本發(fā)明屬于病原檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種蜜蜂幼蟲腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法。

背景技術(shù)：

蜜蜂美洲幼蟲腐臭病(americanfoulbrood，afb)和歐洲幼蟲腐臭病(europeanfoulbrood，efb)，是蜜蜂幼蟲兩種重要的細菌性疾病，病原體分別為幼蟲芽孢桿菌(paenibacilluslarvae，p.larvae)和蜂房蜜蜂球菌(melissococcuspluton，m.pluton)，呈世界性分布，世界動物衛(wèi)生組織(oie)將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為二類動物疫病和進境動物檢疫疫病，是我國轉(zhuǎn)地養(yǎng)蜂和世界各國在進境蜂及蜂產(chǎn)品中重點檢疫的兩種蜜蜂疫病。p.larvae在一定條件下能產(chǎn)生芽孢，具有特別強的生存能力，病原很難控制和凈化；m.pluton雖不產(chǎn)生芽孢，但對外界不良環(huán)境的抵抗力強，能在蜂尸上存活數(shù)年，在蜂蜜里也能保持長久的毒性，傳染性極強。afb和efb均感染和危害蜜蜂幼蟲，且病癥相似，易發(fā)生誤診，因此開展對afb和efb的同步鑒別及早期診斷研究具有重要意義。目前，afb和efb的實驗室診斷方法主要包括細菌涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、凝集試驗和核酸檢測等方法，已有診斷方法全部是基于病原分離培養(yǎng)鑒定基礎(chǔ)之上的，由于幼蟲芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌對培養(yǎng)條件要求極其苛刻，分離培養(yǎng)困難，上述診斷方法很難對美洲幼蟲腐臭病和歐洲幼蟲腐臭病做出準確診斷和推廣應(yīng)用，已報道的afb和efb多重pcr診斷方法為普通pcr，該方法只能對終產(chǎn)物進行分析，無法對起始模版準確定量和對擴增反應(yīng)實時監(jiān)測，必須在擴增反應(yīng)結(jié)束后借助電泳方法分析，流程較復(fù)雜，且在實驗室內(nèi)使用eb等有毒物質(zhì)，已報道的熒光定量pcr均為單重pcr方法，無法實現(xiàn)在同一反應(yīng)管中同時檢測兩種病原的目的，國內(nèi)外未見有afb和efb病原菌雙重taqman熒光定量pcr檢測方法的報道。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是：

1.分離培養(yǎng)、凝集試驗等方法全部是基于病原分離培養(yǎng)鑒定基礎(chǔ)之上的，幼蟲芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌對培養(yǎng)條件要求極其苛刻，分離培養(yǎng)困難，對該病很難做出準確診斷，診斷方法也很難推廣應(yīng)用。

2.國外在afb和efb的實驗室診斷方面建立了多種pcr方法，但我國缺少具有自主知識產(chǎn)權(quán)的快速、準確、高通量、易于推廣的pcr方法，不利于我國蜜蜂疫病的防控。

3.目前，已建立的afb和efb多重pcr診斷方法為普通pcr，只能對終產(chǎn)物進行分析，無法對起始模版準確定量和對擴增反應(yīng)實時監(jiān)測，必須在擴增反應(yīng)結(jié)束后借助電泳方法分析，流程較復(fù)雜，且在實驗室內(nèi)使用eb等有毒物質(zhì)。

4.目前，已建立的afb和efb熒光定量pcr均為單重pcr方法，無法實現(xiàn)在同一反應(yīng)管中同時檢測兩種病原的目的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種蜜蜂幼蟲腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種蜜蜂幼蟲腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法，所述蜜蜂幼蟲腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法利用兩條探針，一條探針5′端采用比較成熟的fam作為熒光報告基團，另一條探針5′端選擇vic作為標記，兩條探針3′端選用bhq1非熒光淬滅基團。

