本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及羊棲菜活性蛋白的提取方法。

背景技術(shù)：

羊棲菜（hizikiafusiformis）屬于褐藻門、褐藻綱、墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬的一種海洋孢子植物。它附生在基質(zhì)上，屬于底棲附生生活型藻類。羊棲菜是太平洋西岸特有的一種大型褐藻，屬暖溫帶性多年，中國、日本、韓國沿海均有分布。羊棲菜在我國的分布范圍較廣，北起遼東半島，南至海南島都有分布，尤其以浙江和福建沿海分布最廣。羊棲菜多分布于水深流急，風(fēng)浪較大,透明度較好的海區(qū)的低潮帶和大干潮線下的巖石上；有較強的鹽度和干旱的耐受力，不耐高溫，高溫下側(cè)枝脫落，最終導(dǎo)致藻體腐爛；最適宜的生長溫度在18℃左右，水溫7-25℃的條件下均能生長，羊棲菜的繁殖盛期在5-7月份羊棲菜作為一種可食性海藻，早為人們所認(rèn)識。在日本羊棲菜常和油豆腐等一起加工后作為日餐配料，素有“長壽菜”、“餐桌上的海人參”之美譽。我國南北沿海居民常將羊棲菜與貝類共燒食用，被賦予漁家人的維生素。

羊棲菜營養(yǎng)豐富，是一種富含人體必需的礦物元素、高蛋白、高膳食纖維、低脂肪、低熱量的天然的海洋健康食品，具有較高的開發(fā)和利用價值?！渡褶r(nóng)木草經(jīng)》中記載羊棲菜具有降血脂、抗血栓以及消除大腦疲勞、促進(jìn)兒童發(fā)育、增進(jìn)機體免疫力以及延緩衰老等功效?！侗静菥V目》中記載海草具有軟堅散結(jié)、消炎解毒、破血祛瘀以及利水消腫等功效。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，羊棲菜中所含的活性物質(zhì)具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、增強機體免疫力等功效。因此，羊棲菜活性物質(zhì)可以應(yīng)用在醫(yī)藥、食品以及化妝品等領(lǐng)域。羊棲菜主要產(chǎn)品為干制品，食用非常不方便。因此，人們不斷開發(fā)研制出各種類型的羊棲菜產(chǎn)品。充分發(fā)現(xiàn)和研究羊棲菜中的活性成分及其功能，是開發(fā)出具有高附加值羊棲菜產(chǎn)品的關(guān)鍵。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號為cn103044520b的中國發(fā)明專利，公開了一種節(jié)旋藻蛋白的分離純化方法，具體方法是將藻粉在pbs中充分浸泡，混勻后常溫下避光放置24-72小時離心，收集上清液；將上清液經(jīng)濾膜進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液中加入甲殼胺使混合液ph達(dá)到6.5-7.2，并進(jìn)行攪拌；上述攪拌均勻的混合液離心取上清液，上清液中加入水經(jīng)濾膜進(jìn)行超濾濃縮，超濾置換鈉離子得到純化濃縮液；濃縮液噴霧干燥，即得藥品級節(jié)旋藻蛋白。該方法生產(chǎn)成本低，簡單有效，適合制備藥品級節(jié)旋藻蛋白，但是制備效率低，節(jié)旋藻蛋白得率低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種活性蛋白提取效率高、得率高、純度高、能耗低、對環(huán)境友好的羊棲菜活性蛋白的提取方法。

本發(fā)明針對上述技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：羊棲菜活性蛋白的提取方法，包括粗細(xì)胞破碎、鹽析、透析、純化分離，具體包括以下步驟：

細(xì)胞破碎：將羊棲菜粉碎，加入等體積的濃度為0.8-1%的nacl溶液、重量為羊棲菜0.05-0.09%的活性多肽，混合均勻后在3-5℃下超聲波處理2-3h，然后置于3-5℃下抽濾6-8h，然后將抽濾液在3~5℃、4000~6000rpm下離心20~25min，上清液即為粗蛋白液，活性多肽的氨基酸序列為hshacklcvcvncfccgaalcrvlhpgklcvcncsk，該活性肽具有親水性和親脂性，親水性使其溶于蒸餾水中，親脂性使其與螺旋藻細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)胞膜下形成小孔，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率，也提高活性蛋白的得率，該步驟利用活性肽和低鹽溶液，結(jié)合溶脹法和超聲波法進(jìn)行細(xì)胞破碎，大大縮短了提取時間，提取效果好，粗蛋白液中蛋白含量高，避免了破碎處理過程中需避免因升溫及機械力引起的蛋白質(zhì)變性；

