本發(fā)明屬于有機(jī)合成領(lǐng)域，涉及一種吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物及其治療胃癌的用途。本發(fā)明通過(guò)高通量篩選及后續(xù)結(jié)構(gòu)修飾改造，發(fā)現(xiàn)了一系列以吡唑并[1,5-a]嘧啶為基本骨架，具有優(yōu)良trpc6抑制效果，同時(shí)對(duì)胃癌細(xì)胞及胃腫瘤均有良好抑制效果的化合物。

背景技術(shù)：

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新報(bào)道，胃癌的發(fā)病率居于全球惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，其死亡率更是高居第3位，僅次于肺癌與肝癌。中國(guó)每年胃癌新發(fā)病例占世界新發(fā)病例40％以上，相比歐美地區(qū)較低的胃癌發(fā)病率及日韓地區(qū)較高的早期胃癌診斷率，我國(guó)面臨著十分嚴(yán)峻的抗擊胃癌形勢(shì)。在我國(guó)，超過(guò)80％的新發(fā)病例一經(jīng)診斷已達(dá)進(jìn)展期，而我國(guó)各地胃癌診療水平參差不齊，難以達(dá)到統(tǒng)一的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)治療，因此，如何提高進(jìn)展期胃癌治療的療效并保證治療的安全性將是未來(lái)相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)面臨的艱巨任務(wù)。

近年來(lái)，盡管外科手術(shù)放化療介入治療、生物治療等多學(xué)科治療方法在胃癌的綜合性治療中有了長(zhǎng)足的發(fā)展，但藥物治療方案仍是大多數(shù)胃癌患者，尤其是晚期患者的主要治療方案。胃癌藥物治療的目的是緩解癥狀、控制腫瘤生長(zhǎng)、提高生活質(zhì)量和延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，目前新輔助化療、多藥聯(lián)合化療以及姑息性化療等構(gòu)成了胃癌藥物治療的主要治療手段。特別是晚期胃癌的治療并沒(méi)有重大進(jìn)展。大部分對(duì)化療的反應(yīng)仍是部分和短期緩解，中位生存期也只有7-9個(gè)月，2年生存者不到10％?？傮w效果仍然很差。胃癌治療亟需有新的療效更好的治療藥物。

腫瘤細(xì)胞的一個(gè)特性就是不可控制的增殖。除了大量分泌細(xì)胞分裂原之外，腫瘤細(xì)胞還可以改變細(xì)胞膜受體和離子通道的功能表達(dá)，接受外來(lái)信號(hào)，從而對(duì)細(xì)胞分裂原超敏。鈣離子內(nèi)流是這個(gè)過(guò)程中必須的。細(xì)胞分裂原誘導(dǎo)鈣內(nèi)流，而鈣內(nèi)流的減少可使細(xì)胞生長(zhǎng)終止。鈣離子與trp通道有著重要的聯(lián)系。大量研究報(bào)道表明，胃癌的發(fā)生發(fā)展與離子通道密切相關(guān)。

瞬時(shí)受體電位(transientreceptorpotential,trp)通道發(fā)現(xiàn)于果蠅的一種突變體中，當(dāng)給予光刺激后，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子會(huì)瞬時(shí)升高。trp通道廣泛存在于細(xì)胞膜上，是一種非選擇性的陽(yáng)離子通道蛋白，具有調(diào)節(jié)感覺(jué)傳導(dǎo)、參與細(xì)胞信號(hào)傳遞及調(diào)節(jié)發(fā)育等重要作用，是目前離子通道領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。trp通道蛋白廣泛表達(dá)于多種生物、組織及細(xì)胞中。包括7個(gè)相互關(guān)聯(lián)的亞家族：trpc、trpv、trpm、trpn、trpa、trpp和trpml，trp作為一種細(xì)胞內(nèi)外的分子傳感器。哺乳動(dòng)物trp通道的激活，除了各種內(nèi)源性和外源性化學(xué)配體外，trp通道可以調(diào)節(jié)各種各樣的刺激，如機(jī)械力(滲透壓力、體積、伸展、和振動(dòng))、溫度、ph值、膜電位、細(xì)胞的氧化還原、能量狀態(tài)和二價(jià)陽(yáng)離子。trp通道可能是由相同的或不同的亞基四聚體組成，每個(gè)亞基由六個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)的n-和c-末端組成。并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們?cè)谫|(zhì)膜和細(xì)胞器膜上有表達(dá)。