進一步，具體檢測流程為：

1、dna抽提：采用ctab法或煮沸法或其它常規(guī)dna抽提方法提取樣品、陽性對照、陰性對照中的dna；

2、對照設(shè)置：幼蟲芽孢桿菌、蜂房蜜蜂球菌或含有目的dna片段的陽性質(zhì)粒作為陽性對照、健康蜜蜂幼蟲dna作為陰性對照，同時設(shè)立無模板空白對照；

3、25μlpcr反應(yīng)體系配置：在pcr管中加入premixextaq(2×)12.5μl，p.larvaef(10μmol/l)1μl，p.larvaer(10μmol/l)1μl，p.larvaep(10μmol/l)1μl，m.plutonf(10μmol/l)1μl，m.plutonr(10μmol/l)1μl，m.plutonp(10μmol/l)1μl，模板dna1μl，加滅菌ddh2o5.5μl，使反應(yīng)總體積為25.0μl；

4、pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min；94℃變性15s、59℃退火延伸50s，共40個循環(huán)，退火延伸時收集熒光信號；

5、結(jié)果判定：陰性對照和空白對照無fam和vic熒光信號檢出，無ct值，并且無擴增曲線，陽性對照同時使用幼蟲芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌dna或混合陽性質(zhì)粒，應(yīng)同時有fam和vic熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，ct值均≤35.0，對分別只單獨使用幼蟲芽孢桿菌dna或蜂房蜜蜂球菌dna或其陽性質(zhì)粒，則各管對應(yīng)只出現(xiàn)fam或vic熒光信號，各熒光信號有明顯擴增曲線，且ct值都分別≤35.0，說明試驗為有效試驗，否則試驗無效；在試驗有效的情況下，待測樣品有fam和vic熒光同時被檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，ct值均≤35.0，判定為陽性，表明從樣品中同時檢出幼蟲芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌，只有fam熒光被檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，ct值≤35.0，判定為陽性，表明從樣品中只檢出幼蟲芽孢桿菌，只有vic熒光被檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，ct值≤35.0，判定為陽性，表明從樣品中只檢出蜂房蜜蜂球菌，無fam或vic熒光被檢出，且無擴增曲線，無ct值，判定為陰性，表明從樣品中未檢出幼蟲芽孢桿菌或蜂房蜜蜂球菌；待測樣品ct值>35.0的樣品重新檢測，重新檢測結(jié)果無fam或vic熒光被檢出，判定為陰性，表明從樣品中未檢出幼蟲芽孢桿菌或蜂房蜜蜂球菌，重新檢測結(jié)果有fam或vic熒光被檢出，判定為陽性，表明從樣品中檢出幼蟲芽孢桿菌或蜂房蜜蜂球菌。重新檢測需從提取dna開始重新檢測，可從多個方面盡量提高檢出率，根據(jù)各種具體情況在可選使用量的幾個因素中調(diào)整優(yōu)化檢測過程，如增加樣品取樣量、減少溶解dna的te劑量、增加pcr反應(yīng)中加入的模板量、適當增加pcr反應(yīng)循環(huán)數(shù)等。也可以針對其中一種可疑存在的病原菌進行單一熒光定量pcr檢測。

本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果為：為快速鑒別診斷蜜蜂美洲幼蟲腐臭病(afb)和歐洲幼蟲腐臭病(efb)，根據(jù)genbank中登陸的幼蟲芽孢桿菌(p.larvae)和蜂房蜜蜂球菌(m.pluton)16srrna基因序列分別設(shè)計特異性引物和探針，建立了雙重taqman熒光定量pcr檢測方法。結(jié)果表明：本發(fā)明的方法與其它病原無交叉反應(yīng)；對p.larvae和m.pluton的檢測靈敏度均達10拷貝/μl的陽性質(zhì)粒；重復(fù)性試驗結(jié)果顯示批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于2％。對200份實驗室模擬樣品和200份臨床樣品進行了檢測，與預(yù)期結(jié)果一致。

