本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2014年6月24日、申請(qǐng)?zhí)枮?01410289048.9和發(fā)明名稱(chēng)為“cxcl4單抗治療腫瘤及化療后腫瘤加速再增殖基因篩選法”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種cxcl4單抗治療腫瘤及化療后腫瘤加速再增殖基因篩選法。

背景技術(shù)：

腫瘤放化療誘發(fā)的腫瘤“加速再增殖”現(xiàn)象：放化療仍然是腫瘤的最常用治療手段，其主要抗腫瘤機(jī)理是產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致大量腫瘤細(xì)胞死亡。通常認(rèn)為這一過(guò)程中瀕死的或已經(jīng)死亡的細(xì)胞會(huì)被周?chē)婊畹募?xì)胞或巨噬細(xì)胞等清除細(xì)胞消化吸收，而如果有少量的腫瘤細(xì)胞存活下來(lái)，估計(jì)會(huì)慢慢的增殖、逐漸的導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。40年前就開(kāi)始有文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤在放療后開(kāi)啟了被稱(chēng)為“加速再增殖(acceleratedrepopulation)”的過(guò)程，這一過(guò)程中，在放療打擊下逃逸的少量腫瘤細(xì)胞存活下來(lái)，并能以更加快的增殖速度重建嚴(yán)重受損的腫瘤組織(hermens,a.f.&barendsen,g.w.changesofcellproliferationcharacteristicsinaratrhabdomyosarcomabeforeandafterx-irradiation.eur.j.cancer,5:173–189,1969.)，(stephens,t.c.,currie,g.a.&peacock,j.h.repopulationofgamma-irradiatedlewislungcarcinomabymalignantcellsandhostmacrophageprogenitors.br.j.cancer,38:573–582,1978.)。最近，發(fā)明人課題組在荷瘤小鼠模型上也觀察到了化療后，殘余腫瘤細(xì)胞“加速再增殖”的現(xiàn)象。這種本領(lǐng)域技術(shù)人員在分子水平知之甚少的“加速再增殖”現(xiàn)象在目前化療和放療過(guò)程中發(fā)揮著主要作用。

治療后腫瘤“加速再增殖”分子機(jī)理是亟需解決的腫瘤學(xué)重大科學(xué)問(wèn)題：研究人員為了闡明腫瘤放化療后加速再增殖的分子機(jī)理已經(jīng)做了大量的研究。最近，我國(guó)科學(xué)家首次報(bào)道在放療條件下死亡腫瘤細(xì)胞在凋亡過(guò)程中產(chǎn)生生長(zhǎng)刺激信號(hào)從而刺激殘余腫瘤細(xì)胞加速再增殖(huangq,lif,liux,etal.caspase3-mediatedstimulationoftumorcellrepopulationduringduringcancerradiotherapy.natmed,17:860-6,2011.)。他們進(jìn)一步研究顯示caspase3這一凋亡過(guò)程關(guān)鍵蛋白參與了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)刺激。caspase3調(diào)節(jié)的下游信號(hào)蛋白前列腺素e2(pge2)能夠刺激存活腫瘤細(xì)胞的增殖。在腫瘤細(xì)胞或腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中拮抗caspase3可以提高異種移植腫瘤或小鼠腫瘤對(duì)放療的敏感性。臨床上癌癥患者腫瘤組織中高水平活化狀態(tài)的caspase3與病人腫瘤高復(fù)發(fā)率和高死亡率存在顯著相關(guān)性。他們的研究揭示了caspase3在放療后腫瘤加速再增殖通路中扮演了關(guān)鍵角色(huangq,lif,liux,etal.caspase3-mediatedstimulationoftumorcellrepopulationduringduringcancerradiotherapy.natmed,17:860-6,2011.)。揭示了放療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有細(xì)胞毒和加速再生長(zhǎng)的雙重作用和作用機(jī)理。特別是“加速再增殖”作用，并不是放療的直接作用，而是通過(guò)上調(diào)了caspase3實(shí)現(xiàn)的。因此，靶向“加速再增殖”通路的關(guān)鍵分子caspase3提供了抑制放療后“加速再增殖”的作用，從而也提高了腫瘤對(duì)放療的敏感性。靶向caspase3有可能成為新的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)，而具有社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