作為一種傳統(tǒng)型的trp通道，trpc是第一個(gè)被研究分離出的trp通道蛋白。相對(duì)于其他通道來(lái)說(shuō)，trpc通道與trp通道最相似，即為最初發(fā)現(xiàn)的果蠅突變體的trp蛋白，包括7個(gè)亞型，trpc(1-7)，其中trpc3和trpc6其氨基酸一致程度高達(dá)70％-80％，在結(jié)構(gòu)、功能上都非常接近，在藥理學(xué)性質(zhì)和信號(hào)調(diào)節(jié)功能方面也比較相似，是trpc亞家族中非常具有代表性的一個(gè)亞型，也是目前研究中頗受關(guān)注的2個(gè)亞型。

trpc6是一種非選擇性的鈣離子可通過(guò)的陽(yáng)離子通道，它是選擇性最強(qiáng)的通道蛋白。trpc6定位于染色體11q212q22，共132287個(gè)堿基(基因庫(kù)：nc000011)，含13個(gè)外顯子。trpc6的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna含4564個(gè)堿基，其中5’未翻譯區(qū)是第1-427位，編碼區(qū)為第428-3223位，3’未翻譯區(qū)是第3224-4564位(基因庫(kù)：nm004621)。trpc6可特異性的被磷脂酶c(plc)激活，通過(guò)g-蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路使配體與膜受體結(jié)合，激活磷脂酶c生成1,4,5-三磷酸肌醇，后者與受體結(jié)合促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放ca²⁺。鈣離子在機(jī)體內(nèi)保持穩(wěn)態(tài)，對(duì)維持機(jī)體功能有重要作用。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加主要來(lái)源于細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣源的的釋放。鈣的內(nèi)流和釋放被細(xì)胞的各種調(diào)控系統(tǒng)精密控制。細(xì)胞內(nèi)游離ca²⁺升高，激活一些蛋白磷酸酶，使底物蛋白磷酸化，將外界信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，進(jìn)入核內(nèi)，影響dna復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞惡變及腫瘤細(xì)胞的增殖分化。細(xì)胞內(nèi)ca²⁺直接參與調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)，侵襲，轉(zhuǎn)移和分化。所以，trpc6抑制劑有望成為治療癌癥的新藥物。

自發(fā)現(xiàn)trpc6通道以來(lái)，有大量研究報(bào)導(dǎo)了trpc6與腫瘤的關(guān)系。結(jié)果證明，trpc6與胃癌、肝癌、食管癌、膠質(zhì)瘤等這些發(fā)病率和致死率都很高的疾病有著重要的聯(lián)系。不過(guò)關(guān)于trpc6抑制劑的報(bào)道寥寥無(wú)幾。最早關(guān)于trpc6的抑制劑是王以政等發(fā)現(xiàn)的化合物skf96365為代表。該化合物對(duì)胃癌細(xì)胞mkn45和ags都有較好的抑制作用，該化合物能將細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在g2/m期，對(duì)接種胃癌的裸鼠也有一定的療效，但是起效慢，周期長(zhǎng)，需要連續(xù)給藥7周才能看出效果。davidg.w.在2013年報(bào)道了trpc3和trpc6的抑制劑，他們合成的化合物對(duì)htrpc3和htrpc6的ic50值可以達(dá)到納摩爾級(jí)別，但是在體內(nèi)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)該系列藥物口服利用度很低，體內(nèi)清除率過(guò)高，雖然經(jīng)過(guò)一系列的結(jié)構(gòu)改造，但是仍然無(wú)法找到活性和口服利用率均處于較好的水平的一種結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物。本發(fā)明還提供上述化合物的細(xì)胞水平及靶點(diǎn)水平的活性篩選結(jié)果及其抗腫瘤應(yīng)用。

