本發(fā)明屬于抗體制備的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

據(jù)2016年全球癌癥統(tǒng)計(jì)，全球全年約有1.5千萬癌癥新發(fā)病例，820萬患者死于癌癥；其中，57％癌癥患者以及65％癌癥死亡患者來自于發(fā)展中國家。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是個(gè)十分復(fù)雜的過程，t細(xì)胞在機(jī)體的抗腫瘤免疫系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用。為了逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，腫瘤細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中通過各種機(jī)制上調(diào)程序性細(xì)胞死亡配體1(programmedcelldeathlagand1，pd-l1，也稱為b7-h1)的表達(dá)，pd-l1與t細(xì)胞表面的負(fù)性免疫檢查點(diǎn)-程序性細(xì)胞死亡受體1(pd-1，也稱為cd279)結(jié)合，t細(xì)胞功能被抑制，不能向免疫系統(tǒng)發(fā)出攻擊腫瘤的信號(hào)。pd-1/pd-l1抑制劑可以阻斷pd-1與pd-l1的結(jié)合，阻斷負(fù)向調(diào)控信號(hào)，使t細(xì)胞恢復(fù)活性，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答。

pd-l1選擇性地高表達(dá)于腫瘤組織。pd-l1是一個(gè)由290個(gè)氨基酸組成的跨膜糖蛋白，屬于b7-cd28超家族成員，其氨基酸序列如seqidno：1所示。目前研究顯示，pd-l1的mrna廣泛轉(zhuǎn)錄于正常人類組織和器官，其中，胎盤、心臟、肺臟和肝臟中高轉(zhuǎn)錄，脾臟、淋巴結(jié)、胸腺中低轉(zhuǎn)錄，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不轉(zhuǎn)錄。然而，相應(yīng)的pd-l1蛋白卻沒有廣泛翻譯于正常組織中，僅少量翻譯于扁桃體、肺臟、肝臟的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞和免疫特許區(qū)域，pd-l1蛋白也在眼睛和胎盤中翻譯。pd-l1在mrna水平上的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞膜蛋白水平上的翻譯存在差異，這暗示著一種重要的機(jī)制調(diào)控pd-l1蛋白的表達(dá)。近年來，通過免疫組織化學(xué)法(ihc)檢測(cè)手術(shù)或活檢標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)pd-l1蛋白在黑色素瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌(nsclc)、腎癌等多種腫瘤中高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)。pd-l1蛋白低表達(dá)于正常組織中而誘導(dǎo)性地高表達(dá)于腫瘤組織是其區(qū)別于其他共抑制性信號(hào)通路最顯著的特點(diǎn)，這暗示著pd-l1蛋白有選擇性地表達(dá)于腫瘤組織中，與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為腫瘤免疫治療提供了重要的靶點(diǎn)，以期取得更好的療效及更低的毒副作用。

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出，有關(guān)免疫治療的研究得到越來越多的關(guān)注。pd-1/pd-l1免疫療法是當(dāng)前備受矚目的一類抗癌免疫療法，旨在利用人體自身的免疫系統(tǒng)抵御腫瘤：其通過阻斷pd-1/pd-l1信號(hào)通路使腫瘤細(xì)胞死亡，適用于多種類型腫瘤。各研究機(jī)構(gòu)逐步開展相應(yīng)的臨床項(xiàng)目，調(diào)查單藥療法和聯(lián)合療法治療癌癥的效果，以期發(fā)掘該類藥物的臨床價(jià)值。目前，opdivo在日本已適用于黑色素瘤，在美國適用于黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌，在歐盟獲批黑色素瘤適應(yīng)證，同時(shí)opdivo用于肺癌治療的申請(qǐng)已獲得歐盟chmp的支持。默沙東公司keytruda在美國已獲批黑色素瘤適應(yīng)證，并有望近期通過非小細(xì)胞肺癌適應(yīng)證批準(zhǔn)，同時(shí)keytruda用于黑色素瘤治療的申請(qǐng)已獲得歐盟chmp支持。然而，阿斯利康公司的medi4736和羅氏公司的rg7446目前尚未收獲任何適應(yīng)證。全球知名醫(yī)藥市場(chǎng)調(diào)研機(jī)構(gòu)evaluatepharma預(yù)測(cè)：opdivo將成為最成功的免疫療法藥物制劑中的一種。