化療藥物除了直接的細(xì)胞毒作用外，還可作用于機(jī)體的免疫系統(tǒng)影響其發(fā)揮抗腫瘤活性。最新研究報(bào)道(bruchardm,mignotg,ghiringhellif,etal.chemotherapy-triggeredcathepsinbreleaseinmyeloid-derivedsuppressorcellsactivatesthenlrp3inflammasomeandpromotestumorgrowth.natmed,19:57-64,2013.)，臨床常用的兩個(gè)化療藥物吉西他濱和5-fu，能夠激活nod樣受體家族，即髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derivedsuppressorcell，mdsc)中的pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(nlrp3)依賴(lài)的caspase-1激活復(fù)合物(也稱(chēng)為炎癥體-inflammasome)，導(dǎo)致mdsc高表達(dá)白細(xì)胞介素-1(il-1)。il-1會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)cd4+t細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-17(il-17)，il-17通過(guò)促進(jìn)腫瘤組織血管生成導(dǎo)致化療后腫瘤“加速再增殖”。相應(yīng)地，當(dāng)腫瘤建立在nlrp3-/-、caspase1-/-小鼠或用白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(il-1ra，拮抗il-1)處理的野生型小鼠上時(shí)，化療后腫瘤“加速再增殖”作用受到抑制，使得化療能夠發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用(bruchardm,mignotg,ghiringhellif,etal.chemotherapy-triggeredcathepsinbreleaseinmyeloid-derivedsuppressorcellsactivatesthenlrp3inflammasomeandpromotestumorgrowth.natmed,19:57-64,2013.)。研究結(jié)果揭示了化療對(duì)抗腫瘤細(xì)胞毒和“加速再增殖”的雙重作用，對(duì)后者的分子機(jī)理研究證實(shí)其并不是化療藥物直接對(duì)腫瘤的作用，而是通過(guò)作用于腫瘤組織中的mdsc間接提高腫瘤血管再生、增加腫瘤組織血液供應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。因此，化療后腫瘤“加速再增殖”通路中的關(guān)鍵分子為開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了新靶點(diǎn)和新思路，如文章中提到的il-1ra的應(yīng)用即可抑制化療后腫瘤“加速再增殖”從而提供化療抗腫瘤效果。

這些研究揭示了放化療后腫瘤“加速再增殖”的一些重要機(jī)制。然而，最近研究還表明一些化療藥物反而能夠通過(guò)清除免疫抑制細(xì)胞增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答(mattarollo,s.r.etal.pivotalroleofinnateandadaptiveimmunityinanthracyclinechemotherapyofestablishedtumors.cancerres,71:4809–4820,2011.)?；熕幬?-fu能夠選擇性地清除mdsc(vincent,j.etal.5-fluorouracilselectivelykillstumor-associatedmyeloid-derivedsuppressorcellsresultinginenhancedtcell–dependentantitumorimmunity.cancerres,70:3052–3061,2010.)，而mdscs是一類(lèi)不成熟的骨髓細(xì)胞，能夠抑制人類(lèi)和小鼠t細(xì)胞的活化(gabrilovich,d.i.&nagaraj,s.myeloid-derivedsuppressorcellsasregulatorsoftheimmunesystem.nat.rev.immunol,9:162–174,2009.)。5-fu介導(dǎo)的mdsc清除還不足以避免化療后腫瘤“加速再增殖”。因而，揭示導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞“加速再增殖”的另外分子通路非常必要。

cxcl4(pf-4)是最早發(fā)現(xiàn)存在于血小板α-顆粒中的肝素結(jié)合蛋白，同時(shí)其它多種細(xì)胞均能夠表達(dá)cxcl4(kasperb,petersenf.molecularpathwaysofplateletfactor4/cxcl4signaling.eurjcellbiol,90:521-26,2011.)。cxcl4的受體是cxc趨化因子受體3(cxcr3)，cxcr3是七次跨膜的g蛋白耦聯(lián)受體超家族成員。人cxcr3受體可分為兩種亞型cxcr3-a和cxcr3-b。目前已經(jīng)在t細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了cxcr3-b的表達(dá)，而cxcl4的特異性受體是cxcr3-b。趨化因子cxcl4受體cxcr3在淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，能夠通過(guò)激活多條信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。多項(xiàng)研究證實(shí)，cxcl4及其受體對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有著顯著的影響，且cxcl4已作為結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的生物標(biāo)記物(pilatovak,greplovak,zdrazilova-dubskal,etal.roleofplateletchemokines,pf-4andctap-iii,incancerbiology.jhematoloncol,6:42,2013.)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種cxcl4單抗治療腫瘤及化療后腫瘤加速再增殖基因篩選法；具體涉及抗cxcl4單克隆抗體的用途及腫瘤化療后加速再增殖基因簇的篩選方法；所述抗cxcl4單克隆抗體用于抑制高表達(dá)cxcl4的腫瘤加速再增殖。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明涉及一種抗cxcl4單克隆抗體在制備抑制腫瘤增殖藥物中的用途。