本發(fā)明涉及的一種吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物，具有通式1所示的結(jié)構(gòu)：

其中，

r1為氫、烷基、芳基；

r2為氫、烷基、芳基；

r3為烷基、芳基、烷胺基、芳胺基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基；

r4為氫、鹵素、硝基、氨基或者氨基的衍生基團(tuán)，所述氨基的衍生基團(tuán)如烷胺基、芳胺基、酰胺基、磺胺基、烯胺基等；

r5為羥基、氯；

x1為碳或者氮；

x2為碳或者氮；

所述烷基為鏈狀、環(huán)狀或者籠狀烷基，如甲基、烯丙基、氯乙基、正壬基、異丁基、叔丁基、環(huán)己基、環(huán)庚基、金剛烷基等；

所述芳基為苯基、烷基取代的苯基、雜環(huán)芳基、烷基取代的雜環(huán)芳基；

所述烷氨基為鏈狀、環(huán)狀或者籠狀烷基取代的氨基；

所述芳氨基為芳基取代的氨基如苯胺、芐胺等；

所述烷氧基為鏈狀、環(huán)狀或者籠狀烷基取代的含氧基；

所述芳氧基為芳基取代的含基如苯氧、芐氧等；

所述烷硫基為鏈狀、環(huán)狀或者籠狀烷基取代的含硫基；

所述芳硫基為苯硫、芐硫等；

所述的鹵素為氟、氯、溴、碘。

本發(fā)明提供通式1所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽酸鹽。

本發(fā)明中所采用的述語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”是指在可靠的醫(yī)藥評(píng)價(jià)范圍內(nèi)，化合物的鹽類適于與人或較低等動(dòng)物的組織相接觸而無(wú)不適當(dāng)?shù)亩拘浴⒋碳ぜ斑^(guò)敏反應(yīng)等，具有相當(dāng)合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比例，通常是水或油的或可分散的，并可有效的用于其預(yù)期的用途。包括藥學(xué)上可接受的酸加成鹽和藥學(xué)上可接受的堿加成鹽，在這里是可用的并與通式1化合物的化學(xué)性質(zhì)相容的。

有效量的通式1的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽酸鹽的用途，用于治療胃癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌或結(jié)腸癌等疾病或病癥；本發(fā)明通式1的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽酸鹽的用途，用于制備腫瘤抑制劑，優(yōu)選用于制備trpc6抑制劑的用途。

本發(fā)明還提供通式1所示的吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物的制備方法。

本發(fā)明還提供對(duì)所述化合物的細(xì)胞水平的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞水平包括對(duì)trpc6通道的抑制實(shí)驗(yàn)和對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性。

實(shí)驗(yàn)表明，相比上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的化合物具有如下技術(shù)效果。

1)結(jié)構(gòu)新穎，合成簡(jiǎn)潔；

2)對(duì)trpc6通道的抑制效果優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)；

3)對(duì)胃癌細(xì)胞具有很好的體外抗增殖作用。

具體實(shí)施方式

下述中阿拉伯?dāng)?shù)字1-13均指代具體化合物，

其中，化合物1為

化合物2為

化合物3為

化合物4為

化合物5為

化合物6為

化合物7為

化合物8為

化合物9為

化合物10為

化合物11為

化合物12為

化合物13為

并且，r1、r2、r3、r4、r5、x1、x2與發(fā)明內(nèi)容中所述指代相同。

本發(fā)明中涉及到的具體化合物8-1，9-2，9-3，12-1，13-2，13-3為通式1所示的結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)式如下表所示：

借助高通量篩選，經(jīng)過(guò)一系列的優(yōu)化改造，我們發(fā)現(xiàn)吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物這類化合物是優(yōu)良的trpc6抑制劑，通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)得出，尤其是化合物13-2能有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖，是潛在的治療胃癌的藥物。