本發(fā)明建立的方法可用于afb與efb的快速鑒別診斷、早期監(jiān)測、蜂產(chǎn)品中p.larvae和m.pluton的定量分析；建立afb和efb病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法，為afb和efb的早期同步診斷、蜂及蜂產(chǎn)品中p.larvae和m.pluton的檢驗檢疫提供技術(shù)保障。

本發(fā)明建立的蜜蜂幼蟲腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法可直接用于臨床樣品及受污染的蜂產(chǎn)品中幼蟲芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌的檢測，無需病原培養(yǎng)，操作簡單，結(jié)果準確，適用于早期監(jiān)測，易于推廣應(yīng)用。

本發(fā)明建立的蜜蜂幼蟲腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法的引物和探針是自行設(shè)計，通過試驗參數(shù)優(yōu)化獲得最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，填補了國內(nèi)外使用該方法對蜜蜂美洲幼蟲腐臭病和歐洲幼蟲腐臭病開展同時鑒別診斷的空白，屬我國自主研發(fā)的蜂病診斷方法，為我國蜂病防控提供新的有效的技術(shù)手段。

本發(fā)明建立的蜜蜂幼蟲腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法試驗過程全封閉，儀器自動分析和獲取試驗結(jié)果，無后續(xù)試驗操作，可對起始模版準確定量和擴增反應(yīng)實時監(jiān)測，方法特異性、靈敏度、自控化程度等均高于普通pcr。

本發(fā)明建立的蜜蜂幼蟲腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法可在同一反應(yīng)管同步檢測幼蟲芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌兩種病原，也可以針對其中一種可疑存在的病原菌進行單一熒光定量pcr檢測，具有快速、靈敏、高通量等特點，節(jié)省檢測時間和檢測費用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的蜜蜂幼蟲腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實施例提供的p.larvae陽性模板的擴增示意圖；

圖中：m：dl2000dnamarker；1：pcrproduct；2：negativecontrol。

圖3是本發(fā)明實施例提供的m.pluton陽性模板的擴增示意圖；

圖中：m：dl2000dnamarker；1：pcrproduct；2：negativecontrol。

圖4是本發(fā)明實施例提供的雙重?zé)晒舛縫cr檢測pxt-p標準品的標準曲線示意圖。

圖5是本發(fā)明實施例提供的雙重?zé)晒舛縫cr檢測pxt-m標準品的標準曲線示意圖。

圖6是本發(fā)明實施例提供的雙重?zé)晒舛縫cr特異性試驗擴增曲線示意圖；

圖中：1：m.pluton；2：p.larvae；3：nosemaapis；4：asosphaeraapis；5：sacbroodbeevirus；6：chronicbeeparalysisvirus；7：健康蜜蜂幼蟲。

圖7是本發(fā)明實施例提供的雙重?zé)晒舛縫cr敏感性試驗示意圖；

圖中：1-8：p.larvae1.3×10⁷copies/μl～1.3×10⁰copies/μl；a-h：m.pluton1.0×10⁷copies/μl～1.0×10⁰copies/μl；n：negativecontrol。

圖8是本發(fā)明實施例提供的普通pcr敏感性試驗示意圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細的描述。

本發(fā)明實施例提供的蜜蜂幼蟲腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法利用一條探針5′端采用比較成熟的fam作為熒光報告基團，另一條探針5′端選擇vic作為標記，兩條探針3′端選用bhq1非熒光淬滅基團。一對幼蟲芽孢桿菌引物p.larvaef/p.larvaerseqidno：1和一條探針p.larvaepseqidno：2、一對蜂房蜜蜂球菌引物m.plutonf/m.plutonrseqidno：3和一條探針m.plutonpseqidno：4。