優(yōu)選的，所述用途具體為在制備抑制化療引起的cxcl4高表達(dá)的腫瘤增殖藥物中的用途。

優(yōu)選的，所述抗cxcl4單克隆抗體與化療時(shí)采用的化療藥物聯(lián)合用藥。

優(yōu)選的，所述抗cxcl4單克隆抗體在化療后cxcl4表達(dá)水平達(dá)到最高前施用。

優(yōu)選的，所述化療時(shí)采用的化療藥物為細(xì)胞周期依賴(lài)性化療藥。

優(yōu)選的，所述化療藥物為5-fu。

優(yōu)選的，所述抗cxcl4單克隆抗體與5-fu聯(lián)合用藥。

優(yōu)選的，所述5-fu用藥后4天以?xún)?nèi)，進(jìn)行抗cxcl4單克隆抗體給藥。

優(yōu)選的，所述腫瘤為cxcl4高表達(dá)的腫瘤或化療引起的cxcl4高表達(dá)的腫瘤。

優(yōu)選的，所述腫瘤為5-fu敏感型腫瘤。

優(yōu)選的，所述腫瘤為消化道腫瘤。

優(yōu)選的，所述腫瘤為胃癌。

優(yōu)選的，所述腫瘤為結(jié)腸癌腫瘤。

第二方面，本發(fā)明還涉及一種腫瘤化療后加速再增殖基因簇的篩選方法，包括如下步驟：

a、建立荷瘤動(dòng)物模型或體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)；

b、給予不同的化療藥物或化療藥物的組合；

c、化療后，在不同時(shí)間點(diǎn)取腫瘤樣本；

d、用基因表達(dá)芯片篩查獲得腫瘤組織基因表達(dá)譜；

e、生物信息學(xué)分析獲得有表達(dá)規(guī)律的基因作為腫瘤化療后加速再增殖候選基因；

f、對(duì)所述候選基因開(kāi)展系統(tǒng)的藥效藥理研究，確認(rèn)影響腫瘤化療后加速再增殖的關(guān)鍵基因。

第三方面，本發(fā)明還涉及一種cxcl4在制備抑制腫瘤增殖藥物中的用途。

優(yōu)選地，所述用途具體為：cxcl4作為腫瘤增殖的靶點(diǎn)在制備抑制腫瘤增殖藥物中的用途。

優(yōu)選地，所述用途包括如下步驟：獲取能夠與cxcl4或cxcl4下游信號(hào)中和的結(jié)合物，使用所述結(jié)合物中和cxcl4靶點(diǎn)或下游信號(hào)，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤增殖。

優(yōu)選地，所述結(jié)合物為以cxcl4為抗原制備的抗體，或所述抗體的片段，或所述抗體的融合蛋白。

優(yōu)選地，所述結(jié)合物為以cxcl4受體為抗原制備的抗體，或所述抗體的片段，或所述抗體的融合蛋白。

優(yōu)選地，所述cxcl4受體為cxcr3，或cxcr3a，或cxcr3b。

優(yōu)選地，所述結(jié)合物為cxcl4受體，或cxcl4受體的可溶性受體，或cxcl4受體的受體融合蛋白；

所述cxcl4受體為cxcr3，cxcr3a，或cxcr3b。

優(yōu)選地，所述結(jié)合物為cxcl4突變體，所述cxcl4突變體能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合cxcl4受體，同時(shí)不引起受體激活。

優(yōu)選地，所述結(jié)合物為靶向cxcl4，或靶向cxcl4受體，或靶向下游信號(hào)成員的mrna。

優(yōu)選地，所述結(jié)合物為以cxcl4，或以cxcl4的受體，或以cxcl4下游通路成員為靶標(biāo)篩選獲得的拮抗劑。

腫瘤在化療后會(huì)開(kāi)啟被稱(chēng)為“加速再增殖”的過(guò)程，即在化療打擊下逃逸的腫瘤細(xì)胞存活下來(lái)，并能以更加快的速度增殖?；蛐蜎Q定表型，在腫瘤細(xì)胞或組織化療后加速再增殖的過(guò)程中，必然存在化療誘導(dǎo)激活的起內(nèi)在調(diào)控驅(qū)動(dòng)作用的加速再增殖基因簇。加速再增殖基因簇可能起正向調(diào)控或負(fù)向調(diào)控作用，所以腫瘤細(xì)胞或組織在不同的化療藥物或化療藥物的組合的作用下，在不同的時(shí)間點(diǎn)加速再增殖基因簇會(huì)發(fā)生與腫瘤細(xì)胞或組織生長(zhǎng)速度一致或完全相反的規(guī)律性波動(dòng)，這種基因表達(dá)水平的規(guī)律性改變能夠在全基因組表達(dá)芯片上顯示出來(lái)。根據(jù)基因表達(dá)芯片篩查化療后基因在腫瘤組織表達(dá)差異，經(jīng)大規(guī)模生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析和判斷，對(duì)候選基因進(jìn)行表達(dá)確證，從而獲得參與化療后“加速再增殖”候選基因。

本發(fā)明中涉及的腫瘤化療后加速再增殖基因簇篩選方法能大規(guī)模的篩選出不同腫瘤在不同化療藥物或化療藥物的組合作用下與腫瘤化療后加速再增殖有關(guān)的基因簇，從而為臨床針對(duì)不同腫瘤不同化療手段提供聯(lián)合化療治療新方案。

