本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于檢測鑒別華支睪吸蟲和/或扇棘單睪吸蟲的引物組及試劑盒。

背景技術(shù)：

華支睪吸蟲(clonorchissinensis)寄生在人體肝內(nèi)膽管，可引起華支睪吸蟲病(clonorchiasis)甚至膽管癌。華支睪吸蟲病的發(fā)生和流行主要與人群嗜食生的淡水魚類等食物的飲食習(xí)慣有關(guān)。據(jù)調(diào)查，在華支睪吸蟲病流行嚴重的廣西，其人群華支睪吸蟲平均感染率為9.76％；其中個別流行縣的人群感染率甚至超過20％。扇棘單睪吸蟲(haplorchistaichui)是一種寄生在腸道的異形吸蟲科的吸蟲。扇棘單睪吸蟲在廣西等地的華支睪吸蟲流行區(qū)人群中普遍感染。根據(jù)調(diào)查，廣西某些肝吸蟲病流行區(qū)人群，扇棘單睪吸蟲感染率高達71.4％。華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲對人體的危害程度差別很大，前者對人體危害嚴重，且治療較困難；而后者對人體危害輕微，治療容易。因此，二者的鑒別診斷非常重要。

華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲成蟲的大小和形態(tài)差別很大，容易鑒別。目前，人體華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲感染的診斷主要依靠糞便蟲卵檢查。但二者的蟲卵在大小和形態(tài)上非常接近，通過“kato-katz”法或“醛-醚”法等常規(guī)糞便蟲卵檢查很難從形態(tài)上區(qū)分，往往不能做出明確的鑒別診斷，嚴重影響臨床治療和疾病監(jiān)測。

通過pcr法檢測華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲dna是一種高效、特異的鑒別診斷方法。目前，可通過基于華支睪吸蟲核糖體dnaits區(qū)和/或cox1(cytochromecoxidasesubunit1)基因以及扇棘單睪吸蟲5.8srdna的pcr法明確鑒別出這兩種吸蟲，但該技術(shù)的缺陷在于：需要針對不同檢測靶基因，分別在2個pcr反應(yīng)體系中進行pcr擴增反應(yīng)；檢測過程存在操作繁瑣，效率低下的缺陷；由于針對不同基因進行pcr擴增，鑒別檢測結(jié)果存在偏差的可能。綜合認為，目前鑒別華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲的pcr檢測引物和方法不適合實際的臨床診斷和疾病監(jiān)測工作。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種引物組，并提供了包含該引物組的試劑盒以及其使用方法。所述引物組能夠在同一個反應(yīng)體系中高效、快速地對擴增華支睪吸蟲及扇棘單睪吸蟲的相關(guān)基因，并且可以根據(jù)擴增結(jié)果準確地對上述兩種寄生蟲進行鑒定位點進行檢測鑒別。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種用于檢測鑒別華支睪吸蟲和/或扇棘單睪吸蟲的引物組，選自seqidno:1～4所示的核苷酸序列。

本發(fā)明通過大量研究分析對比，優(yōu)選一個基因作為pcr法鑒別華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲的靶基因；并通過優(yōu)化引物設(shè)計，實現(xiàn)在單管pcr反應(yīng)體系內(nèi)同時檢測這兩種吸蟲。本發(fā)明成功解決了針對不同基因進行華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲pcr鑒別診斷的偏差，以及分別進行pcr擴增反應(yīng)的操作繁瑣和效率低下等問題。

本發(fā)明提供的引物組通過巧妙的引物設(shè)計，避免華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲的擴增產(chǎn)物在分子量大小上出現(xiàn)重疊，使擴增結(jié)果簡單明確、一目了然，從而可以快速、準確地根據(jù)檢測結(jié)果對兩種寄生蟲進行檢測鑒別。本發(fā)明上述2對上下游引物具有特異性好、擴增效率高的優(yōu)點，在pcr擴增過程中不會形成引物二聚體、非特異擴增和交叉反應(yīng)，避免非目的產(chǎn)物的出現(xiàn)對結(jié)果的影響，同時擴增效率高，檢測信號強。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測鑒別華支睪吸蟲和/或扇棘單睪吸蟲的試劑盒，試劑盒可以包括儲存反應(yīng)試劑(例如在合適容器中的引物、探針、酶等)和/或支持材料(例如緩沖液、試驗檢測的說明書等)。例如，所述試劑盒包括如上所訴的引物組以及pcr反應(yīng)緩沖液、dntps、dna聚合酶、水、上樣緩沖液和dna分子量內(nèi)標中的一種或多種。