如圖1所示，本發(fā)明實施例提供的蜜蜂幼蟲腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法包括以下步驟：

s101：dna抽提：采用ctab法或煮沸法或其它常規(guī)dna抽提方法提取樣品、陽性對照、陰性對照中的dna；

s102：對照設(shè)置：幼蟲芽孢桿菌、蜂房蜜蜂球菌或含有目的dna片段的陽性質(zhì)粒作為陽性對照、健康蜜蜂幼蟲dna作為陰性對照，同時設(shè)立無模板空白對照；

s103：25μlpcr反應(yīng)體系配置：在pcr管中加入premixextaq(2×)12.5μl，p.larvaef(10μmol/l)1μl，p.larvaer(10μmol/l)1μl，p.larvaep(10μmol/l)1μl，m.plutonf(10μmol/l)1μl，m.plutonr(10μmol/l)1μl，m.plutonp(10μmol/l)1μl，模板dna1μl，加滅菌ddh2o5.5μl，使反應(yīng)總體積為25.0μl；

s104：pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min；94℃變性15s、59℃退火延伸50s，共40個循環(huán)，退火延伸時收集熒光信號；

s105：結(jié)果判定：陰性對照和空白對照無fam和vic熒光信號檢出，無ct值，并且無擴增曲線，陽性對照同時使用幼蟲芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌dna或混合陽性質(zhì)粒，應(yīng)同時有fam和vic熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，ct值均≤35.0，對分別只單獨使用幼蟲芽孢桿菌dna或蜂房蜜蜂球菌dna或其陽性質(zhì)粒，則各管對應(yīng)只出現(xiàn)fam或vic熒光信號，各熒光信號有明顯擴增曲線，且ct值都分別≤35.0，說明試驗為有效試驗，否則試驗無效。

下面結(jié)合試驗對本發(fā)明的應(yīng)用效果作詳細的描述。

1材料與方法

1.1菌/毒/蟲株p.larvae購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，m.pluton購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，蜜蜂微孢子蟲(nosemaapis)、蜜蜂球囊菌(asosphaeraapis)、囊狀幼蟲病毒(sacbroodbeevirus)、慢性蜜蜂麻痹病病毒(chronicbeeparalysisvirus)由伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心分離保存。

1.2主要試劑和儀器基因組dna提取試劑盒、rna提取試劑盒購自qiagen公司；premixextaq(probeqpcr)、primescriptrt-pcrkit、pxt19-tvector、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司。abi7500realtimepcrsystem購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3引物和探針的設(shè)計與合成根據(jù)genbank登錄的p.larvae和m.pluton16srrna基因保守序列，使用primerprimier5和primerexpress3.0軟件分別設(shè)計一對幼蟲芽孢桿菌引物p.larvaef/p.larvaerseqidno：1和一條探針p.larvaepseqidno：2、一對蜂房蜜蜂球菌引物m.plutonf/m.plutonrseqidno：3和一條探針m.plutonpseqidno：4(表1)。引物和探針由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成。

表1引物和探針序列

1.4標準品的制備提取p.larvae和m.pluton基因組作為模板，應(yīng)用特異性引物分別進行普通pcr擴增，分別將pcr產(chǎn)物克隆至pxt19-tvector，構(gòu)建重組質(zhì)粒pxt-p和pxt-m，轉(zhuǎn)化至e.colidh5α感受態(tài)細胞，37℃過夜搖菌后提取質(zhì)粒進行普通pcr和測序驗證，鑒定正確的重組質(zhì)粒測定濃度，作為雙重?zé)晒舛縫cr的標準品。

1.5反應(yīng)體系和條件優(yōu)化單重、雙重?zé)晒舛縫cr均采用premixextaq(probeqpcr)試劑，在abi7500型熒光定量pcr儀上進行試驗。雙重?zé)晒舛縫cr反應(yīng)體系中引物、探針濃度和反應(yīng)條件中退火、延伸溫度和時間在單重?zé)晒舛縫cr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上優(yōu)化。

1.6標準曲線的建立將pxt-p和pxt-m標準品做10倍系列稀釋，用不同稀釋梯度的標準品作為模板，按優(yōu)化好的體系條件進行雙重?zé)晒舛縫cr，繪制標準曲線。