本發(fā)明中涉及的抗cxcl4單克隆抗體的用途即是本發(fā)明中涉及的腫瘤化療后加速再增殖基因簇篩選方法的應(yīng)用實(shí)例，本發(fā)明用小鼠結(jié)腸癌模型，對(duì)可能參與化療后腫瘤“加速再增殖”基因簇進(jìn)行了系統(tǒng)篩查。取皮下小鼠ct26結(jié)腸癌5-fu化療后不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤組織，制備全基因組表達(dá)譜芯片，根據(jù)基因表達(dá)芯片篩查化療后基因在腫瘤組織表達(dá)差異，經(jīng)大規(guī)模數(shù)據(jù)分析和判斷，對(duì)候選基因進(jìn)行表達(dá)確證，從而獲得參與化療后“加速再增殖”候選基因。最終將研究重點(diǎn)聚焦到趨化因子家族，篩選出了趨化因子cxcl4。cxcl4在5-fu化療后表現(xiàn)出顯著的先上升后下降的表達(dá)特點(diǎn)，提示其可能參與結(jié)腸癌化療后“加速再增殖”的過(guò)程。本發(fā)明闡明了cxcl4在腫瘤化療后“加速再增殖”的分子機(jī)理，并通過(guò)干預(yù)此機(jī)理提供聯(lián)合化療治療結(jié)腸癌新方案。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果為：本發(fā)明通過(guò)應(yīng)用結(jié)腸癌荷瘤小鼠5-fu化療模型，揭示cxcl4表達(dá)變化與結(jié)腸癌5-fu化療后“加速再增殖”之間的關(guān)系，闡明cxcl4參與化療后腫瘤“加速再增殖”過(guò)程中的分子機(jī)制，完成拮抗cxcl4(使用自主研發(fā)的cxcl4單克隆抗體)協(xié)同5-fu抑制結(jié)腸癌細(xì)胞再增殖的藥效藥理研究，為成功開(kāi)發(fā)cxcl4抗體藥物提供依據(jù)。

同時(shí)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的cxcl4參與化療后腫瘤“加速再增殖”過(guò)程中的分子機(jī)制具有開(kāi)創(chuàng)意義，cxcl4能夠起到腫瘤增殖靶點(diǎn)的作用，進(jìn)而能夠通過(guò)作用該靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤的相關(guān)治療工作；與靶點(diǎn)作用的機(jī)制有很多種，這些機(jī)制均能應(yīng)用于本發(fā)明，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤增殖的效果；這些機(jī)制包括但不限于以下：

獲能夠與cxcl4或cxcl4下游信號(hào)中和的結(jié)合物，使用所述結(jié)合物中和cxcl4靶點(diǎn)或下游信號(hào)，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤增殖；

進(jìn)一步地，結(jié)合本領(lǐng)域常識(shí)可知，能夠作用靶點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤的機(jī)制還包括：

獲取能夠與cxcl4或cxcl4下游信號(hào)中和的結(jié)合物，使用所述結(jié)合物中和cxcl4靶點(diǎn)或下游信號(hào)，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤增殖，所述結(jié)合物可為：

所述結(jié)合物為以cxcl4為抗原制備的抗體，或所述抗體的片段，或所述抗體的融合蛋白。

所述結(jié)合物為以cxcl4受體為抗原制備的抗體，或所述抗體的片段，或所述抗體的融合蛋白。

所述cxcl4受體為cxcr3，或cxcr3a，或cxcr3b。

所述結(jié)合物為cxcl4受體，或cxcl4受體的可溶性受體，或cxcl4受體的受體融合蛋白；所述cxcl4受體為cxcr3，cxcr3a，或cxcr3b。

所述結(jié)合物為cxcl4突變體，所述cxcl4突變體能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合cxcl4受體，同時(shí)不引起受體激活。

所述結(jié)合物為靶向cxcl4，或靶向cxcl4受體，或靶向下游信號(hào)成員的mrna。

所述結(jié)合物為以cxcl4，或以cxcl4的受體，或以cxcl4下游通路成員為靶標(biāo)篩選獲得的拮抗劑。

顯然，能夠與本發(fā)明要求保護(hù)的cxcl4靶點(diǎn)作用的機(jī)制，相關(guān)物質(zhì)都應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，并不限于以上列舉的內(nèi)容，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以確定的。

本發(fā)明的成功實(shí)施，為結(jié)直腸癌新藥研發(fā)提供新靶點(diǎn)和新抗體藥物，為結(jié)直腸癌藥物治療提供新思路；因而，具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：

圖1為對(duì)ct26荷瘤小鼠一次性注射5-fu(200mg/kg)，化療后第0、2、4、6、8天皮下腫瘤體積的測(cè)量結(jié)果圖；

圖2為5-fu(200mg/kg)化療后第0、2、4、6、8天ct26腫瘤組織切片he染色結(jié)果示意圖；

圖3為對(duì)ct26荷瘤小鼠一次性注射5-fu(200mg/kg)，化療后皮下腫瘤組織的檢測(cè)結(jié)果示意圖；其中，a為基因芯片結(jié)果顯示的腫瘤組織中cxcl4mrna水平在5-fu化療后的趨勢(shì)圖，b為rt-pcr檢測(cè)ct26腫瘤化療后第4天組織中cxcl4在基因水平的表達(dá)變化示意圖(n＝3)(**p<0.01vs第0天)；

圖4為對(duì)體外培養(yǎng)ct26細(xì)胞和mfc細(xì)胞5-fu(200mg/kg)或l-ohp(30μg/ml)孵育后，rt-pcr檢測(cè)cxcl4mrna表達(dá)量變化示意圖(n＝3,*p<0.05，**p<0.01)；其中，a.5-fu孵育ct26細(xì)胞，b.l-ohp孵育ct26細(xì)胞，c.5-fu孵育mfc細(xì)胞，d.l-ohp孵育mfc細(xì)胞；