具體實(shí)施方式按照如下制備方法操作。

(1)當(dāng)r1＝r2＝h時(shí)，按如下路線制備：

1)化合物4的制備：將化合物1，2溶于少量二氯甲烷，在100℃下回流反應(yīng)8－24小時(shí)后，冷卻到室溫，再將此反應(yīng)液加入到溶于50％etoh的鹽酸肼溶液中，80℃回流過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用飽和nahco3溶液堿化，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋干，用石油醚和乙酸乙酯重結(jié)晶，得白色至淺黃色固體，即化合物4。

2)將化合物4與化合物5溶于無(wú)水乙酸，加熱回流，反應(yīng)8-24小時(shí)后結(jié)束。冷卻至室溫，旋干溶劑，加入去離子水，并用1mnaoh溶液調(diào)至ph為8，再用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋干，過(guò)硅膠柱，分離得到化合物6。

3)將化合物6用少量乙醇溶解，向其中滴加0.5m-5m的koh溶液，50-100℃反應(yīng)8-40小時(shí)后結(jié)束，冷卻至室溫，用去離子水淬滅，二氯甲烷萃取，分出水相，水相用1mhcl調(diào)節(jié)ph為3，過(guò)濾出白色沉淀，殘?jiān)盟?，烘干，即為化合?。

4)將化合物7與不同的胺或醇或其它能與羧基反應(yīng)的小分子化合物進(jìn)行縮合即得到化合物8。

5)將化合物8溶于三氯氧磷，在封管中于100℃條件下反應(yīng)，10-20小時(shí)后，停止加熱，將反應(yīng)液倒入冰水混合物中，過(guò)濾，殘?jiān)盟?，烘干，即可得化合?。

(2)當(dāng)r1，r2至少有一個(gè)不為h時(shí)，按如下路線制備：

1)化合物4的制備：將化合物1，2溶于少量二氯甲烷，在100℃下回流反應(yīng)8－24小時(shí)后，冷卻到室溫，再將此反應(yīng)液加入到溶于50％etoh的鹽酸肼溶液中，80℃回流過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用飽和nahco3堿化，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋干，用石油醚和乙酸乙酯重結(jié)晶得白色至淺黃色固體，即化合物4。

2)將化合物4與化合物5溶于無(wú)水乙酸，加熱回流，反應(yīng)8-24小時(shí)后結(jié)束。冷卻至室溫，旋干溶劑。加入去離子水，并用1mnaoh溶液調(diào)至ph為8，乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，飽和食鹽水洗，過(guò)濾，旋干，過(guò)硅膠柱，分離得到化合物6。

3)將化合物6溶于dmf，0℃下加入nah,半小時(shí)后加入鹵代烷，使自然恢復(fù)到室溫，反應(yīng)8-20小時(shí)后結(jié)束，在冰浴條件下加入去離子水淬滅，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋干，過(guò)硅膠柱，分離得到化合物10。

4)將化合物10用少量乙醇溶解，向其中滴加0.5m-5m的koh溶液，50-100℃反應(yīng)8-40小時(shí)后結(jié)束，冷卻至室溫，用去離子水淬滅，二氯甲烷萃取，分出水相，水相用1mhcl調(diào)節(jié)ph為3,過(guò)濾出白色固體，即為化合物11。

5)將化合物11與不同的胺或者醇或者其它能與羧基反應(yīng)的小分子化合物進(jìn)行縮合即得化合物12。

6)將化合物12溶于三氯氧磷，在封管中于100℃條件下反應(yīng)，10-20小時(shí)后，停止加熱，將反應(yīng)液倒入冰水混合物中，過(guò)濾，殘?jiān)盟矗娓?，即可得鹽酸鹽13。

通過(guò)下述實(shí)施例有助于理解本發(fā)明，但是不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。

實(shí)施例1

化合物8-1的制備：r1＝r2＝h，r4＝f，r5＝oh，x1＝x2＝ch。

(1)化合物4的制備：將化合物1(43.2ml)，2(43.8ml)溶于二氯甲烷(20ml)后在100℃下回流反應(yīng)24小時(shí)，冷卻到室溫后，再將此反應(yīng)液加入到溶于50％etoh(100ml)的鹽酸肼溶液中，80℃回流過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用飽和nahco3堿化，乙酸乙酯(3*150ml)萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋干，用石油醚和乙酸乙酯重結(jié)晶得白色固體，即化合物4(44.6g,82％)

