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一種檢測復(fù)發(fā)性流產(chǎn)易感基因的檢測試劑盒的制作方法

文檔序號:11259614閱讀:707來源:國知局

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域,涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù),具體涉及一種復(fù)發(fā)性流產(chǎn)易感基因檢測試劑盒,根據(jù)檢測結(jié)果從基因水平評估復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病的風(fēng)險級別,并作為預(yù)防和治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的方向指導(dǎo)。



背景技術(shù):

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)者稱為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(rsa)。流產(chǎn)是指妊娠28周以前終止、胎兒體重在1000克以下者。1977年,世界衛(wèi)生組織(who)將流產(chǎn)定義為妊娠20周以前終止、胎兒體重在500克以下者。

引起復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的危險因素很多,復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的患者中能夠識別其病因的僅占50%,主要包括染色體異常、母體生殖道異常、母體內(nèi)分泌異常、免疫功能異常、生殖道感染、宮頸機能不全及血栓形成傾向等。

最近的研究表明,復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生與tnf-α、ctla4、mthfr三個遺傳易感基因密切相關(guān)。tnf-α基因編碼腫瘤壞死因子-α,它能顯著增強巨噬細(xì)胞抑制細(xì)菌生長的能力,還能誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,從而間接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性,增強特異性免疫保護(hù)功能。tnf-α基因g308a突變能使得腫瘤壞死因子α含量增多,產(chǎn)生過強炎性反應(yīng),母-胎間免疫應(yīng)答水平上升,對妊娠產(chǎn)生不良影響。

mthfr基因編碼亞甲基四氫葉酸還原酶,是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶,維持正常的同型半胱氨酸水平。mthfr基因c677t和a1298c突變,使編碼的亞甲基四氫葉酸還原酶活性降低,葉酸代謝能力下降,血液中同型半胱氨酸水平上升,加重血栓形成傾向,損傷母體及胎兒。

ctla4編碼細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞抗原,負(fù)向調(diào)節(jié)t淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答,影響著多種自身免疫性疾病的易感性。該基因a49g突變編碼的蛋白量下降,對免疫信號的下調(diào)作用降低,導(dǎo)致免疫信號失控,引發(fā)母胎損傷。

綜上所述,鑒于tnf-α、ctla4、mthfr基因與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生有著重要的關(guān)聯(lián)關(guān)系,可以做為預(yù)測和篩查復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的潛在指征,通過這些復(fù)發(fā)性流產(chǎn)易感基因的檢測,能在預(yù)防和治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)以及降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生率等方面起到不容忽視的重要作用。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明基于tnf-α基因上單核苷酸多態(tài)性位點g308a(rs1800629),ctla4基因上單核苷酸多態(tài)性位點a49g(rs231775),mthfr基因上單核苷酸多態(tài)性位點c677t(rs1801133)、a1298c(rs1801131)基因型可作為評估復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病的危險因子的基礎(chǔ)上,研制一種復(fù)發(fā)性流產(chǎn)易感基因檢測試劑盒。

該試劑盒包括:

檢測tnf-α基因上單核苷酸多態(tài)性位點g308a(rs1800629),ctla4基因上單核苷酸多態(tài)性位點a49g(rs231775),mthfr基因上單核苷酸多態(tài)性位點c677t(rs1801133)、a1298c(rs1801131)的4個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物對及dna測序引物;

pcr反應(yīng)組件(包括taq酶、dntp混合液、反應(yīng)緩沖液、ddh2o等);

pcr產(chǎn)物純化組件(包括sap酶、exoi酶、ddh2o等);

dna測序反應(yīng)組件(包括bigdyemix,edta溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、hidi溶液、ddh2o等)。

本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:

pcr反應(yīng)體系:10×pcr反應(yīng)緩沖液2.5ul;25mmdntp混合液0.2ul;5u/ultaqdna聚合酶0.125ul;20um特異性引物對(每條引物各0.25ul);ddh2o19.175ul。

pcr產(chǎn)物純化體系:1u/ulsap酶0.75ul;10u/ulexoi酶0.375ul;ddh2o3.875ul。

測序反應(yīng)體系:25%bigdyemix1ul;3.2umdna測序引物1ul;125mmedta溶液1ul;100%乙醇溶液15ul;70%乙醇溶液30ul;hidi溶液8ul;ddh2o2ul。

本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用,試劑盒的保存溫度為-20℃。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則百分比和份數(shù)按重量計算。

除非另行定義,文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外,任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1.檢測試劑盒的使用