圖5為mtt法檢測(cè)rhcxcl4對(duì)ct26細(xì)胞和iec-6細(xì)胞的增殖作用示意圖(**p<0.01,***p<0.001)；其中，a為不同濃度的rhcxcl4(0-3μg/ml)對(duì)iec-6細(xì)胞的增殖作用示意圖，b為不同濃度的rhcxcl4(0-3μg/ml)對(duì)ct26細(xì)胞的增殖作用示意圖；

圖6為anti-cxcl4mab特性的鑒定示意圖；其中，a為sds/page(8％)(a)與westernblotting(b)方法分析純化的anti-cxcl4mab，b為biacore方法分析anti-cxcl4mab的親和力，c為rhcxcl4對(duì)achn細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用示意圖，d為anti-cxcl4mab拮抗rhcxcl4(72.6μg/ml)對(duì)achn細(xì)胞的抑制作用示意圖；

圖7為抗cxcl4單抗聯(lián)合5-fu對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用示意圖；其中，a為各組小鼠腫瘤體積大小變化示意圖，b為各組小鼠死亡變化情況示意圖，c為化療對(duì)照組與化療加單抗給藥組小鼠化療后第4天和第6天腫瘤組織切片brdu染色示意圖，d為brdu免疫組化切片腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)統(tǒng)計(jì)示意圖，(n＝3)，**p＜0.01；

圖8為抗cxcl4單抗聯(lián)合5-fu對(duì)t淋巴細(xì)胞移植裸鼠接種腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用示意圖；其中，a為皮下接種ct26腫瘤的balb/cnu/nu裸小鼠，5-fu(150mg/kg)化療后加單抗給藥組皮下注射抗cxcl4單抗(1mg/kg)，腫瘤體積隨時(shí)間的變化示意圖，b為尾靜脈移植健康balb/c小鼠淋巴細(xì)胞的balb/cnu/nuct26荷瘤裸小鼠，5-fu(150mg/kg)化療后加單抗給藥組皮下注射抗cxcl4單抗(1mg/kg)，腫瘤體積隨時(shí)間的變化示意圖。

圖9為rt-pcr檢測(cè)ct26腫瘤組織中ifn-r和gran-bmrna表達(dá)量變化示意圖；其中，a為rt-pcr檢測(cè)ifn-γmrna的表達(dá)量，b為rt-pcr檢測(cè)gran-bmrna的表達(dá)量；(n＝3)(*p<0.05vspbscontrol組)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例中涉及的雜交瘤細(xì)胞16d6-3已于2012年11月29日遞交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址為中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為cctccno:c20120186。

實(shí)施例

1.1結(jié)腸癌荷瘤小鼠化療模型的建立

臨床治療結(jié)直腸癌的化療方案是以5-fu為基礎(chǔ)的單藥化療或聯(lián)合化療方案(5-fu+l-ohp或cpt-11)。為貼近臨床，選擇5-fu單次化療構(gòu)建結(jié)腸癌皮下荷瘤小鼠化療模型。合適的化療劑量對(duì)于模型的穩(wěn)定性也有重要意義。若化療藥劑量過(guò)低，則化療對(duì)腫瘤的殺傷作用不明顯；若化療藥劑量過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致過(guò)高的小鼠死亡率。經(jīng)過(guò)劑量摸索，在后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，5-fu的單藥化療劑量均控制在150-200mg/kg。

在balb/c小鼠右側(cè)腋下皮下接種小鼠結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞ct261×10⁶個(gè)，待腫瘤體積長(zhǎng)至400-500mm³時(shí)，一次性尾靜脈注射化療藥物5-fu(200mg/kg)，化療后每?jī)商煊糜螛?biāo)卡尺量取腫瘤體積大小，這樣得到了小鼠結(jié)腸癌腫瘤經(jīng)5-fu化療后其生長(zhǎng)變化情況；圖1即對(duì)ct26荷瘤小鼠一次性注射5-fu(200mg/kg)，化療后第0、2、4、6、8天皮下腫瘤體積的測(cè)量結(jié)果示意圖，由圖1可知，ct26腫瘤在5-fu化療后，腫瘤體積先減小，第4天達(dá)到最低點(diǎn)，然后反彈增大，表現(xiàn)為典型的“加速再增殖”現(xiàn)象。這表明單次化療對(duì)結(jié)腸癌腫瘤的生長(zhǎng)抑制作用有限，腫瘤存在化療后復(fù)發(fā)增殖的情況，與臨床觀察現(xiàn)象一致。

對(duì)5-fu化療后第0、2、4、6、8天的ct26腫瘤組織進(jìn)行h&e染色切片，圖2即5-fu(200mg/kg)化療后第0、2、4、6、8天ct26腫瘤組織切片he染色結(jié)果示意圖，由圖2可知，結(jié)果顯示腫瘤組織在化療后出現(xiàn)大面積壞死，以第4天最為嚴(yán)重，但從第6天后壞死急劇減少乃至消失，與腫瘤生長(zhǎng)體積在化療后的變化情況一致。

