本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羊呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體雙重pcr專用引物及雙重pcr檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

羊泰勒蟲病(ovineandcaprinetheileriosis)是由泰勒科泰勒屬的原蟲寄生于綿羊和山羊巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)所引起的疾病的總稱，屬于一種由媒介蜱傳播的蜱傳性血液原蟲病(neitzwo1957，barnettsf1977，morelpcetal,1981)。泰勒蟲于1914年第一次在埃及被發(fā)現(xiàn)(littlewood1915)，而中國最早于1958年由楊輔國等報(bào)道了四川的羊泰勒蟲病(yangetal，1958)。該病能引起山羊和綿羊發(fā)熱、貧血癥和黃疸等臨床癥狀，使羊只發(fā)育遲緩，產(chǎn)肉量和產(chǎn)毛量顯著下降，并可引起羔羊和外來羊只大量死亡，從而限制了地方性養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和生產(chǎn)，到目前為止，已有六種羊泰勒蟲被報(bào)道，分別為致病力較強(qiáng)的萊氏泰勒蟲(theilerialestoquardi)、呂氏泰勒蟲(t.luwenshuni)和尤氏泰勒蟲(t.uilenbergi)，以及對(duì)羊致病力很弱或無致病性的綿羊泰勒蟲(t.ovis)、分離泰勒蟲(t.separata)和隱藏泰勒蟲(t.recondita)。其中t.luwenshuni、t.uilenbergi和t.ovis均在國內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)報(bào)道，我國東南地區(qū)、西北地區(qū)和中部地區(qū)的山羊和綿羊均有t.luwenshuni感染。

嗜吞噬細(xì)胞無漿體(a.phagocytophilum，ap)于1932年在蘇格蘭地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)，引起了羊的不明發(fā)熱，由于發(fā)現(xiàn)該病與牧草中的蜱蟲有關(guān)，將其稱為蜱傳熱病(tbf)。由a.phagocytophilum引起的人粒細(xì)胞無形體病(humangranulocyticanaplasmosis,hga)是人獸共患病，最初該病原被稱為人粒細(xì)胞埃立克體，后來將其重新分類歸屬于立克次體目，無漿體科，無漿體屬，更名為人粒細(xì)胞無漿體(a.phagocytophilum)，a.phagocytophilum具有廣泛的宿主群，包括人類、野生動(dòng)物和家畜等，是對(duì)人和動(dòng)物都有較強(qiáng)致病性的人畜共患病原體，屬于自然疫源性疾病，可引起反芻動(dòng)物的急性和慢性傳染病，a.phagocytophilum能誘導(dǎo)機(jī)體立即產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，介導(dǎo)免疫活性細(xì)胞及炎性因子對(duì)宿主細(xì)胞的攻擊，最終導(dǎo)致免疫抑制及潛在疾病引起的各種繼發(fā)感染和器官衰竭，患病特征主要表現(xiàn)為膽囊腫大、貧血、黃疸、高熱、消瘦，嚴(yán)重者甚至可以導(dǎo)致死亡。

a.phagocytophilum作為一種人和多種動(dòng)物的人獸共患病病原，具有公共衛(wèi)生學(xué)意義，受到人們的高度重視，嗜吞噬細(xì)胞無漿體病的發(fā)生呈季節(jié)分布，主要發(fā)生在媒介硬蜱活動(dòng)期間，在中國部分地區(qū)硬蜱、森林革蜱、長(zhǎng)角血蜱等都是嗜吞噬細(xì)胞無形體的傳播媒介，易感動(dòng)物和人經(jīng)感染幼蜱叮咬造成感染傳播。我國2006年在安徽省報(bào)告發(fā)現(xiàn)hga病病例，此后在山東、湖北、河南、浙江等省陸續(xù)有發(fā)病報(bào)道，在安徽、湖北等省家畜中都檢測(cè)到a.phagocytophilum，在新疆伊犁地區(qū)也有家畜感染該病的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種羊呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體雙重pcr專用引物及雙重pcr檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的是以下述方式實(shí)現(xiàn)的：

一種羊呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體雙重pcr專用引物，引物的核苷酸序列為：

羊呂氏泰勒蟲專用引物t.lu7：

t.lu7f：5’-tgctgcattgcatcttct-3’，如seqno.1所示；

t.lu7r：5’-agggacgtaatctgcacaag-3’，如seqno.2所示；

嗜吞噬細(xì)胞無漿體專用引物ssap2：

ssap2f：5’-gctgaatgtggggataatttat-3’，如seqno.3所示；

ssap2r：5’-atggctgcttcctttcggtta-3’，如seqno.4所示。

所述羊呂氏泰勒蟲專用引物t.lu7的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為962bp，嗜吞噬細(xì)胞無漿體專用引物ssap2的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為641bp。