1.7特異性試驗分別提取p.larvae、m.pluton、nosemaapis、asosphaeraapis、sacbroodbeevirus、chronicbeeparalysisvirus、健康蜜蜂幼蟲核酸，sacbroodbeevirus和chronicbeeparalysisvirusrna反轉(zhuǎn)錄成cdna后，進行單一及雙重?zé)晒舛縫cr檢測，確定該方法的特異性。

1.8敏感性試驗用已知濃度的pxt-p和pxt-m標準品進行10倍系列稀釋8個梯度(10⁷拷貝/μl～10⁰拷貝/μl)，分別作為模板，按優(yōu)化好的體系條件進行雙重?zé)晒舛縫cr，確定反應(yīng)的最小檢出量。同時進行普通pcr反應(yīng)，比較兩種檢測方法的敏感性。

1.9重復(fù)性試驗選取5個10倍系列稀釋的pxt-p和pxt-m標準品分別作為模板，各濃度進行3次重復(fù)檢測，根據(jù)ct值計算批內(nèi)變異系數(shù)；以上述不同濃度的標準品分別作為模板，在3個不同時間進行熒光定量pcr檢測，根據(jù)ct值計算批間變異系數(shù)，評價該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10實驗室模擬樣品和臨床樣品檢測將定量的不同稀釋度的pxt-p和pxt-m標準品摻入幼蟲、蜂蛹、成蜂、蜂蜜、蜂膠、蜂王漿和花粉樣品中制成200份實驗室模擬樣品；采自新疆的200份蜜蜂幼蟲及蜂產(chǎn)品作為臨床樣品，應(yīng)用建立的雙重?zé)晒舛縫cr方法進行檢測。

2結(jié)果

2.1標準品的制備將p.larvaedna和m.plutondna進行普通pcr擴增，獲得長度約為130bp和160bp的目的片段(圖2，圖3)，pcr產(chǎn)物經(jīng)測序分析，與genbank中登錄序列的同源性達到100％。將目的片段克隆于pxt19-tvector中構(gòu)建pxt-p和pxt-m重組質(zhì)粒標準品，經(jīng)普通pcr和測序鑒定正確。

2.2反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化通過采用矩陣法優(yōu)選引物、探針最佳濃度配比及退火、延伸溫度和時間。優(yōu)化后的雙重?zé)晒舛縫cr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件(表2)。

表2雙重?zé)晒舛縫cr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

2.3標準曲線的建立將pxt-p和pxt-m標準品10倍系列稀釋，進行雙重?zé)晒舛縫cr，獲得了標準曲線，結(jié)果表明標準品濃度在10⁷拷貝/μl～10拷貝/μl具有良好的線性關(guān)性，兩條標準曲線的相關(guān)系數(shù)均為r²＝0.999。線性方程分別為ct＝-3.381×logco+36.56(pxt-p)(圖4)和ct＝-3.495×logco+41.24(pxt-m)(圖5)。

2.4特異性試驗雙重?zé)晒舛縫cr特異性檢測結(jié)果顯示，p.larvae及m.pluton均產(chǎn)生擴增曲線，且循環(huán)閾值均小于35。而其它病原、健康蜜蜂幼蟲均未產(chǎn)生擴增曲線(圖6)。

2.5敏感性試驗將10倍系列稀釋的8個梯度(10⁷拷貝/μl～10⁰拷貝/μl)的pxt-p和pxt-m標準品，分別作為模板進行雙重?zé)晒舛縫cr和普通pcr檢測，結(jié)果顯示雙重?zé)晒舛縫cr最小檢出量為10拷貝/μl(圖7)，普通pcr最小檢出量為10³拷貝/μl(圖8)，表明熒光定量pcr的敏感性比普通pcr提高了約100倍。

2.6重復(fù)性試驗選取5個10倍倍比稀釋的pxt-p和pxt-m標準品進行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗，根據(jù)擴增反應(yīng)的ct值，計算變異系數(shù)(cv)，結(jié)果顯示變異系數(shù)均小于2％(表3)，表明所建立的方法具有較好的重復(fù)性。