1.25-fu誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)cxcl4

取5-氟尿嘧啶(5-fu)化療后0、2、4、6、8天共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的新鮮ct26小鼠結(jié)腸癌組織，抽取rna，送樣制作高密度寡核苷酸微陣列，得到結(jié)腸癌腫瘤化療后耐藥生長(zhǎng)過(guò)程中的基因表達(dá)動(dòng)態(tài)圖譜。通過(guò)分析高密度寡核苷酸微陣列中mrna的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)，趨化因子cxcl4在5-fu化療后ct26腫瘤組織的表達(dá)量上調(diào)，而在單次化療后期腫瘤恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)期表達(dá)量下降。由圖3a可知，與化療前相比，5-fu化療后cxcl4的表達(dá)在第2天達(dá)到了最高值，隨后開(kāi)始下降。為了進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果，采用real-timepcr(rt-pct)的方法檢測(cè)了ct26腫瘤組織中cxcl4在5-fu化療后第4天的表達(dá)變化，如圖3b(n＝3,**p<0.01)所示，結(jié)果驗(yàn)證了與未化療的第0天對(duì)照組相比，cxcl4基因表達(dá)顯著上調(diào)。

1.35-fu特異性介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞cxcl4激活表達(dá)

5-fu誘導(dǎo)腫瘤組織cxcl4的表達(dá)激活，而腫瘤組織的異質(zhì)性使得研究cxcl4是由腫瘤組織中的哪類(lèi)細(xì)胞表達(dá)顯得極為必要。在體外培養(yǎng)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞ct26，以200μg/ml5-fu孵育3小時(shí)后換液，收集換液后4小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)的細(xì)胞，抽提rna，利用rt-pcr技術(shù)研究cxcl4mrna的表達(dá)量變化。由圖4a(n＝3,*p<0.05，**p<0.01)可知，從5-fu化療后4小時(shí)起，與未經(jīng)化療的對(duì)照相比，ct26細(xì)胞顯著激活上調(diào)cxcl4mrna。

接下來(lái)進(jìn)一步研究了腫瘤細(xì)胞cxcl4表達(dá)激活是否為化療藥特異性或?yàn)槟[瘤細(xì)胞特異性。體外培養(yǎng)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞ct26和小鼠胃癌細(xì)胞mfc，以200μg/ml5-fu或30μg/ml奧沙利鉑(l-ohp)孵育3小時(shí)后換液，收集換液后4小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)的細(xì)胞，抽提rna，利用rt-pcr技術(shù)研究cxcl4mrna的表達(dá)量變化。由圖4c(n＝3,p<0.05)可知，結(jié)果表明，相比于ct26細(xì)胞，mfc細(xì)胞在5-fu后48小時(shí)，cxcl4mrna才有顯著激活上調(diào)。而l-ohp不能激活ct26(圖4b)或mfc細(xì)胞(圖4d)上調(diào)cxcl4表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明結(jié)腸癌細(xì)胞cxcl4激活表達(dá)是由5-fu特異性介導(dǎo)的。

1.4rhcxcl4體外對(duì)ct26結(jié)腸癌細(xì)胞增殖不起作用

前面研究表明5-fu化療能特異性誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞激活表達(dá)cxcl4，接下來(lái)研究cxcl4是否對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞有直接作用。在體外用不同濃度的rhcxcl4(0-3μg/ml)對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞ct26和大鼠未分化小腸隱窩上皮細(xì)胞iec-6(陽(yáng)性對(duì)照)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，48h后用mtt顯色法檢測(cè)活細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，計(jì)算ct26細(xì)胞和iec-6細(xì)胞在不同濃度rhcxcl4培養(yǎng)條件下的存活率。圖5a為不同濃度的rhcxcl4(0-3μg/ml)對(duì)iec-6細(xì)胞的增殖作用示意圖，圖5b為不同濃度的rhcxcl4(0-3μg/ml)對(duì)ct26細(xì)胞的增殖作用示意圖；圖5a、5b的結(jié)果顯示，在體外rhcxcl4在0.33μg/ml的濃度下就對(duì)iec-6細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，而rhcxcl4體外對(duì)ct26細(xì)胞的增殖無(wú)影響。

1.5抗cxcl4單抗的制備及其理化性質(zhì)的鑒定

多克隆抗體由于其血清來(lái)源成分較為復(fù)雜，本實(shí)施例制備和純化了具有中和人源及鼠源cxcl4的單克隆抗體。經(jīng)純度檢測(cè)、內(nèi)毒素檢測(cè)和生物學(xué)活性檢測(cè)(圖6)，證明了單抗的質(zhì)量都已達(dá)到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