利用上述的羊呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體雙重pcr專用引物進(jìn)行雙重pcr檢測(cè)的方法，包括以下步驟：

(1)待測(cè)樣品dna的提?。?/p>

(2)將引物對(duì)t.lu7和ssap2分別配置成濃度為25μm/l的溶液；

(3)以待測(cè)樣品dna為模板進(jìn)行雙重pcr擴(kuò)增：

pcr25μl擴(kuò)增反應(yīng)體系為：lataqdnapolymeras0.25μl，10×labuffer3.0μl，dntpmixture4.0μl，t.lu7f和t.lu7r各0.5μl，ssap2f和ssap2r各0.5μl，dna模板2.0μl，滅菌去離子水補(bǔ)足至25μl；

pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性35s，55℃退火35s，72℃延伸35s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；

(4)擴(kuò)增產(chǎn)物的判定方法：pcr反應(yīng)終止后，取5μlpcr產(chǎn)物，用1％瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果：擴(kuò)增得到962bp大小產(chǎn)物則判定為樣品中含有羊呂氏泰勒蟲，擴(kuò)增得到641bp大小產(chǎn)物則判定為樣品中含有嗜吞噬細(xì)胞無漿體。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明

(1)操作簡(jiǎn)單；只需一個(gè)反應(yīng)物體系進(jìn)行一次擴(kuò)增可同時(shí)檢測(cè)兩種病原，省時(shí)省力。

(2)結(jié)果判定簡(jiǎn)單；瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)962bp、641bp兩條目的條帶，可判斷感染兩種病原；只出現(xiàn)一條目的條帶可判斷感染了某一種病原：t.luwenshuni(962bp)或a.phagocytophilum(641bp)。

(3)本發(fā)明基于t.luwenshuni18srrna靶基因和a.phagocytophilum16srrna靶基因建立的雙重pcr方法特異性高。該法有著檢測(cè)速度快，敏感性高，特異性強(qiáng)、高效、低成本等優(yōu)點(diǎn)，適于兩種病原所引起疾病的流行病學(xué)調(diào)查和臨床確診。

附圖說明

圖1是不同lataq酶量雙重pcr擴(kuò)增結(jié)果：

m:dl2000maker；1-9：lataq酶量依次為:0.01μl、0.1μl、0.15μl、0.2μl、0.25μl、0.3μl、0.35μl、0.4μl、0.45μl；10：陰性對(duì)照。

圖2是不同10×labuffer量雙重pcr擴(kuò)增結(jié)果：

m:dl2000maker；1-9：10×labuffer量依次為0.5μl、1μl、1.5μl、2μl、2.5μl、3μl、3.5μl、4μl、4.5μl；10：陰性對(duì)照。

圖3是不同dntpmixture量雙重pcr擴(kuò)增結(jié)果：

m:dl2000maker；1-9：dntpmixture量依次為0.5μl、1.5μl、2μl、2.5μl、3μl、3.5μl、4μl、4.5μl、5μl；10：陰性對(duì)照。

圖4是不同引物量雙重pcr擴(kuò)增結(jié)果：

m:dl2000maker；1-6：引物配比依次為0.4:0.4、0.45:0.55、0.5:0.55、0.5:0.5、0.47:0.53；7：陰性對(duì)照。

圖5是不同循環(huán)次數(shù)雙重pcr擴(kuò)增結(jié)果：

m:dl2000maker；1-5：循環(huán)參數(shù)分別為20、25、30、35、40；6：陰性對(duì)照。

圖6是不同溫度梯度雙重pcr擴(kuò)增結(jié)果：

m:dl2000maker；1-12：退火溫度分別為51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃；13：陰性對(duì)照。

圖7是雙重pcr特異性試驗(yàn)結(jié)果：

m.dna標(biāo)準(zhǔn)dl2000：1.t.luwenshuni+ap；2.t.luwenshuni；3.ap；4.t.ovis；5.t.uilenbergi；6.t.annulata；7.a.ovis；8.a.bovis；9.a.marginale；10.b.motasi；11.t.gondii；12.ddh2o。

圖8是t.luwenshuni敏感性試驗(yàn)：

m:dl2000maker；1-9樣品稀釋倍數(shù)為：1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8；10.陰性對(duì)照。

圖9是a.phagocytophilum敏感性試驗(yàn)：

m:dl2000maker；1-13樣品稀釋倍數(shù)為：1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12；14.陰性對(duì)照。

圖10是雙重pcr敏感性試驗(yàn)：

m:dl2000maker；1-13樣品稀釋倍數(shù)為：1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12；14.陰性對(duì)照。