表3雙重?zé)晒舛縫cr重復(fù)性試驗

2.7樣品檢測應(yīng)用建立的雙重?zé)晒舛縫cr方法和普通pcr方法對200份實驗室模擬樣品和采自新疆的200份蜜蜂幼蟲及蜂產(chǎn)品臨床樣品進行檢測，結(jié)果加入pxt-p和pxt-m標準品濃度10拷貝/μl以上的實驗室模擬樣品雙重?zé)晒舛縫cr檢測均為陽性，加入pxt-p和pxt-m標準品濃度10³拷貝/μl以上的實驗室模擬樣品普通pcr檢測均為陽性，蜜蜂幼蟲及蜂產(chǎn)品臨床樣品兩種檢測方法結(jié)果均為陰性，表明該雙重?zé)晒舛縫cr具有良好的臨床靈敏性和應(yīng)用性。

afb和efb病原可以廣泛分布在病蜂接觸過的花粉、糖液、飼槽、巢脾等，這些都可以作為主要傳染源，p.larvae及m.pluton對外界都有著較強的抵抗力，同時盜蜂和迷巢蜂等使該病在蜂群中傳播，所以要徹底清除這些病原是相當困難的，這也很大程度上影響著蜜蜂群勢及蜂產(chǎn)品的產(chǎn)量與質(zhì)量。兩種疫病臨床癥狀相似，易誤診，因此開展對afb和efb的同步鑒別及早期診斷研究具有重要意義。

多重?zé)晒舛縫cr方法是在單重?zé)晒舛縫cr基礎(chǔ)上發(fā)展的技術(shù)，在同一個反應(yīng)體系中加入多套引物和探針，探針的5′端標記不同波長的發(fā)光基團，可同時對多種目標基因進行檢測，具有快速、靈敏、高通量等特點，已成為實驗室檢測病原體及病理分析的主要手段之一。本發(fā)明建立了p.larvae及m.pluton的雙重taqman探針熒光定量pcr檢測方法，實現(xiàn)了在同一反應(yīng)管中同時檢測兩種病原的目的，節(jié)省了檢測時間和檢測費用。通過反應(yīng)體系和條件優(yōu)化解決了兩對引物和探針之間相互干擾問題，設(shè)計探針時，p.larvae和m.pluton探針5′端分別標記熒光發(fā)射波長處于不同光譜范圍的fam和vic報告基團，不易互相干擾，3′端標記bhq1作為熒光淬滅基團，該修飾基團本身不產(chǎn)生熒光，且淬滅效率更高，大大降低了本底信號的強度，提高了方法靈敏度。采用本發(fā)明建立的雙重?zé)晒舛縫cr和普通pcr檢測實驗室制備的200份模擬樣品和200份臨床樣品，結(jié)果表明本發(fā)明建立的雙重?zé)晒舛縫cr方法靈敏度更高，技術(shù)驗證試驗表明該方法具有良好的特異性、重復(fù)性和廣泛的適用性。本發(fā)明建立的taqman探針雙重?zé)晒舛縫cr方法可用于afb和efb的快速鑒別診斷、早期監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查及蜂產(chǎn)品中p.larvae和m.pluton的定量分析。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

<110>伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心、新疆出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心、伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院

<120>蜜蜂幼蟲腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測方法

<160>4

<210>1

<211>45

<212>rna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

p.larvaefctaatacatgcaagtcgagcgga

p.larvaerggtattagctcacgtttccgca

<210>2

<211>25

<212>rna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

p.larvaepfam-cttgtgtttctttcgggagacgcca-bhq1

<210>3

<211>43

<212>rna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

m.plutonfccatcagaaggggataacacttg

m.plutonratcgttgccttggtgagcct

<210>4

<211>25

<212>rna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

m.plutonpvic-cgcatgaagaggagttaaaaggcgc-bhq1