本發(fā)明提供的試劑盒還可包含除本發(fā)明的引物組之外的其他任何引物組和/或探針，以上內(nèi)容不能理解為限制適用于本發(fā)明的試劑盒及其內(nèi)容物。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述引物組混合在一起；

更優(yōu)選的，核苷酸序列如seqidno:1～4所示的引物的摩爾濃度比為(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2)；

更優(yōu)選的，核苷酸序列如seqidno:1～4所示的引物的摩爾濃度比為1:1:1:1。

本發(fā)明上述引物組對各引物的摩爾比進行限定，在該摩爾比范圍內(nèi)，pcr反應(yīng)的擴增信號強。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述dna聚合酶選自taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4dna聚合酶以及klenow片段中的一種或多種。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述上樣緩沖液選自甲酰胺和/或去離子甲酰胺。

本發(fā)明還涉及一種檢測鑒別華支睪吸蟲和/或扇棘單睪吸蟲的方法，包括：

1)、提取待檢樣本的dna；

2)、用權(quán)利要求1所述的引物組或權(quán)利要求2～5任一項所述的試劑盒對所述待檢樣本的dna進行擴增；

3)、對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測；

若出現(xiàn)328bp的條帶，則說明待檢樣本中含有華支睪吸蟲；若出現(xiàn)200bp的條帶，則說明待檢樣本中僅含有扇棘單睪吸蟲。

所述方法為診斷和/或非診斷目的的檢測鑒別。

其中，可選的，如上所述的方法，在步驟1)提取待檢樣本的dna后，還可以通過本領(lǐng)域常規(guī)的純化方法對dna進行純化。

優(yōu)選的，如上所述的方法，提取待檢樣本的dna的提取方法包括飽和苯酚-氯仿法、樹脂提取法或磁珠提取法。

基于引物tm值選擇合適的pcr反應(yīng)條件的方法是本領(lǐng)域所公知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)引物長度、gc含量、目標特異性和靈敏度、所使用的聚合酶性質(zhì)等，選出最佳條件。例如在步驟2)中，擴增時的退火溫度為53℃～57℃，反應(yīng)循環(huán)33～37次；更優(yōu)選的，退火溫度為55℃，反應(yīng)循環(huán)35次。

優(yōu)選的，如上所述的方法，在步驟2)中，擴增時的反應(yīng)體系中所述引物組中各引物的濃度均為0.3μm～0.5μm；還可以選擇0.4μm。

優(yōu)選的，如上所述的方法，在步驟3)中，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測時采用2％～3％質(zhì)量分數(shù)的瓊脂糖凝膠。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)、本發(fā)明所用引物特異性好，擴增效率高，靈敏度高，假陰性率低，所需模板量較少即可完成pcr反應(yīng)。

2)、各條引物之間不會形成引物二聚體，且具有相同的tm值，可在一個pcr反應(yīng)中同時完成華支睪吸蟲及扇棘單睪吸蟲的鑒別，提高了檢測鑒別效率，降低了檢測鑒別成本。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為用單純pcr法擴增華支睪吸蟲dna的電泳圖；1～8為華支睪吸蟲陽性dna樣品；9～12為陰性對照dna樣品；13為無dna模板空白對照；m：100bpdna分子量標記；

圖2為用單純pcr法擴增扇棘單睪吸蟲dna的電泳圖；1～8為扇棘單睪吸蟲陽性dna樣品；9～12為陰性對照dna樣品；13為無dna模板空白對照；m：100bpdna分子量標記；

圖3為用單管pcr法同時擴增華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲dna；1～8為華支睪吸蟲陽性dna樣品；9～16為扇棘單睪吸蟲陽性dna樣品；17～20為陰性對照dna樣品；21為無dna模板空白對照；m：100bpdna分子量標記。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