目前針對(duì)pd-1/pd-l1的研究比較集中，但是缺少新靶點(diǎn)的開發(fā)，“免疫治療”治療模式還不夠規(guī)范。雖然pd-1抑制劑與靶向藥(針對(duì)癌癥細(xì)胞)有著根本的不同，但耐藥問題依然存在，有必要進(jìn)一步研究和開發(fā)新靶點(diǎn)。

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展常常伴隨著pd-l1蛋白磷酸化修飾異常。pd-l1蛋白翻譯后硫酸化修飾在pd-1/pd-l1信號(hào)通路介導(dǎo)的生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，pd-l1蛋白的磷酸化水平對(duì)于pd-1/pd-l1信號(hào)通路的精準(zhǔn)調(diào)控具有非常重要的意義。

因此，有必要研發(fā)出一種人pd-l1蛋白磷酸化抗體，將該抗體蛋白應(yīng)用于惡性腫瘤診斷、治療及預(yù)后判定中，同時(shí)開發(fā)出癌癥的新靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種針對(duì)癌癥的人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體及其制備方法和應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體的半抗原合成肽，所述半抗原合成肽的氨基酸序列如seqidno：2所示，所述半抗原合成肽的酪氨酸y位點(diǎn)添加有磷酸基團(tuán)。

作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述半抗原合成肽的n末端連接有一個(gè)半胱氨酸c。

另外，本發(fā)明還提供所述半抗原合成肽的合成方法，依次包括以下步驟：采用多肽合成技術(shù)合成多肽，所述多肽的氨基酸序列為syggadykritvk，所述多肽的酪氨酸y位點(diǎn)添加磷酸基團(tuán)，所述多肽的n末端連接一個(gè)半胱氨酸c。所述半抗原合成肽為：(nh2-)csyggad(py)kritvk(-cooh)。

另外，本發(fā)明還提供一種人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體的制備方法，包括以下步驟：

1)將權(quán)利要求1所述的半抗原合成肽通過半胱氨酸c與載體蛋白(載體血藍(lán)蛋白klh或牛血清蛋白bsa)進(jìn)行偶聯(lián)，即得抗原；

2)利用步驟1)所述抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，并收集抗血清；

3)將步驟2)所述抗血清進(jìn)行純化和選擇，即為pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體。

作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述步驟2)免疫方式具體為：1次引發(fā)注射，3～4次加強(qiáng)注射和1次直接注射；所述引發(fā)注射和加強(qiáng)注射均為：將抗原合成肽與佐劑聯(lián)合免疫動(dòng)物，在頸部、背部皮膚較薄且松弛的部位兩側(cè)皮下注射，臀肌與大腿部兩側(cè)分別肌肉注射，腰部兩側(cè)皮內(nèi)注射，爪墊注射；所述直接注射為：抗原溶液肌肉注射。

作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述步驟3)中，純化通過以下步驟實(shí)施：測(cè)定純化前的抗血清針對(duì)抗原的效價(jià)，確定純化前的抗血清能識(shí)別抗原；對(duì)收集的抗血清進(jìn)行純化，確定純化后的抗血清能特異性識(shí)別磷酸化人pd-l1蛋白。

優(yōu)選地，收集的抗血清以elisa試驗(yàn)測(cè)定抗血清針對(duì)抗原的效價(jià)及其是否能夠識(shí)別抗原；利用親和分離-親和純化循環(huán)技術(shù)對(duì)抗血清進(jìn)行純化，以dotblot和westernblot試驗(yàn)確定純化后的抗血清是否能夠特異性識(shí)別磷酸化人pd-l1蛋白。

另外，本發(fā)明還提供所述制備方法制備得到的人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體。

另外，本發(fā)明還提供一種藥物制劑，所述藥物制劑包括所述人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體。

另外，本發(fā)明還提供所述人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體在制備用于惡性腫瘤診斷、治療及預(yù)后判定的藥物制劑的應(yīng)用。

另外，本發(fā)明還提供所述藥物制劑在惡性腫瘤診斷、治療及預(yù)后判定的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供一種人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明的技術(shù)方案中列出pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體、其半抗原合成肽以及兩者的制備方法，人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體能檢測(cè)出人pd-l1蛋白磷酸化水平和中止pd-1/pd-l1細(xì)胞信號(hào)通路，這樣有助于研究pd-l1蛋白磷酸化在pd-1/pd-l1細(xì)胞信號(hào)通路的作用和癌癥發(fā)生機(jī)理，為臨床腫瘤疾病的診斷或治療提供尋找出潛在的作用靶點(diǎn)；同時(shí)也可以將人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體運(yùn)用于惡性腫瘤診斷、治療及預(yù)后判定中。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中的抗原蛋白電泳圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中以陰性血清為一抗的抗原westernblot圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中抗血清效價(jià)elisa分析圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中以純化前抗血清為一抗的抗原合westernblot圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中以純化后抗血清為一抗的抗原合westernblot圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例4中人肺鱗癌組織中磷酸化pdl-1蛋白的免疫組織化學(xué)圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例4中人正常食管鱗狀上皮與食管鱗狀細(xì)胞癌的磷酸化pdl-1蛋白免疫組織化學(xué)染色圖。