(2)將化合物4(45.8g)與化合物5(36.4ml)溶于無(wú)水乙酸(300ml)，加熱回流，反應(yīng)24小時(shí)后結(jié)束。冷卻至室溫，旋干溶劑。加入去離子水(300ml)，并用1mnaoh溶液調(diào)至ph8，乙酸乙酯(3*200ml)萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋干，過(guò)硅膠柱，分離得到化合物6(60.5g,90％)。

(3)將化合物6(33.0g)用乙醇(200ml)溶解，向其中滴加1m的koh溶液(120ml)，70℃反應(yīng)15小時(shí)后結(jié)束，冷卻至室溫，用去離子水(400ml)淬滅，二氯甲烷(3*100ml)萃取，分出水相，水相用1mhcl調(diào)節(jié)ph3,過(guò)濾出白色固體，殘?jiān)盟?，真空干燥箱干燥，得化合?(26.7g,89％)。

(4)將化合物7(900mg),1-叔丁氧羰基哌嗪(727mg)溶于二氯甲烷(5ml),加入dmap(440mg),edci(750mg),室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，加入去離子水5毫升淬滅，二氯甲烷(3*5ml)萃取，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋干，過(guò)硅膠柱，用dcm:meoh＝100:1作洗脫劑，分離得黃色固體8-1(1.16g,82％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.26(s,2h),7.02(d,j＝4.1hz,2h),5.60(s,1h),3.78(s,1h),3.48(dd,j＝52.0,27.9hz,4h),2.30(d,j＝3.9hz,2h),1.46(d,j＝6.3hz,5h).¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ167.0,160.5,157.0,154.4,151.4,146.8,138.4,130.3(s,0h),130.2,103.2,97.0,80.7,45.8,41.8,34.7,28.4,13.0.

實(shí)施例2

化合物12-1的制備：r1＝r2＝-et，r4＝cf3，r5＝cl，x1＝x2＝ch。

(1)化合物4的制備：將化合物1(43.2ml)，2(43.8ml)溶于二氯甲烷(20ml)后在100℃下回流反應(yīng)24小時(shí)，冷卻到室溫后，再將此反應(yīng)液加入到溶于50％etoh(100ml)的鹽酸肼溶液中，80℃回流過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用飽和nahco3堿化，乙酸乙酯(3*150ml)萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋干，用石油醚和乙酸乙酯重結(jié)晶得白色固體，即化合物4(44.6g,82％)

(2)將化合物4(21.8g)與化合物5(18.2ml)溶于無(wú)水乙酸(150ml)，加熱回流，反應(yīng)20小時(shí)后結(jié)束。冷卻至室溫，旋干溶劑。加入去離子水(150ml)，并用1mnaoh溶液調(diào)至ph8，乙酸乙酯(3*150ml)萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋干，過(guò)硅膠柱，分離得到化合物6(34.5g,91％)。

(3)將化合物6(23.7g)溶于thf(250ml),冰浴條件下分批加入70％nah(8.65g),在該溫度下攪拌30分鐘后，緩慢加入碘乙烷(17.5ml),使自然恢復(fù)到室溫，15小時(shí)后反應(yīng)結(jié)束，在冰浴條件下加入去離子水淬滅，旋干thf,乙酸乙酯(3*500ml)萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋干，過(guò)硅膠柱，分離得化合物10(17.6g,81％)。

(4)將化合物10(14.5g)用乙醇(70ml)溶解，向其中滴加1m的koh溶液(40ml)，90℃反應(yīng)15小時(shí)后結(jié)束，冷卻至室溫，用去離子水(150ml)淬滅，二氯甲烷(3*100ml)萃取，分出水相，水相用1mhcl調(diào)節(jié)ph＝3,過(guò)濾出白色固體，殘?jiān)盟矗婵崭稍锵涓稍?，得化合?1(11.95g,88％)。

