本發(fā)明涉及一種通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的配方及方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：多肽及蛋白質(zhì)類物質(zhì)在診斷、治療或作為疫苗預(yù)防各種疾病方面發(fā)揮著重要作用。蛋白質(zhì)藥物具有高活性、特異性強(qiáng)、低毒性、生物功能明確、有利于臨床應(yīng)用的特點(diǎn)。由于其成本低、成功率高、安全可靠，蛋白質(zhì)藥物已成為醫(yī)藥產(chǎn)品中的重要組成部分。目前生產(chǎn)蛋白類藥物主要有化學(xué)合成法、生物技術(shù)生產(chǎn)法、生物活性多肽改性、多肽天然產(chǎn)物研發(fā)。但這幾類方法通常通量低、耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜。而目前，高通量、快速高效研究已經(jīng)成為蛋白質(zhì)功能研究的趨勢(shì)，傳統(tǒng)方式已無法滿足研究要求，這就需要我們探索一種高效合成蛋白質(zhì)的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的配方。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：一種通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的配方，包括：用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物；用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物；用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒；濃度為10-300mg/ml大分子擁擠試劑水溶液；所述大分子擁擠試劑為葡聚糖、聚蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、牛血清白蛋白或血紅蛋白。所述用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒和大分子擁擠試劑水溶液的體積比為(10-20):(15-35):1:(0.5-10)。用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物包括比例為1g:0.01～0.1ml:1～3ml的細(xì)胞破碎產(chǎn)物、緩沖溶液1和緩沖溶液2；所述緩沖溶液1為：5-20mmol/l三羥甲基氨基甲烷，30-100mmol/l谷氨酸鉀，10-20mmol/l谷氨酸鎂，0.5-2mmol/l二硫蘇糖醇，5-10mmol/l2-巰基乙醇；溶劑是去離子水；所述緩沖溶液2為：5-20mmol/l三羥甲基氨基甲烷，30-100mmol/l谷氨酸鉀，10-20mmol/l谷氨酸鎂，0.5-2mmol/l二硫蘇糖醇；溶劑是去離子水；所述細(xì)胞為真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物由按體積比為(2-8):(20-30):(2-5):1的氨基酸混合液、反應(yīng)緩沖液、能量補(bǔ)充液和濃度為5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液組成：所述氨基酸混合液，溶劑為去離子水；每種氨基酸的濃度均為5-20mmol/l的等摩爾濃度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；所述反應(yīng)緩沖液包括：40-60mmol/l4-羥乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/l谷氨酸鉀、10-25mmol/l谷氨酸鎂、10-40mmol/l3-磷酸甘油酸、5-10mmol/l環(huán)磷酸腺苷、2.0-4.0mmol/l煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.0-4.0mmol/l輔酶a、0.4-0.8mmol/l亞葉酸、1.0-5.0mg/ml轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸、0.4-0.8mmol/l亞精胺；溶劑是去離子水；所述能量補(bǔ)充液包括：1.0-3.0mmol/l三磷酸尿苷，1.0-3.0mmol/l三磷酸胞苷，1.0-3.0mmol/l三磷酸腺苷，3.0-9.0mmol/l三磷酸鳥苷，溶劑是去離子水。葡聚糖、聚蔗糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮的重均分子質(zhì)量范圍為8000--400000。一種通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：將用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒和濃度為10-300mg/ml大分子擁擠試劑水溶液混合，置于恒溫反應(yīng)容器中，在25-37℃放置10min-48h。用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒和大分子擁擠試劑水溶液的體積比為(10-20):(15-35):1:(0.5-10)。用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物包括比例為1g:0.01～0.1ml:1～3ml的細(xì)胞破碎產(chǎn)物、緩沖溶液1和緩沖溶液2；所述緩沖溶液1為：5-20mmol/l三羥甲基氨基甲烷，30-100mmol/l谷氨酸鉀，10-20mmol/l谷氨酸鎂，0.5-2mmol/l二硫蘇糖醇，5-10mmol/l2-巰基乙醇；溶劑是去離子水；所述緩沖溶液2為：5-20mmol/l三羥甲基氨基甲烷，30-100mmol/l谷氨酸鉀，10-20mmol/l谷氨酸鎂，0.5-2mmol/l二硫蘇糖醇；溶劑是去離子水；所述細(xì)胞為真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。