有hpv肽序列
<400>2
alaargphegluaspprothrargserglytyrlysleuproaspleu
151015
cysthrgluleuasnthrserleuglnaspilegluilethrcysval
202530
tyrcyslysthrvalleugluleuthrgluvalpheglulysaspleu
354045
phevalvaltyrargaspserileprohisalaalacyshislyscys
505560
ileaspphetyrserargilearggluleuarghistyrseraspser
65707580
valtyrglyaspthrleuglulysleuthrasnthrglyleutyrasn
859095
leuleuileargcysleuargcysglnlysproleuleuarghisleu
100105110
asnglulysargargphehisasnilealaglyhistyrargglygln
115120125
cyshissercyscysasnargalaargglngluargleuglnargarg
130135140
arggluthrglnvalargglyarglysargargserhisglyprolys
145150155160
alathrleuglnaspilevalleuhisleugluproglnasngluile
165170175
provalaspleuleuglyhisglyglnleuseraspserglugluglu
180185190
asnaspgluileaspglyvalasnhisglnhisleuproalaargarg
195200205
alagluproglnarghisthrmetleucysmetcyscyslyscysglu
210215220
alaargilegluleuvalvalgluserseralaaspaspleuargala
225230235240
pheglnglnleupheleuasnthrleuserphevalcysprotrpcys
245250255
alaserglngln
260
<210>3
<211>54
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>ige引導(dǎo)dna序列
<400>3
atggactggacctggatcctgttcctggtggccgctgccacacgggtgcacagc54
<210>4
<211>18
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>ige引導(dǎo)肽序列
<400>4
metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval
151015
hisser
<210>5
<211>837
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>包含ige的共有hpv核酸序列轉(zhuǎn)基因
<400>5
atggactggacctggatcctgttcctggtggccgctgccacacgggtgcacagcgccaga60
ttcgaggaccccaccaggagcggctacaagctgcccgatctgtgtaccgagctgaacacc120
agcctgcaggacatcgagatcacctgtgtgtactgtaagaccgtgctggagctgaccgag180
gtgttcgagaaggacctgttcgtggtgtacagggacagcatcccccacgccgcctgccac240
aagtgtatcgacttctacagccggatccgggagctgagacactacagcgacagcgtgtac300
ggcgataccctggagaagctgaccaacaccggcctgtacaacctgctgatccggtgcctg360
agatgccagaagcccctgctgagacacctgaacgagaagcggcggttccacaacatcgcc420
ggccactacagaggccagtgccacagctgctgtaacagggccaggcaggagagactgcag480
cggagaagagagacccaggtgaggggcaggaagagaagaagccacggccccaaggccacc540
ctgcaggatatcgtgctgcacctggagccccagaatgagatccccgtggatctgctgggc600
cacggccagctgtccgacagcgaggaggagaacgacgagatcgacggcgtgaatcaccag660
cacctgcctgccagaagagccgagcctcagaggcacaccatgctgtgtatgtgctgtaag720
tgtgaggcccggatcgaactggtggtggagagcagcgccgacgacctgagagccttccag780
cagctgttcctgaacaccctgagcttcgtgtgtccttggtgtgccagccagcagtga837
<210>6
<211>278
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>具有ige前導(dǎo)肽的共有hpv蛋白序列
<400>6
metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval
151015
hisseralaargphegluaspprothrargserglytyrlysleupro
202530
aspleucysthrgluleuasnthrserleuglnaspilegluilethr
354045
cysvaltyrcyslysthrvalleugluleuthrgluvalpheglulys
505560
aspleuphevalvaltyrargaspserileprohisalaalacyshis
65707580
lyscysileaspphetyrserargilearggluleuarghistyrser
859095
aspservaltyrglyaspthrleuglulysleuthrasnthrglyleu
100105110
tyrasnleuleuileargcysleuargcysglnlysproleuleuarg
115120125
hisleuasnglulysargargphehisasnilealaglyhistyrarg
130135140
glyglncyshissercyscysasnargalaargglngluargleugln
145150155160
argargarggluthrglnvalargglyarglysargargserhisgly
165170175
prolysalathrleuglnaspilevalleuhisleugluproglnasn
180185190
gluileprovalaspleuleuglyhisglyglnleuseraspserglu
195200205
glugluasnaspgluileaspglyvalasnhisglnhisleuproala
210215220
argargalagluproglnarghisthrmetleucysmetcyscyslys
225230235240
cysglualaargilegluleuvalvalgluserseralaaspaspleu
245250255
argalapheglnglnleupheleuasnthrleuserphevalcyspro
260265270
trpcysalaserglngln
275
<210>7
<211>3824
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有共有序列和ige前導(dǎo)序列pgx3002質(zhì)粒
<400>7
gctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttatta60
atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacata120
acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat180
aatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtgga240
gtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcc300
ccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt360
atgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgat420
gcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag480
tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttcc540
aaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtggga600
ggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcga660
aattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggt720
accgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattcgccaccatggactggacctgga780
tcctgttcctggtggccgctgccacacgggtgcacagcgccagattcgaggaccccacca840
ggagcggctacaagctgcccgatctgtgtaccgagctgaacaccagcctgcaggacatcg900
agatcacctgtgtgtactgtaagaccgtgctggagctgaccgaggtgttcgagaaggacc960
tgttcgtggtgtacagggacagcatcccccacgccgcctgccacaagtgtatcgacttct1020
acagccggatccgggagctgagacactacagcgacagcgtgtacggcgataccctggaga1080
agctgaccaacaccggcctgtacaacctgctgatccggtgcctgagatgccagaagcccc1140
tgctgagacacctgaacgagaagcggcggttccacaacatcgccggccactacagaggcc1200
agtgccacagctgctgtaacagggccaggcaggagagactgcagcggagaagagagaccc1260
aggtgaggggcaggaagagaagaagccacggccccaaggccaccctgcaggatatcgtgc1320
tgcacctggagccccagaatgagatccccgtggatctgctgggccacggccagctgtccg1380
acagcgaggaggagaacgacgagatcgacggcgtgaatcaccagcacctgcctgccagaa1440
gagccgagcctcagaggcacaccatgctgtgtatgtgctgtaagtgtgaggcccggatcg1500
aactggtggtggagagcagcgccgacgacctgagagccttccagcagctgttcctgaaca1560
ccctgagcttcgtgtgtccttggtgtgccagccagcagtgatgagcggccgctcgagtct1620
agagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatct1680
gttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctt1740
tcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg1800
ggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggg1860
gatgcggtgggctctatggcttctactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaat1920
tgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctt1980
tcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagctctgatcaagagacaggatgag2040
gatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtgg2100
agaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgt2160
tccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccc2220
tgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttcctt2280
gcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaag2340
tgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatgg2400
ctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaag2460
cgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatg2520
atctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcga2580
gcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatca2640
tggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggacc2700
gctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatggg2760
ctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttct2820
atcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaatttcctgatgcggtatt2880
ttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatcaggtggcacttttcggggaaat2940
gtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatg3000
agacaataaccctgataaatgcttcaataatagcacgtgctaaaacttcatttttaattt3060
aaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgag3120
ttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct3180
ttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtt3240
tgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcg3300
cagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactct3360
gtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggc3420
gataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcgg3480
tcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaa3540
ctgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcg3600
gacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggg3660
ggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga3720
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggccttt3780
ttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctt3824