具體實(shí)施方式

為更好地說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例、附表和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1確定人pd-l1蛋白磷酸化位點(diǎn)

首先通過生物信息軟件netphorest2.0和netphos2.0篩選人pd-l1蛋白中可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)，隨后通過質(zhì)譜文獻(xiàn)和蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫phosohositeplus的查找，確定y123位點(diǎn)是人pd-l1氨基酸序列中的一個(gè)磷酸化位點(diǎn)；同時(shí)利用軟件clcproteinworkbench5計(jì)算人pd-l1氨基酸序列的抗原性和親水性，最終確定人pd-l1蛋白特異性磷酸化位點(diǎn)為第123氨基酸-酪氨酸y123。

人pd-l1蛋白存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)(如y28位點(diǎn))，由于后續(xù)的抗原性和親水性不滿足試驗(yàn)要求，不適合作為磷酸化位點(diǎn)。

實(shí)施例2合成半抗原合成肽

根據(jù)半抗原合成肽的設(shè)計(jì)，在y123位點(diǎn)上添加一個(gè)磷酸化基團(tuán)，進(jìn)行hplc(高效液相色譜法)分離、純化，得到半抗原合成肽的純度為95％以上。與之相應(yīng)，合成一段y123位點(diǎn)非磷酸化的合成肽，并通過n端的半胱氨酸與牛血清蛋白偶聯(lián)用作親和分離層析的填料，經(jīng)hplc分離純化后的純度為90％以上。

實(shí)施例3制備抗血清

3.1制備陰性血清

從用于注射的新西蘭大白兔(2～3kg，雌性，健壯)的耳靜脈采取3ml血液于采血管中，用棉球壓迫止血。將血液置室溫1h左右，待血液凝固形成血塊，4℃下放置2h使血清析出，2500g離心10min，吸取上清，標(biāo)記為陰性對(duì)照血清，分裝并貯存于-20℃待測(cè)。

3.2免疫前篩選-westernblot(蛋白印記)：

bca(bicinchoninicacid)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定已溶的磷酸抗原(py123-bsa)的濃度和非磷酸化的抗原(y123-bsa)的濃度，分別為0.845mg/ml和1.1mg/ml(相關(guān)系數(shù)r＝0.991)。將py123-bsa和y123-bsa進(jìn)行蛋白電泳，結(jié)果如圖1所示：泳道1為y123-bsa，泳道2為py123-bsa。由于合成肽為人工合成，因此蛋白條帶為一段粗寬條帶；因磷酸化修飾使得py123-bsa的分子量較大且條帶略高于y123-bsa的條帶。

取溶解后的純化抗原(py123-bsa、y123-bsa)5μg，加入適當(dāng)?shù)?×sds上樣緩沖液，沸水浴煮沸10min使蛋白質(zhì)變性，10000×g離心10min；sds-page電泳分離膠的體積濃度為10％，濃縮膠的體積濃度為5％。按順序使用加樣槍上樣，在不用的樣品孔中加等體積的5×sds凝膠上樣緩沖液；60v20min電泳后改為100v70min，直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部，關(guān)閉電源。轉(zhuǎn)膜條件：恒流180ma，時(shí)間為180min。5％脫脂奶粉封閉，搖床37℃2h。將轉(zhuǎn)印膜放入用tbst緩沖液按1：5000配制免疫前抗血清稀釋液，水平緩慢搖勻，4℃過夜。次日37℃作用20min，棄一抗溶液，1×tbst洗膜10min，重復(fù)4次。將膜置于用1×tbst按1：5000稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗兔igg的二抗稀釋液中，搖床37℃，50min。棄二抗溶液，1×tbst洗膜10min，重復(fù)3次。按照廠家說明使用ecl試劑盒顯影，拍照記錄。結(jié)果如圖2所示，未出現(xiàn)目的條帶，即未出現(xiàn)針對(duì)目的組織或細(xì)胞提取物的抗體，為理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；其中泳道1、2、3分別為y123-bsa、py123-bsa、bsa。