所述用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物由按體積比為(2-8):(20-30):(2-5):1的氨基酸混合液、反應(yīng)緩沖液、能量補(bǔ)充液和濃度為5-150μg/ml的核糖核酸聚合酶水溶液組成：所述氨基酸混合液，溶劑為去離子水；每種氨基酸的濃度均為5-20mmol/l的等摩爾濃度，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸；所述反應(yīng)緩沖液包括：40-60mmol/l4-羥乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/l谷氨酸鉀、10-25mmol/l谷氨酸鎂、10-40mmol/l3-磷酸甘油酸、5-10mmol/l環(huán)磷酸腺苷、2.0-4.0mmol/l煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、1.0-4.0mmol/l輔酶a、0.4-0.8mmol/l亞葉酸、1.0-5.0mg/ml轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸、0.4-0.8mmol/l亞精胺；溶劑是去離子水；所述能量補(bǔ)充液包括：1.0-3.0mmol/l三磷酸尿苷，1.0-3.0mmol/l三磷酸胞苷，1.0-3.0mmol/l三磷酸腺苷，3.0-9.0mmol/l三磷酸鳥苷，溶劑是去離子水。葡聚糖、聚蔗糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮的重均分子質(zhì)量范圍為8000-400000。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的方法能夠提高體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)量，并滿足蛋白類藥物研發(fā)高通量、快速篩選的要求。附圖說明圖1是用本發(fā)明的通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的配方生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)量檢測(cè)圖。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。下面的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對(duì)本發(fā)明作任何限制。緩沖溶液1的組成見表1的實(shí)施例1-3表1實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3三羥甲基氨基甲烷5mmol/l10mmol/l20mmol/l谷氨酸鉀30mmol/l60mmol/l100mmol/l谷氨酸鎂10mmol/l14mmol/l20mmol/l二硫蘇糖醇0.5mmol/l1mmol/l2mmol/l2-巰基乙醇5mmol/l7mmol/l10mmol/l溶劑是去離子水補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l緩沖溶液2的組成見表2的實(shí)施例4-6表2實(shí)施例4實(shí)施例5實(shí)施例6三羥甲基氨基甲烷5mmol/l10mmol/l20mmol/l谷氨酸鉀30mmol/l60mmol/l100mmol/l谷氨酸鎂10mmol/l14mmol/l20mmol/l二硫蘇糖醇0.5mmol/l1mmol/l2mmol/l溶劑是去離子水補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l實(shí)施例7細(xì)胞破碎產(chǎn)物的制備：將培養(yǎng)后的麥胚細(xì)胞(真核細(xì)胞)收集、懸浮、離心、用機(jī)械法破碎、保存。用實(shí)施例7的方法，制備粉紋夜蛾、草地夜蛾、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞的細(xì)胞破碎產(chǎn)物。用實(shí)施例7的方法，制備原核細(xì)胞大腸桿菌或枯草芽孢桿菌的細(xì)胞破碎產(chǎn)物。細(xì)胞破碎的方法除機(jī)械法外，還可以采用反復(fù)凍融法、超聲處理法、酶解法、堿裂解法或化學(xué)滲透法。用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物的配方見表3實(shí)施例8-10表3細(xì)胞來源：麥胚：http://www.000860.com/sxkg/粉紋夜蛾qb-tn9-4s-cl-b：http://www.biovector.net/product/336508.html大腸桿菌bl21(de3)cicc23796：http://sales.china-cicc.org/category.php？id＝1&sh＝j(luò)d&keywords＝23796氨基酸混合液見表4實(shí)施例11-13表4反應(yīng)緩沖液見表5實(shí)施例14-16表5能量補(bǔ)充液見表6實(shí)施例17-19表6實(shí)施例17實(shí)施例18實(shí)施例19三磷酸尿苷1mmol/l2mmol/l3mmol/l三磷酸胞苷1mmol/l2mmol/l3mmol/l三磷酸腺苷1mmol/l2mmol/l3mmol/l三磷酸鳥苷3mmol/l6mmol/l9mmol/l去離子水補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l補(bǔ)足至1l用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物見表7實(shí)施例20-22(體積比，單位為ml)表7基因質(zhì)?？梢再?gòu)買或通過基因改造獲得。prset-cfp(購(gòu)于：promegacorporation)prset-yfp(購(gòu)于：promegacorporation)prset-egfp(購(gòu)于：promegacorporation)上述質(zhì)粒的舉例是為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對(duì)其進(jìn)行限定，其它質(zhì)粒也可以用于本發(fā)明。