1、抽提dna模板

刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞,用酚氯仿法抽提基因組dna。

2、pcr擴(kuò)增反應(yīng)

使用檢測試劑盒中的pcr反應(yīng)組件,其中,含有下列引物對:

(1)tnf-α(g308a)正向引物:5′gaggcaataggttttgaggggcatg3′

tnf-α(g308a)反向引物:3′ggacggggttcagcctccagggtcc5′

(2)ctla4(a49g)正向引物:5′cagcggcacaaggctcagctgaacctggct3′

ctla4(a49g)反向引物:3′ccaggacctggccctgcactctcctgtttt5′

(3)mthfr(c677t)正向引物:5′ttgaaggagaaggtgtctgcgggag3′

mthfr(c677t)反向引物:3′cgatttcatcatcacgcagcttttc5′

(4)mthfr(a1298c)正向引物:5′tggggggaggagctgaccagtgaag3′

mthfr(a1298c)反向引物:5′aagtgtctttgaagtctttgttctt3′

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:10×pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl;25mm的dntp混合液0.2μl、5u/ultaq酶0.125μl、dna模板1μl(12-15ng左右)、20um正向引物反向引物各0.25μl、ddh2o19.175μl;

反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min,然后94℃變性1min,50℃1min退火,72℃延伸50s,35個循環(huán)后,72℃延伸10分鐘。

3、pcr擴(kuò)增產(chǎn)物純化

使用檢測試劑盒中的pcr產(chǎn)物純化組件,反應(yīng)體系為總體積25ul,包含pcr產(chǎn)物20ul,1u/ulsap酶0.75ul,10u/ulexoi酶0.375ul,去離子水3.875ul。在abi2720型pcr擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件為37℃、15min,72℃、20min。

4、dna測序反應(yīng)

使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)組件,其中,含有下列dna測序引物:

(1)tnf-α(g308a)測序引物:5′gaggcaataggttttgag3′

(2)ctla4(a49g)測序引物:5′cagcggcacaaggctcagctg3′

(3)mthfr(c677t)測序引物:5′ttgaaggagaaggtgtctg3′

(4)mthfr(a1298c)測序引物:5′tggggggaggagctgaccag3′

反應(yīng)的體系為總體積5ul,包含pcr純化產(chǎn)物1ul,25%bigdyemix1ul,3.2umdna

測序引物1ul,去離子水2ul。

在abi2720型pcr擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件為98℃2min,進(jìn)行25個循環(huán)的

96℃30s,55℃30s,60℃4min。

反應(yīng)結(jié)束后加入125mmedta溶液1ul和100%乙醇溶液15ul,于室溫下沉淀15min;在4℃,3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液;加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液;室溫放置20min后加入hidi溶液8ul,放入測序儀中。

5、基因型分析

熟悉dna測序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識dna測序圖譜確定所檢測的snp位點的基因型。

實施例2.篩查復(fù)發(fā)性流產(chǎn)風(fēng)險人群的基因無創(chuàng)檢測服務(wù)

1.無創(chuàng)采樣

由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔粘膜上皮細(xì)胞取樣,樣本用細(xì)胞保存液常溫保存。

2.dna抽提

采用酚氯仿法對采集到的口腔粘膜細(xì)胞進(jìn)行dna抽提。

3.基因型檢測

使用本發(fā)明提供的試劑盒,對受檢者基因組dna的tnf-α基因上單核苷酸多態(tài)性位點g308a(rs1800629),ctla4基因上單核苷酸多態(tài)性位點a49g(rs231775),mthfr基因上單核苷酸多態(tài)性位點c677t(rs1801133)、a1298c(rs1801131)的4個單核苷酸多態(tài)性位點分別進(jìn)行dna測序,確定這4個snps位點的基因型。

4.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病高危人群生物信息學(xué)分析及風(fēng)險評估

通過對受檢者snps基因型的生物信息學(xué)分析和風(fēng)險評估模型鑒定,出具復(fù)發(fā)性流產(chǎn)易感基因風(fēng)險評估分析報告單。報告中詳細(xì)說明了受檢者tnf-α基因上單核苷酸多態(tài)性位點g308a(rs1800629),ctla4基因上單核苷酸多態(tài)性位點a49g(rs231775),mthfr基因上單核苷酸多態(tài)性位點c677t(rs1801133)、a1298c(rs1801131)的4個snp位點基因檢測信息、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)風(fēng)險評估結(jié)果和防治方案。根據(jù)受檢者的風(fēng)險等級,由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說明并解讀復(fù)發(fā)性流產(chǎn)易感基因無創(chuàng)檢測報告單。

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