以純化的人cxcl4重組蛋白免疫sd大鼠,經(jīng)細(xì)胞融合以及3次克隆篩選得到了一株分泌抗重組人和小鼠cxcl4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為16d6-3。16d6-3細(xì)胞株體外連續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月，經(jīng)elisa方法滴度檢測(cè)證明，抗體分泌能力穩(wěn)定。用該細(xì)胞株腹腔注射裸鼠收集腹水后，以親和柱hitrapproteinghp(gehealthcare)純化腹水中的單克隆抗體anti-cxcl4mab，經(jīng)sds-page檢測(cè)抗體純度達(dá)到98％(圖6a-a)，并用westernblot方法檢測(cè)單克隆抗體與重組人cxcl4蛋白的結(jié)合活性(圖6a-b)。用biacore檢測(cè)純化得到的anti-cxcl4mab與重組人cxcl4的親和力，經(jīng)biaevaluation分析軟件處理數(shù)據(jù)，采用一對(duì)一langmuir結(jié)合模型計(jì)算結(jié)合率(kon)和解離率(koff)，平衡解離常數(shù)(kd)為kon與koff的比值；計(jì)算得到的結(jié)合率(kon)和解離率(koff)分別為1.79×10^-6(1/s)和97.8(1/ms)，平衡解離常數(shù)(kd)為1.83×10^-8m(圖6b)。進(jìn)一步檢測(cè)了抗cxcl4單抗的生物學(xué)活性，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道將achn細(xì)胞用10μg/ml-100μg/ml的rhcxcl4蛋白孵育，72小時(shí)后mtt檢測(cè)發(fā)現(xiàn)rhcxcl4(ic50＝72.6μg/ml)有效抑制了achn細(xì)胞的增殖，與文獻(xiàn)報(bào)道一致(圖6c)，而抗cxcl4單抗有效阻斷了cxcl4(72.6μg/ml)對(duì)achn細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性(圖6d)。

1.6抗cxcl4單抗協(xié)同5-fu化療抑制結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)確證cxcl4對(duì)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞沒(méi)有直接作用的基礎(chǔ)上，接下來(lái)研究cxcl4在體內(nèi)對(duì)ct26腫瘤細(xì)胞的作用。利用實(shí)驗(yàn)室自己制備和純化的抗cxcl4單克隆抗體(申請(qǐng)?zhí)枺?01310066089.7的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利《抗趨化因子4單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞系及應(yīng)用》)從反面驗(yàn)證了cxcl4在ct26腫瘤5-fu化療中的作用。

在balb/c小鼠右側(cè)腋下皮下接種小鼠結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞ct261×10⁶個(gè)，待腫瘤體積長(zhǎng)至200-300mm³時(shí)，隨機(jī)分組，包括陰性對(duì)照組，化療對(duì)照組，化療加單抗給藥組。化療方案為一次性尾靜脈注射化療藥物5-fu(150mg/kg)?？筩xcl4單抗給藥方案為化療當(dāng)天皮下給藥，給藥劑量1mg/kg。pbs對(duì)照組僅皮下注射同體積pbs，化療對(duì)照組注射同體積pbs。給藥后每2天用游標(biāo)卡尺量取皮下腫瘤大小。圖7為抗cxcl4單抗聯(lián)合5-fu對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用示意圖，結(jié)果顯示，與單獨(dú)5-fu化療相比，抗cxcl4單抗能夠協(xié)同5-fu顯著提高化療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用(圖7a)(n＝10,p<0.01)。

圖7b(n＝10,p<0.05)為抗cxcl4單抗對(duì)荷瘤小鼠化療后死亡率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗cxcl4單抗亦能夠協(xié)同5-fu顯著提高荷瘤小鼠化療后的存活時(shí)間。

對(duì)化療對(duì)照組和化療加單抗給藥組的腫瘤組織進(jìn)行切片，brdu免疫組化染色檢測(cè)腫瘤組織中細(xì)胞的增殖情況，如圖7c、7d；結(jié)果顯示，相較于對(duì)5-fu化療對(duì)照組，抗cxcl4單抗與5-fu聯(lián)用減少了腫瘤在化療后第2、4、6天的brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(切片中呈棕色著色)(圖7c)，增殖指數(shù)統(tǒng)計(jì)差異顯著(p＜0.01)(圖7d)。增殖指數(shù)統(tǒng)計(jì)：顯微鏡400視野下隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下brdu陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)(n＝3)。

以上結(jié)果表明，與單獨(dú)5-fu化療相比，抗cxcl4單抗顯著抑制5-fu后的“加速再增殖”，表現(xiàn)為協(xié)同5-fu抑制腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)單抗與5-fu聯(lián)用還能顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠化療后的存活時(shí)間。這也從反面證明了化療后腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)激活表達(dá)cxcl4來(lái)獲得化療后的“加速再增殖”優(yōu)勢(shì)。

1.7抗cxcl4單抗通過(guò)作用于t淋巴細(xì)胞協(xié)同5-fu化療抑制結(jié)腸癌細(xì)胞再增殖

抗cxcl4單抗協(xié)同5-fu提高化療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，這表明化療后腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)激活表達(dá)cxcl4獲得了自身的增殖優(yōu)勢(shì)。而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)cxcl4對(duì)腫瘤細(xì)胞沒(méi)有直接作用，這預(yù)示cxcl4可能通過(guò)間接作用于腫瘤組織中的間質(zhì)細(xì)胞來(lái)幫助結(jié)腸癌細(xì)胞獲得增殖優(yōu)勢(shì)。