(5)將化合物11(1.22g),1-叔丁氧羰基哌嗪(727mg)溶于二氯甲烷(5ml),加入dmap(440mg),edci(750mg),室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，加入去離子水5毫升淬滅，二氯甲烷(3*5ml)萃取，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋干，過(guò)硅膠柱，用dcm:meoh＝100:1作洗脫劑，分離得化合物12(1.31g,78％)。

(6)將化合物12(541mg)溶于三氯氧磷(2ml),用封管在100℃下過(guò)夜反應(yīng)，冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入冰水混合液中，用nahco3溶液調(diào)ph8，二氯甲烷(3*15ml)萃取,飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋干，乙酸乙酯重結(jié)晶，得黃色鹽酸鹽12-1(531mg,95％)。¹hnmr(400mhz,d6-dmso)δ11.83(s,1h),7.45(dd,j＝8.5,5.6hz,2h),7.34(t,j＝8.9hz,2h),4.68(s,1h),4.59(s,1h),3.95(d,j＝16.3hz,1h),3.81(d,j＝16.5hz,1h),2.82(d,j＝13.8hz,1h),2.58(d,j＝12.7hz,2h),2.51-2.55(q,4h),2.34(s,1h),2.30(s,1h),2.28(s,3h),2.08(d,j＝9.2hz,1h),1.98(d,j＝10.1hz,1h),1.73(dd,j＝15.9,6.5hz,1h),1.66–1.53(m,1h),1.24(s,2h)，0.98(t,j＝12hz,6h).¹³cnmr(101mhz,d6-dmso)δ182.7,177.7,148.4,142.8,138.1,135.7,128.5,127.6,135.4–124.4(m,6h),102.1(s,2h),99.3(s,2h),54.8(s,2h),48.4(s,1h),37.9(s,2h),35.4(s,7h),32.5(s,5h),31.5(s,3h),30.1(s,3h),14.9(s,1h),8.3(s,2h).

實(shí)施例3

化合物13-2的制備：r1＝r2＝-me，r4＝f，r5＝cl，x1＝x2＝ch。

(1)將化合物1(43.2ml)，2(45.2ml)溶于二氯甲烷(20ml)后在100℃下回流反應(yīng)24小時(shí)，冷卻到室溫后，再將此反應(yīng)液加入到溶于50％etoh(100ml)的鹽酸肼溶液中，80℃回流過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用飽和nahco3堿化，乙酸乙酯(3*150ml)萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾旋干，用石油醚和乙酸乙酯重結(jié)晶得白色固體，即化合物4(37.6g,85％)

(2)將化合物4(17.7g)與化合物5(18.2ml)溶于無(wú)水乙酸(150ml)，加熱回流，反應(yīng)20小時(shí)后結(jié)束。冷卻至室溫，旋干溶劑。加入去離子水(150ml)，并用1mnaoh溶液調(diào)至ph8，乙酸乙酯(3*150ml)萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋干，過(guò)硅膠柱，分離得到化合物6(29.3g,88％)。

(3)將化合物6(20.8g)溶于thf(250ml),冰浴條件下分批加入70％nah(8.65g),在該溫度下攪拌30分鐘后，緩慢加入碘乙烷(17.5ml),使自然恢復(fù)到室溫，15小時(shí)后反應(yīng)結(jié)束，在冰浴條件下加入去離子水淬滅，旋干thf,乙酸乙酯(3*500ml)萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋干，過(guò)硅膠柱，分離得化合物10(17.6g,81％)。

(4)將化合物10(12.1g)用乙醇(70ml)溶解，向其中滴加1m的koh溶液(40ml)，90℃反應(yīng)15小時(shí)后結(jié)束，冷卻至室溫，用去離子水(150ml)淬滅，二氯甲烷(3*100ml)萃取，分出水相，水相用1mhcl調(diào)節(jié)ph＝3,過(guò)濾出白色固體，殘?jiān)盟?，真空干燥箱干燥，得化合?1(10.4g,93％)。