鹽析：向粗蛋白液中加入(nh4)2so4至78-82%飽和度，3~5℃下靜止11-13h，然后在3~5℃、4000~6000rpm下離心20~25min，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

透析：將鹽析沉淀物溶解于磷酸鹽緩沖液，然后裝入透析袋，在ddh2o中透析，更換ddh2o4~6次，袋內(nèi)溶液冷凍干燥，即得粗蛋白，該方法利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過透析袋，而大分子物質(zhì)不能通過透析袋的性質(zhì)，達(dá)到除去(nh4)2so4小分子雜質(zhì)的目的，操作簡單，效果好，節(jié)約能耗；

純化分離：用ph為7~7.4、濃度為0.01~0.012mol/l的tris-hcl緩沖液平衡離子交換柱，然后將粗蛋白溶于tris-hcl緩沖液中，粗蛋白與tris-hcl緩沖液的質(zhì)量體積比為1:0.01-0.02，離心得到上清液，將上清液加入到平衡后的離子交換柱中進(jìn)行層析，用tris-hcl緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為1-1.5ml/min，進(jìn)行透析、冷凍干燥，即得羊棲菜活性蛋白，該活性蛋白顏色鮮艷，營養(yǎng)豐富，能顯著地減輕和逐漸消除輻照、化療對血白細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的損傷，能提高淋巴細(xì)胞活性，通過淋巴系統(tǒng)提高機體免疫功能，增強機體的防病、抗病能力，還能清除生物體內(nèi)的自由基及促進(jìn)動物血細(xì)胞再生，延緩衰老，并且能顯著抑制癌細(xì)胞生長，可用于癌癥的防治。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：1）本發(fā)明提供的羊棲菜活性蛋白的提取方法，提取出的蛋白純度高、得率高，工藝簡單有效，不需要特殊的儀器設(shè)備，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量大，適合大規(guī)模制備羊棲菜活性蛋白；2）該提取方法得到的活性蛋白營養(yǎng)豐富，水溶性好，易于被機體吸收利用，能顯著地減輕和逐漸消除輻照、化療對血白細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的損傷，能提高淋巴細(xì)胞活性，通過淋巴系統(tǒng)提高機體免疫功能，增強機體的防病、抗病能力，還能清除生物體內(nèi)的自由基及促進(jìn)動物血細(xì)胞再生，延緩衰老，并且能顯著抑制癌細(xì)胞生長，可用于癌癥的防治。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明方案作進(jìn)一步說明：

實施例1：

羊棲菜活性蛋白的提取方法，包括粗細(xì)胞破碎、鹽析、透析、純化分離，具體包括以下步驟：

1）細(xì)胞破碎：將羊棲菜粉碎，加入等體積的濃度為1%的nacl溶液、重量為羊棲菜0.06%的活性多肽，混合均勻后在3℃下超聲波處理2h，然后置于3℃下抽濾7h，然后將抽濾液在3℃、5000rpm下離心25min，上清液即為粗蛋白液，活性多肽的氨基酸序列為hshacklcvcvncfccgaalcrvlhpgklcvcncsk，該活性肽具有親水性和親脂性，親水性使其溶于蒸餾水中，親脂性使其與螺旋藻細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)胞膜下形成小孔，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率，也提高活性蛋白的得率，該步驟利用活性肽和低鹽溶液，結(jié)合溶脹法和超聲波法進(jìn)行細(xì)胞破碎，大大縮短了提取時間，提取效果好，粗蛋白液中蛋白含量高，避免了破碎處理過程中需避免因升溫及機械力引起的蛋白質(zhì)變性；

2）鹽析：向粗蛋白液中加入(nh4)2so4至80%飽和度，3℃下靜止12h，然后在3℃、5000rpm下離心25min，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

3）透析：將鹽析沉淀物溶解于磷酸鹽緩沖液，然后裝入透析袋，在ddh2o中透析，更換ddh2o5次，袋內(nèi)溶液冷凍干燥，即得粗蛋白，該方法利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過透析袋，而大分子物質(zhì)不能通過透析袋的性質(zhì)，達(dá)到除去(nh4)2so4小分子雜質(zhì)的目的，操作簡單，效果好，節(jié)約能耗；