實(shí)施例23通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的配方，包括：體積比為10：15：1：0.5的用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物(實(shí)施例8制備)；用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物(實(shí)施例20制備)；用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒prset-cfp；濃度為10mg/ml大分子擁擠試劑(重均分子質(zhì)量為8000的聚乙二醇)水溶液；通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：將上述用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒和大分子擁擠試劑水溶液混合，置于恒溫反應(yīng)容器中，在37℃放置10min。蛋白質(zhì)產(chǎn)量見圖1。實(shí)施例24通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的配方，包括：體積比為20：35：1：5的用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物(實(shí)施例9制備)；用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物(實(shí)施例21制備)；用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒prset-yfp；濃度為300mg/ml大分子擁擠試劑(重均分子質(zhì)量為400000的聚蔗糖)水溶液；通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：將上述用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒和大分子擁擠試劑水溶液混合，置于恒溫反應(yīng)容器中，在25℃放置48h。蛋白質(zhì)產(chǎn)量見圖1。用重均分子質(zhì)量為400000的葡聚糖或重均分子質(zhì)量為400000的聚乙烯吡咯烷酮替代本實(shí)施例的重均分子質(zhì)量為400000的聚蔗糖，，其它同本實(shí)施例，可以高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)。實(shí)施例25通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的配方，包括：體積比為15：25：1：10的用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物(實(shí)施例10制備)；用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物(實(shí)施例22制備)；用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒prset-egfp；濃度為300mg/ml大分子擁擠試劑(牛血清白蛋白)水溶液；通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：將上述用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒和大分子擁擠試劑水溶液混合，置于恒溫反應(yīng)容器中，在37℃放置10h。蛋白質(zhì)產(chǎn)量見圖1。實(shí)施例26通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的配方，包括：體積比為15：25：1：10的用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物(實(shí)施例10制備)；用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物(實(shí)施例22制備)；用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒prset-egfp；作為大分子擁擠試劑的生物試劑(血紅蛋白)水溶液10mg/ml。通過添加大分子擁擠試劑高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：將上述用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒和大分子擁擠試劑水溶液混合，置于恒溫反應(yīng)容器中，在37℃放置5h。蛋白質(zhì)產(chǎn)量見圖1。用甘油替代本實(shí)施例的血紅蛋白，其它同本實(shí)施例，可以高效體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)。對(duì)照例體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的配方，包括：體積比為10：15：1用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物(實(shí)施例8制備)；用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物(實(shí)施例20制備)；用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)粒prset-cfp；體外生物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟：將上述用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的外加反應(yīng)物、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的基因質(zhì)?；旌?，置于恒溫反應(yīng)容器中，在37℃放置10min。蛋白質(zhì)產(chǎn)量見圖1。當(dāng)前第1頁(yè)12