根據(jù)我們長期的檢測實踐，對于dna模板含量低(<1.0ng/μl)的標本，用cox1基因進行pcr擴增的靈敏度明顯高于基于its1、its2區(qū)的pcr擴增。本項發(fā)明是基于從消化處理后的成蟲、囊蚴和蟲卵等標本中用常規(guī)方法提取純化出的吸蟲基因組dna，通過前期大量對比實驗優(yōu)選出cox1基因作為pcr法鑒別華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲的靶基因。通過優(yōu)化引物設(shè)計，優(yōu)選出2對高度特異性和靈敏性的pcr檢測引物；通過優(yōu)化pcr反應(yīng)體系和條件成功地實現(xiàn)在單管內(nèi)同時檢測兩種吸蟲的dna。

具體pcr檢測過程如下：

1.dna提?。喝〕上x、分離后的囊蚴和含蟲卵糞便等標本，用常規(guī)試劑和方法提取dna。

2.pcr檢測引物設(shè)計：分別基于華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲cox1基因設(shè)計pcr引物。引物設(shè)計時分別使華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲pcr擴增產(chǎn)物長度在200～400bp之間，并保證二者之間長度差別大于100bp，目的是使其二者的電泳條帶之間容易區(qū)分。檢測引物如表1所示。

表1華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲cox1基因單管pcr檢測引物

3.pcr反應(yīng)體系：采用單管反應(yīng)體系分別或同時檢測華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲dna。具體pcr反應(yīng)體系如表2所示。

表2華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲單管pcr反應(yīng)體系

4.pcr反應(yīng)條件：按照以下條件進行。

dna模板預(yù)變性：94℃，5分鐘；1個循環(huán)

pcr擴增：94℃，30秒；

55℃，30秒；

72℃，30秒；共35個循環(huán)

延伸：72℃，5分鐘，1個循環(huán)

反應(yīng)結(jié)束。

5.pcr產(chǎn)物檢測：pcr反應(yīng)產(chǎn)物用2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。每孔加樣量為5～10μl。用100bpdna分子量標記指示條帶大小。

用華支睪吸蟲特異性引物對8份華支睪吸蟲dna陽性標本進行pcr擴增，結(jié)果均出現(xiàn)明顯的特異性陽性反應(yīng)條帶(如圖1所示)。用扇棘單睪吸蟲特異性引物對8份扇棘單睪吸蟲dna陽性標本進行pcr擴增，結(jié)果也出現(xiàn)明顯的特異性陽性反應(yīng)條帶(如圖2所示)。而對4份陰性對照dna樣品(為其它類吸蟲雜囊蚴來源的dna)的檢測均未出現(xiàn)陽性反應(yīng)(如圖1、圖2所示)。

然后，用華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲特異性引物在單管內(nèi)，按照表2所示反應(yīng)體系對上述20份dna樣品進行pcr擴增。結(jié)果顯示：用此單管反應(yīng)體系和反應(yīng)條件可同時對華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲cox1基因進行擴增，其相互間無任何交叉反應(yīng)和干擾(如圖3所示)。

6.同時鑒別華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲的單管pcr檢測引物組合的應(yīng)用：對于用形態(tài)學(xué)方法鑒別不清的華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲囊蚴(來源于淡水魚類等)以及糞便原始標本(內(nèi)含華支睪吸蟲蟲卵、扇棘單睪吸蟲的成蟲或蟲卵)，可首先用普通商用dna提取試劑或其它經(jīng)典方法提取dna；然后用該2對優(yōu)化的pcr檢測引物組合，配合常規(guī)pcr擴增試劑，在單管內(nèi)進行pcr擴增反應(yīng)，可實現(xiàn)對華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲感染的快速鑒別診斷。該項發(fā)明專利對于臨床疾病診斷和疾病預(yù)防控制均有重要價值和意義。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。

sequencelisting

<110>廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心

<120>用于檢測鑒別華支睪吸蟲和或扇棘單睪吸蟲的引物組及試劑盒

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcctatagtgaaaagcacca20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gttaatattgccggggtttg20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tgggttggatgttaagacg19

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

aagaagacaacacaatcccg20