圖11是重復(fù)性試驗(yàn)雙重pcr擴(kuò)增結(jié)果：

m:dl2000maker；1-3.重復(fù)性；4.陰性對(duì)照。

圖12是雙重pcr檢測(cè)方法pcr擴(kuò)增結(jié)果：

m:dl2000maker；1-6.pcr產(chǎn)物；7.陽性對(duì)照；8.陰性對(duì)照。

圖13是引物t.lu7f/t.lu7rpcr擴(kuò)增t.luwenshuni18srrna基因結(jié)果：

m:dl2000maker；1-6.pcr產(chǎn)物。

圖14是引物ssap2f/ssap2rpcr擴(kuò)增a.phagocytophilum16srrna基因結(jié)果：

m:dl2000maker；1-5.pcr產(chǎn)物；6.陽性對(duì)照；7.陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，便于更好地理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明。

羊呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體雙重pcr專用引物的設(shè)計(jì)及雙重pcr檢測(cè)方法的研究

1.引物設(shè)計(jì)與合成

利用clustalx2.1序列分析軟件，將genbank中的羊theilerialuwenshuni18srrna序列(登錄號(hào)：kc735166.1)與其他物種同源序列進(jìn)行比對(duì)，用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)種特異性引物t.lu7f/t.lu7r，由上海生工生物工程股份有限公司合成；引用擴(kuò)增a.phagocytophilum種特異性引物ssap2f/ssap2r(kawaharametal.，2006)，引物詳情見表1。

表1雙重pcr引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

2.pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化

對(duì)pcr反應(yīng)體系中的酶、pcrbuffer、dntpmixture和引物的最佳濃度進(jìn)行優(yōu)化；并對(duì)最佳循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系及條件見表2-3。

表2雙重pcr25μl擴(kuò)增反應(yīng)體系

表3雙重pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件

lataqdnapolymerase量的優(yōu)化：在其他條件相同的情況下，在25μl反應(yīng)體系中，lataqdnapolymerase(5u/μl)加量分別為0.01、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45μl進(jìn)行pcr擴(kuò)增。結(jié)果最佳加量為0.25μl，濃度低影響合成產(chǎn)物量(見圖1)。

10×labuffer量的優(yōu)化：在其他條件相同的情況下，在25μl反應(yīng)體系中，10×lapcrbuffer加量分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5μl進(jìn)行pcr擴(kuò)增。結(jié)果最佳含量為3μl，過低則影響pcr效率(見圖2)。

dntpmixture量的優(yōu)化：在其他條件相同的情況下，在25μl反應(yīng)體系中，2.5mm的dntpmixture加量分別為0.5、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5μl進(jìn)行pcr擴(kuò)增。結(jié)果dntpmixture的含量為4μl時(shí)，擴(kuò)增效果較好(見圖3)。

對(duì)體系中引物的優(yōu)化：在其他條件相同的情況下，在25μl反應(yīng)體系中，濃度為25μm/l的引物t.lu7f/t.lu7r和ssap2f/ssap2r加量配比分別為(μl)：0.4:0.4；0.4:0.6；0.45:0.55；0.5:0.55；0.5:0.5；0.47:0.53進(jìn)行pcr擴(kuò)增。結(jié)果引物t.lu7f/t.lu7的含量為0.5μl，ssap2f/ssap2r的含量為0.5μl，擴(kuò)增效果較好(見圖4)。

對(duì)循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化：在其他條件相同的情況下，在25μl反應(yīng)體系中，循環(huán)參數(shù)分別為20、25、30、35、40進(jìn)行pcr擴(kuò)增。結(jié)果40個(gè)循環(huán)為該反應(yīng)的最適循環(huán)參數(shù)，隨循環(huán)次數(shù)的增加，擴(kuò)增的目的條帶逐漸增亮(見圖5)。

最適退火溫度的篩選：對(duì)呂氏泰勒蟲陽性和嗜吞噬細(xì)胞無漿體dna進(jìn)行溫度梯度雙重pcr擴(kuò)增，溫度梯度為51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃。根據(jù)不同退火溫度下目的條帶的亮度及有無非特異性條帶及交叉二聚體進(jìn)行綜合分析，確定該反應(yīng)體系的最適退火溫度。結(jié)果51℃-62℃均有特異性條帶擴(kuò)增，以55℃作為反應(yīng)參數(shù)中pcr的最適退火溫度(見圖6)

3.產(chǎn)物的回收、克隆及測(cè)序

用dna凝膠回收試劑盒將pcr產(chǎn)物回收，將回收產(chǎn)物與pmdl8-t載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh50α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選得到陽性菌斑擴(kuò)大培養(yǎng)，陽性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。應(yīng)用dnastar7.1軟件和blast工具將測(cè)得的核苷酸序列與genbank中的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果將羊呂氏泰勒蟲測(cè)序結(jié)果與genbank中登錄的相關(guān)參考序列的同源性為99.4％-99.9％。嗜吞噬細(xì)胞無漿體測(cè)序結(jié)果與genbank中登錄的相關(guān)參考序列的同源性為99.8％-100％。