首先以先天性無(wú)胸腺t淋巴細(xì)胞發(fā)育缺陷的balb/cnu/nu裸小鼠為對(duì)象建立ct26荷瘤小鼠模型，在裸鼠右側(cè)腋下皮下接種小鼠結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞ct261×10⁶個(gè)，待腫瘤體積長(zhǎng)至200-300mm³，一次性注射化療藥物5-fu(150mg/kg)后隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組化療當(dāng)天皮下注射抗cxcl4單抗1mg/kg，對(duì)照組注射同體積pbs，給藥后每2天用游標(biāo)卡尺量取皮下腫瘤大小。圖8為抗cxcl4單抗聯(lián)合5-fu對(duì)t淋巴細(xì)胞移植裸鼠接種腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用示意圖；結(jié)果顯示，與單獨(dú)5-fu化療相比，抗cxcl4單抗不能協(xié)同5-fu化療提高對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用(圖8a)(n＝6)。

接下來(lái)對(duì)balb/cnu/nu裸鼠每周尾靜脈移植健康balb/c小鼠脾臟分離的淋巴細(xì)胞1×10⁷個(gè)，首次淋巴細(xì)胞移植3天后皮下接種ct26細(xì)胞1×10⁶個(gè)，待腫瘤體積長(zhǎng)至200-300mm³，一次性注射化療藥物5-fu(150mg/kg)。隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組化療當(dāng)天皮下注射抗cxcl4單抗1mg/kg，對(duì)照組注射同體積pbs，給藥后每2天用游標(biāo)卡尺量取皮下腫瘤大小。結(jié)果顯示，抗cxcl4單抗能夠協(xié)同5-fu顯著提高化療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用(圖8b)(n＝8,p<0.05)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明，抗cxcl4抗體是通過(guò)作用于t淋巴免疫系統(tǒng)來(lái)協(xié)同5-fu抑制結(jié)腸癌細(xì)胞再增殖，也即是說(shuō)5-fu化療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞激活表達(dá)cxcl4可以作用于t淋巴細(xì)胞使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫監(jiān)視而獲得增殖優(yōu)勢(shì)。

1.8抗cxcl4單抗增強(qiáng)腫瘤組織中t淋巴細(xì)胞的抗腫瘤作用

腫瘤組織中浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞具有抗腫瘤作用，例如細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)和自然殺傷細(xì)胞(nk)可以通過(guò)分泌干擾素(ifn-γ)、顆粒酶a(gran-a)和顆粒酶b等(gran-b)來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。已有文獻(xiàn)表明臨床癌癥病人腫瘤組織中的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞與病人預(yù)后及存活時(shí)間有顯著相關(guān)。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明抗cxcl4單抗是通過(guò)作用于t淋巴細(xì)胞來(lái)協(xié)同5-fu化療抑制結(jié)腸癌腫瘤生長(zhǎng)，假設(shè)抗cxcl4單抗的協(xié)同機(jī)制是抗cxcl4單抗能增強(qiáng)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的抗腫瘤作用。

在balb/c小鼠右側(cè)腋下皮下接種ct26細(xì)胞1×10⁶個(gè)，待腫瘤體積長(zhǎng)至200-300mm³時(shí)，隨機(jī)分組，包括陰性對(duì)照組，化療對(duì)照組，化療加單抗給藥組。pbs對(duì)照組僅皮下注射同體積pbs，化療對(duì)照組一次性注射化療藥物5-fu(150mg/kg)?；熂訂慰菇o藥組在5-fu化療當(dāng)天頸部皮下注射抗cxcl4單抗1mg/kg?；熀蟮?天處死小鼠，剝?nèi)⌒迈r腫瘤組織，抽提rna，利用rt-pcr技術(shù)比較各組小鼠腫瘤組織中ifn-γ和gran-bmrna的表達(dá)量。圖9為rt-pcr檢測(cè)ct26腫瘤組織中ifn-r和gran-bmrna表達(dá)量變化示意圖；結(jié)果表明，5-fu化療能抑制ifn-γ和gran-b的表達(dá)，而抗cxcl4單抗能顯著提高化療腫瘤組織中ifn-γ(圖9a)和gran-b(圖9b)的表達(dá)(n＝3,p<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗cxcl4單抗能顯著增強(qiáng)腫瘤組織中t淋巴細(xì)胞的抗腫瘤作用。

綜上所述，本發(fā)明通過(guò)應(yīng)用結(jié)腸癌荷瘤小鼠5-fu化療模型，揭示cxcl4表達(dá)變化與結(jié)腸癌5-fu化療后“加速再增殖”之間的關(guān)系，闡明cxcl4參與化療后腫瘤“加速再增殖”過(guò)程中的分子機(jī)制，完成拮抗cxcl4協(xié)同5-fu抑制結(jié)腸癌細(xì)胞再增殖的藥效藥理研究，本發(fā)明的成功實(shí)施，為結(jié)直腸癌新藥研發(fā)提供新靶點(diǎn)和新抗體藥物，為結(jié)直腸癌藥物治療提供新思路；因而，具有重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。