4）純化分離：用ph為7.2、濃度為0.01mol/l的tris-hcl緩沖液平衡離子交換柱，然后將粗蛋白溶于tris-hcl緩沖液中，粗蛋白與tris-hcl緩沖液的質(zhì)量體積比為1:0.01，離心得到上清液，將上清液加入到平衡后的離子交換柱中進(jìn)行層析，用tris-hcl緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為1.2ml/min，進(jìn)行透析、冷凍干燥，即得羊棲菜活性蛋白，該活性蛋白顏色鮮艷，營養(yǎng)豐富，能顯著地減輕和逐漸消除輻照、化療對血白細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的損傷，能提高淋巴細(xì)胞活性，通過淋巴系統(tǒng)提高機體免疫功能，增強機體的防病、抗病能力，還能清除生物體內(nèi)的自由基及促進(jìn)動物血細(xì)胞再生，延緩衰老，并且能顯著抑制癌細(xì)胞生長，可用于癌癥的防治。

實施例2：

羊棲菜活性蛋白的提取方法，具體包括以下步驟：

將羊棲菜粉碎，加入等體積的濃度為0.8%的nacl溶液、重量為羊棲菜0.09%的活性多肽，混合均勻后在4℃下超聲波處理3h，然后置于4℃下抽濾7h，然后將抽濾液離心，上清液即為粗蛋白液，活性多肽的氨基酸序列為hshacklcvcvncfccgaalcrvlhpgklcvcncsk，該活性肽具有親水性和親脂性，親水性使其溶于蒸餾水中，親脂性使其與螺旋藻細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)胞膜下形成小孔，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率，也提高活性蛋白的得率，該步驟利用活性肽和低鹽溶液，結(jié)合溶脹法和超聲波法進(jìn)行細(xì)胞破碎，大大縮短了提取時間，提取效果好，粗蛋白液中蛋白含量高，避免了破碎處理過程中需避免因升溫及機械力引起的蛋白質(zhì)變性；

向粗蛋白液中加入(nh4)2so4至82%飽和度，4℃下靜止13h，然后離心，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

將鹽析沉淀物溶解于磷酸鹽緩沖液，然后裝入透析袋，在ddh2o中透析，更換ddh2o4次，袋內(nèi)溶液冷凍干燥，即得粗蛋白，該方法利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過透析袋，而大分子物質(zhì)不能通過透析袋的性質(zhì)，達(dá)到除去(nh4)2so4小分子雜質(zhì)的目的，操作簡單，效果好，節(jié)約能耗；

用ph為7.4、濃度為0.012mol/l的tris-hcl緩沖液平衡離子交換柱，然后將粗蛋白溶于tris-hcl緩沖液中，粗蛋白與tris-hcl緩沖液的質(zhì)量體積比為1:0.015，離心得到上清液，將上清液加入到平衡后的離子交換柱中進(jìn)行層析，用tris-hcl緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為1ml/min，進(jìn)行透析、冷凍干燥，即得羊棲菜活性蛋白，該活性蛋白顏色鮮艷，營養(yǎng)豐富，能顯著地減輕和逐漸消除輻照、化療對血白細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的損傷，能提高淋巴細(xì)胞活性，通過淋巴系統(tǒng)提高機體免疫功能，增強機體的防病、抗病能力，還能清除生物體內(nèi)的自由基及促進(jìn)動物血細(xì)胞再生，延緩衰老，并且能顯著抑制癌細(xì)胞生長，可用于癌癥的防治。

實施例3：

羊棲菜活性蛋白的提取方法：將羊棲菜粉中加入等體積的濃度為0.9%的nacl溶液、重量為羊棲菜0.09%的活性多肽，混合均勻后超聲波處理，抽濾，離心，上清液即為粗蛋白液；向粗蛋白液中加入(nh4)2so4至79%飽和度，靜止11h，離心；將鹽析沉淀物溶解于磷酸鹽緩沖液，然后裝入透析袋，在ddh2o中透析，袋內(nèi)溶液冷凍干燥，即得粗蛋白；將粗蛋白溶于tris-hcl緩沖液中，離心，將上清液加入到平衡后的離子交換柱中進(jìn)行層析，用tris-hcl緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為1.3ml/min，再進(jìn)行透析、冷凍干燥，即得羊棲菜活性蛋白。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。

以上所述的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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