3.3動(dòng)物免疫(時(shí)長約為73d)

3.31用一個(gè)無菌注射器吸取抗原溶液，另一個(gè)注射器吸取等量弗氏完全佐劑(cfa)，二者之間以塑料管連接，來回反復(fù)抽吸，直至形成完全乳化的乳狀液，滴于水中不擴(kuò)散。

3.32首次免疫分別經(jīng)頸部、背部皮膚較薄、松弛的部位兩側(cè)皮下(s.c)注射，臀肌與大腿部兩側(cè)分別肌肉(i.m)注射，腰部兩側(cè)進(jìn)行皮內(nèi)(i.d)注射，家兔爪墊部位注射等多部位多點(diǎn)注射抗原乳狀液。首次免疫的抗原總量約0.61mg。

3.33首次免疫20d后進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，用弗氏不完全佐劑(ifa)代替cfa作為免疫佐劑制備抗原乳狀液并按首次免疫方式進(jìn)行注射，此次加強(qiáng)免疫的抗原總量均約為0.9mg。

3.34免疫12d后進(jìn)行加第二次強(qiáng)免疫，用ifa代替cfa作為免疫佐劑制備抗原乳狀液并按首次免疫方式進(jìn)行注射，此次加強(qiáng)免疫的抗原總量均約為0.9mg。

3.35免疫10d后，從耳靜脈采血5ml，將血液置室溫1h左右，待血液凝固形成血塊，4℃下放置2h使血清析出，3500g離心10min，吸取上清，標(biāo)記為陽性抗血清，分裝并貯存于-20℃待測(cè)。

3.36陽性抗血清按比例1：1000、1：5000、1：10000稀釋，進(jìn)行elisa檢測(cè)抗體效價(jià)，待測(cè)od值均在1.0以上，各稀釋度的陽性抗血清的p/n值分別7.0、7.4和7.3，則此時(shí)血清抗體效價(jià)至少為1：5000?？贵w效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平(elisa的效價(jià)＞1：1000)，大量采血前進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫：抗原溶液(py123-klh)直接肌肉注射家兔，約0.6mg。

3.37最后一次加強(qiáng)免疫3d后，家兔進(jìn)行腹主動(dòng)脈大采血，大量收集抗血清。將收集有血液的燒杯封閉后室溫靜置過夜，使血塊收縮。次日無菌操作將析出的血清分裝于50ml離心管中，4000g離心10min，取上清，每管分裝1ml，標(biāo)記為免疫后抗血清(共約51ml)，貯存于-20℃。

3.38免疫后抗血清的效價(jià)測(cè)定：以抗原包被液稀釋抗原，使其濃度為2μg/ml，按表1中的濃度梯度稀釋抗血清(血清來源與免疫過的新西蘭大白兔，動(dòng)物編號(hào)分別為rb7771和rb7772)，并按照elisa試劑盒的說明進(jìn)行操作，檢測(cè)結(jié)果如表1和圖3所示。在表1和圖3中，sa表示經(jīng)鏈霉親和素-生物素-抗原系統(tǒng)親和純化后的抗體；(-)表示未經(jīng)該系統(tǒng)親和純化的抗體，即陰性對(duì)照；blank為空白對(duì)照；p-ab是指抗原中半抗原合成肽磷酸化，np-ab是抗原中半抗原合成肽未磷酸化。

表1為免疫后抗血清的效價(jià)測(cè)定結(jié)果

實(shí)施例4特異性鑒定人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體

4.1westernblot檢測(cè)純化后抗體的特異性：

bca蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定已溶的py123-bsa和y123-bsa的濃度，濃度分別為0.692mg/ml和0.647mg/ml(相關(guān)系數(shù)r＝0.9952)。各取溶解后的純化抗原5μg，加入適當(dāng)?shù)?×sds上樣緩沖液，沸水浴煮沸10min使蛋白質(zhì)變性，10000×g離心10min。westernblot上樣分析，其中一抗溶液為1：500的純化后抗體稀釋液和1：10000的純化前抗血清稀釋液。結(jié)果如圖4和圖5所示，圖4的一抗為純化前抗血清稀釋液，bsa泳道均無出現(xiàn)特異性條帶，y123-bsa的泳道以及py123-bsa的泳道均有特異性條帶；圖5的一抗為純化后抗血清稀釋液，bsa泳道和y123-bsa的泳道均無出現(xiàn)特異性條帶，py123-bsa的泳道有特異性條帶。因此，純化后的抗體能特異性識(shí)別磷酸化的半抗原合成肽-bsa(即磷酸化的抗原，也能識(shí)別人磷酸化pd-l1蛋白)。