(5)將化合物11(1.0g),1-叔丁氧羰基哌嗪(727mg)溶于二氯甲烷(5ml),加入dmap(440mg),edci(750mg),室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，加入去離子水5毫升淬滅，二氯甲烷(3*5ml)萃取，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋干，過(guò)硅膠柱，用dcm:meoh＝100:1作洗脫劑，分離得化合物12(1.04g,72％)。

(6)將化合物12(467mg)溶于三氯氧磷(2ml),用封管在100℃下過(guò)夜反應(yīng)，冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入冰水混合液中，用nahco3溶液調(diào)ph為8，二氯甲烷(3*15ml)萃取,飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋干，乙酸乙酯重結(jié)晶，得黃色鹽酸鹽13-2(438mg,90％)。¹hnmr(500mhz,d6-dmso)δ7.55–7.50(m,2h),7.24–7.19(m,2h),7.16–7.11(m,2h),4.06(dt,j＝8.6,6.0hz,1h),3.17-3.10(m,1h),1.99–1.89(m,4h),1.84(dt,j＝13.0,7.0hz,4h),1.78–1.68(m,6h),1.45(s,3h),1.44(s,3h),1.42(s,6h).

實(shí)施例4

化合物對(duì)trpc6通道的抑制實(shí)驗(yàn)

用激動(dòng)劑m085激活trpc6通道后，加入不同的吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物，結(jié)果表明，該類化合物能有效抑制trpc6離子通道。

具體實(shí)施方式如下：永久轉(zhuǎn)染m5毒蕈堿受體和trpc6離子通道的hek293細(xì)胞中，應(yīng)用激動(dòng)劑激活通道并檢測(cè)熒光膜電位。細(xì)胞用0μm、10μm、30μm的被測(cè)試樣品處理3分鐘后，加入10μm的激動(dòng)劑m085，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)表示膜電位去極化增加，熒光強(qiáng)度減弱表示膜電位去極化降低?；衔?-1，9-2，9-3，12-1，13-2，13-3全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1：化合物對(duì)trpc6通道的抑制實(shí)驗(yàn)

結(jié)果表明，化合物8-1，9-2，9-3，12-1，13-2，13-3對(duì)trpc6通道的抑制效果均在10μm以下，特別是化合物13-2對(duì)trpc6通道的ic50值達(dá)1.8μm。意味著這類化合物均能明顯抑制trpc6通道的活性。

實(shí)施例5

化合物對(duì)胃癌細(xì)胞mkn45和ags抑制實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明采用mtt法來(lái)研究化合物對(duì)胃癌細(xì)胞mkn45和ags的抑制作用。將mkn45/ags細(xì)胞種植在96孔板上，密度為4×10³/ml，在37度，5％co2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。24h后細(xì)胞加入不同濃度的被測(cè)試化合物進(jìn)行處理，化合物使用rpmi-1640完全培養(yǎng)基稀釋0.01m的儲(chǔ)備液進(jìn)行配置，以含0.1％dmso的rpmi-1640完全培養(yǎng)基溶液為對(duì)照。每種化合物每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，每孔加入帶化合物培養(yǎng)基體積為100μl。加完后于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)72h。每孔加入10％的濃度為5mg/ml的mtt溶液。37℃靜置孵育4h，棄去含mtt的培養(yǎng)基，每孔加入150μldmso溶解沉淀，使紫色結(jié)晶完全溶解，于570nm處測(cè)定吸光度值a，根據(jù)各孔o(hù)d值計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組od/對(duì)照組od×100％。

化合物8-1，9-2，9-3，12-1，13-2，13-3對(duì)mkn45和ags抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表2所示。

表2化合物對(duì)ags和mkn45的抑制效果

結(jié)果表明濃度為5μm時(shí)，化合物9-2，13-2，13-3對(duì)ags細(xì)胞的抑制效果達(dá)50％左右；濃度為20μm時(shí)化合物9-2，9-3，13-2，13-3對(duì)ags細(xì)胞的抑制率達(dá)60％-85％，對(duì)mkn45細(xì)胞的抑制率達(dá)58％-70％。