4.特異性試驗(yàn)

分別提取呂氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲、尤氏泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲、綿羊無漿體、牛無漿體、邊緣無漿體、莫氏巴貝斯蟲、弓形蟲的基因組dna，作為特異性試驗(yàn)的模板。按最佳反應(yīng)體系及條件進(jìn)行pcr擴(kuò)增，來檢驗(yàn)該方法的特異性。結(jié)果以優(yōu)化好的雙重pcr體系和反應(yīng)條件，進(jìn)行特異性試驗(yàn)，羊呂氏泰勒蟲基因組dna出現(xiàn)962bp左右的條帶，嗜吞噬細(xì)胞無漿體基因組出現(xiàn)641bp左右的條帶，而綿羊泰勒蟲、尤氏泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲、綿羊無漿體、牛無漿體、邊緣無漿體、莫氏巴貝斯蟲、弓形蟲則未出現(xiàn)條帶(見圖7)。

5.敏感性試驗(yàn)

(1)羊呂氏泰勒蟲單pcr敏感性試驗(yàn)

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的羊呂氏泰勒蟲質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板濃度為291.3ng·μl^-1，d260/d280＝1.89，說明所提取的dna無蛋白和rna污染，將標(biāo)準(zhǔn)模板按1：10比例連續(xù)稀釋，按最佳反應(yīng)體系及條件進(jìn)行pcr擴(kuò)增，檢測(cè)最低dna檢測(cè)量。結(jié)果顯示，pcr可以檢測(cè)到羊呂氏泰勒蟲dna的最大稀釋倍數(shù)為1×10^-7，即最低可檢測(cè)到29.13fg·μl^-1(見圖8)。

(2)嗜吞噬細(xì)胞無漿體單pcr敏感性試驗(yàn)

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的嗜吞噬細(xì)胞無漿體質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板濃度153.4ng·μl^-1，d260/d280＝1.89，說明所提取的dna無蛋白和rna污染，將標(biāo)準(zhǔn)模板按1：10比例連續(xù)稀釋，按最佳反應(yīng)體系及條件進(jìn)行pcr擴(kuò)增，檢測(cè)最低dna檢測(cè)量。結(jié)果顯示，pcr可以檢測(cè)到嗜吞噬無漿體dna的最大稀釋倍數(shù)為1×10^-10，即最低可檢測(cè)到15.34ag·μl^-1(見圖9)。

(3)雙重pcr檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)

按雙重pcr最佳反應(yīng)體系及條件進(jìn)行pcr擴(kuò)增，檢測(cè)雙重pcr中羊呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體最低dna檢測(cè)量。結(jié)果顯示，pcr可以檢測(cè)到羊呂氏泰勒蟲dna的最大稀釋倍數(shù)為1×10^-7，即最低可檢測(cè)到29.13fg·μl-1；嗜吞噬無漿體dna的最大稀釋倍數(shù)為1×10^-8，即最低可檢測(cè)到1.534fg·μl^-1(見圖10)。

6.重復(fù)性試驗(yàn)

以羊呂氏泰勒蟲陽性樣品和嗜吞噬細(xì)胞無漿體陽性樣品為模板，用優(yōu)化好的pcr反應(yīng)體系及條件進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，檢驗(yàn)所建立方法的穩(wěn)定性。結(jié)果用所建立的pcr方法，以羊呂氏泰勒蟲陽性樣品和嗜吞噬細(xì)胞無漿體dna模板進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，均可擴(kuò)增出特異片段(見圖11)。

7.臨床應(yīng)用

用本試驗(yàn)建立的方法對(duì)采自洛陽宜陽趙堡鄉(xiāng)的54份羊血液dna樣品進(jìn)行pcr檢測(cè)，單pcr擴(kuò)增t.luwenshuni陽性率為85.19％(46/54)，a.phagocytophilum陽性率為83.33％(45/54)，混合感染陽性率為72.22％(39/54)；雙重pcr擴(kuò)增t.luwenshuni陽性率為87.04％(47/54)，a.phagocytophilum陽性率為55.56％(30/54)，混合感染陽性率為50％(27/54)；雙重pcr引物、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件分別見表1、2、3，檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4；部分圖片見圖12-14。

表4雙重pcr與單pcr檢測(cè)方法臨床檢測(cè)結(jié)果

0.01＜p＜0.05。

sequencelisting

<110>河南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種羊呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無漿體雙重pcr專用引物及雙重pcr檢測(cè)方法

<130>1

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgctgcattgcatcttct18

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agggacgtaatctgcacaag20

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gctgaatgtggggataatttat22

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

atggctgcttcctttcggtta21