4.2免疫組化學(xué)鑒定抗體特異性

首先使用人肺磷癌組織，石蠟包埋切片后，做免疫組化染色后鏡檢，其結(jié)果如圖6所示，磷酸化pdl-1蛋白定位到細(xì)胞膜，少量定位到細(xì)胞漿，可作為陽性對(duì)照。然后分別用正常組織及食管癌腫瘤組織做石蠟切片，經(jīng)免疫組化學(xué)染色后鏡檢，其結(jié)果如圖7所示，400x倍下可見正常食管鱗狀上皮組織中上皮細(xì)胞無特異性著色，而食管鱗癌組織中腫瘤細(xì)胞特異性著色陽性率約占40％。，磷酸化pdl-1蛋白主要定位于細(xì)胞膜，少量定位到細(xì)胞漿。與陽性對(duì)照結(jié)果一致。說明本發(fā)明可檢測(cè)食管癌組織中磷酸化pdl-1蛋白的表達(dá)情況。

4.3抗體的保存

將igg陽性組合混合液加入終濃度為2.5％bsa(wt/vol)，0.01％tween-20(vol/vol)和25％甘油的混合液(vol/vol)，每管分裝為1ml，-80℃長期保存。

實(shí)施例5人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體在腫瘤中的應(yīng)用

5.1本發(fā)明制備得到高特異性的人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體可用westernblot實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及用藥后腫瘤細(xì)胞的表達(dá)差異。

5.2本發(fā)明提供的抗體在實(shí)際應(yīng)用中能夠應(yīng)用于icc、elisa等免疫學(xué)試驗(yàn)中檢測(cè)人pd-l1蛋白的轉(zhuǎn)錄后磷酸化修飾情況，從而探討人pd-l1蛋白磷酸化修飾在腫瘤相關(guān)疾病中的意義。

5.3人pd-l1蛋白的激活依賴于磷酸化修飾，阻止其磷酸化可以防止淋巴細(xì)胞的凋亡，因此抗體在實(shí)際應(yīng)用中便于研究人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化修飾對(duì)于特定生物學(xué)事件如免疫調(diào)節(jié)的影響，從而探討其在腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

5.4本發(fā)明提供的抗體有助于探討pd-l1蛋白的磷酸化修飾在腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，在臨床應(yīng)用中更利于抑制藥物對(duì)腫瘤抑制作用的研究。

5.5本發(fā)明是針對(duì)人pd-l1蛋白特定y123位點(diǎn)制備的磷酸化多克隆抗體，有助于研究介導(dǎo)其發(fā)生磷酸化的激酶作用，探討人pd-l1蛋白多種生物學(xué)功能在t細(xì)胞信號(hào)通路及蛋白/核酸相互作用網(wǎng)絡(luò)，從而發(fā)現(xiàn)臨床腫瘤疾病的診斷和治療的潛在作用靶點(diǎn)。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。

序列表

<110>張灝

<120>一種人pd-l1蛋白y123位點(diǎn)磷酸化抗體及其制備方法和應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>290

<212>prt

<213>homosapiens

<400>1

metargilephealavalpheilephemetthrtyrtrphisleuleu

151015

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tyrargglnargalaargleuleulysaspglnleuserleuglyasn

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alaalaleuglnilethraspvallysleuglnaspalaglyvaltyr

100105110

argcysmetilesertyrglyglyalaasptyrlysargilethrval

115120125

lysvalasnalaprotyrasnlysileasnglnargileleuvalval

130135140

aspprovalthrsergluhisgluleuthrcysglnalagluglytyr

145150155160

prolysalagluvaliletrpthrserserasphisglnvalleuser

165170175

glylysthrthrthrthrasnserlysarggluglulysleupheasn

180185190

valthrserthrleuargileasnthrthrthrasngluilephetyr

195200205

cysthrpheargargleuaspproglugluasnhisthralagluleu

210215220

valileprogluleuproleualahisproproasngluargthrhis

225230235240

leuvalileleuglyalaileleuleucysleuglyvalalaleuthr

245250255

pheilepheargleuarglysglyargmetmetaspvallyslyscys

260265270

glyileglnaspthrasnserlyslysglnseraspthrhisleuglu

275280285

gluthr

290

<210>2

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

cyssertyrglyglyalaasptyrlysargilethrvallys

1510