本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測大豆過敏原glymbd28k基因的lamp引物組合物、檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

食物過敏是機(jī)體免疫系統(tǒng)對某些食物產(chǎn)生的異常免疫反應(yīng)，相應(yīng)的免疫球蛋白會和這些食物結(jié)合，釋放出很多化學(xué)物質(zhì)，引起過敏癥狀(如惡心、嘔吐、濕疹等)，嚴(yán)重者會導(dǎo)致過敏性休克發(fā)生。世界糧農(nóng)組織1995年報(bào)告，90％以上的食物過敏是由花生、大豆、牛奶、雞蛋、魚、貝類產(chǎn)品、堅(jiān)果類等引起。大豆蛋白在食品加工業(yè)的廣泛應(yīng)用，給大豆敏感人群帶來了諸多食品安全問題，多數(shù)食物致敏原引起人的ⅰ型過敏反應(yīng)，在大豆消化過程或吸入大豆粉末后會起不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為過敏性皮炎或胃部不適，主要癥狀是口周紅斑、唇腫、口腔疼痛、舌咽腫、惡心和嘔吐等，但一般不會有生命危險(xiǎn)。因此對于商品是否含有大豆過敏原的抽檢，找到一種快速、簡單的檢測方法顯得尤為重要。

大豆(glycinemax)在我國產(chǎn)量豐富、食用廣泛，長久以來一直被廣泛應(yīng)用于食品和飼料的加工原料。但隨著食用量的增加，引起過敏發(fā)病的幾率不斷上升。大豆過敏原包括種子儲藏蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和防御相關(guān)蛋白，其中種子儲藏蛋白中的7s球蛋白組分中的glymbd28k，glymbd30k及β-伴球蛋白glymbd60k是3種主要的過敏原。近年來，檢測大豆過敏原在過敏反應(yīng)中的作用顯得尤為重要。在此，選取大豆蛋白glymbd28k過敏原基因?yàn)闄z測對象以檢測大豆過敏原成分。

不言而喻，對檢測食品中是否含有大豆過敏原具有十分重要的意義。目前，檢測大豆過敏原主要有以下兩種檢測方法：

1)檢測大豆過敏原蛋白成分，如酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)、質(zhì)譜法(maldi—tof/ms)、westernblotting檢測等方法。

2)檢測過敏原基因殘留，如pcr檢測技術(shù)，焦磷酸測序技術(shù)等，其中pcr檢測方法是最主要、最準(zhǔn)確的方法，但這類方法操作過程比較復(fù)雜，需要專業(yè)人員；所使用的儀器比較昂貴，檢測也很耗時(shí)。另外電泳常用的eb染料為強(qiáng)致癌物質(zhì)，有較強(qiáng)毒性，且難以實(shí)行現(xiàn)場檢測。

綜上所述，找到一種快速、簡單、安全的檢測大豆過敏原的檢測方法顯得極為必要。

環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，以下簡稱lamp法)是由notomi等建立的一種快速高效、特異性強(qiáng)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其具有快速簡單、操作方便、靈敏度高、容易普及、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，目前該技術(shù)尚未使用于檢測大豆過敏原。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種用于檢測大豆過敏原glymbd28k基因的lamp引物組合物，并提供一種含有上述lamp引物組合物的檢測試劑盒及使用該lamp引物組合物的檢測方法，本發(fā)明所述的檢測方法具有特異性強(qiáng)、響應(yīng)速度快、靈敏度高、結(jié)果判定簡單、操作簡便、價(jià)格低廉、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于檢測大豆過敏原glymbd28k基因的lamp引物組合物，其包括兩條外引物(f3、b3)和兩條內(nèi)引(fip、bip)，這4條引物的核苷酸序列如下所示：

正向外引物f3(seqidno：1)：ggaagcaaagctgggatt；

反向外引物b3(seqidno：2)：gaaatatgtgaacttatgatggatg；

正向內(nèi)引物fip(seqidno：3)：

tgaaccagatggaatcatgtacaatgatgatgaactagcggaa；

反向內(nèi)引物bip(seqidno：4)：

taggagaaggtcagagacttcacgatgcatgtacctggaagg。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種含有上述lamp引物組合物的用于檢測大豆過敏原glymbd28k基因的試劑盒。

為了進(jìn)一步優(yōu)化上述試劑盒，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：

優(yōu)選地，該試劑盒還包括lamp工作液、熒光指示劑和bstdna聚合酶。

優(yōu)選地，所述lamp工作液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4和tween-20。

優(yōu)選地，所述熒光指示劑選自sybrgreen、evergreen、picogreen、syto系列中的至少一種；更優(yōu)選為sybrgreen，更具體的說為sybrgreenⅰ。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括顯色劑。

優(yōu)選地，所述顯色劑選自hnb、calcein、甲酚紅、酚紅、間甲酚紫、溴甲酚紫、中性紅、萘酚酞和百里酚藍(lán)；更優(yōu)選為中性紅(neured染料)。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為含有含有大豆過敏原glymbd28k基因的樣品稀釋液，所述陰性對照為不含大豆過敏原基因的去離子水。

優(yōu)選地，該試劑盒的檢測限為0.4ng/μl。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，一種用于檢測大豆過敏原glymbd28k基因的試劑盒包含以下組分：

1)lamp工作液：20mmtris-hcl(ph8.8，25℃)，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，8mmmgso4，0.1％tween-20；

2)熒光指示劑：sybrgreen?。?/p>

3)引物液：seqidno：1～seqidno：4所示的引物，4條引物濃度都為100μm；

4)bstdna聚合酶：濃度為8u/μl；

5)顯色劑：neured染料(500um)；

5)對照：陽性對照為含有大豆過敏原glymbd28k基因的樣品稀釋液，陰性對照為不含大豆過敏原基因的去離子水。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種非診斷和治療目的的用于檢測大豆過敏原glymbd28k基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1)采用ctab法提取純化待測樣品的dna；

步驟2)用上述lamp引物組合物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；

步驟3)結(jié)果判斷：根據(jù)是否出現(xiàn)“s”型擴(kuò)增曲線判斷擴(kuò)增結(jié)果，和/或根據(jù)反應(yīng)體系是否出現(xiàn)顏色變化判斷擴(kuò)增結(jié)果。

優(yōu)選地，所述步驟2)的具體操作過程如下：在pcr八聯(lián)管中配制反應(yīng)混合體系：lamp工作液16.7μl，引物液1.3μl，bstdna酶1μl，顯色劑1μl，樣品dna5μl，用含有大豆過敏原glymbd28k基因替代待檢dna設(shè)置陽性對照，用不含大豆過敏原基因的去離子水替代待檢dna作為陰性對照。將配制好的體系均勻并離心，使pcr八聯(lián)管中沒有氣泡為止，于60～65℃反應(yīng)45～90min，同時(shí)采集熒光信號，并在95℃保持5min，最后降到室溫25℃即可；更優(yōu)選地，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件為63℃60min。

優(yōu)選地，上述步驟2)可采用熒光指示劑sybrgreenⅰ替換顯色劑neured染料，也可同時(shí)加入熒光指示劑sybrgreenⅰ和顯色劑neured染料。

可理解的是，在滿足恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件下，上述反應(yīng)混合體系中各試劑的濃度及用量均可進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，但采用上述體積及濃度的試劑，其擴(kuò)增效果最佳，檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。

本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(lamp法)，根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的四條引物能特異性識別靶基因序列上的六個(gè)特異的區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)dna區(qū)啟動互補(bǔ)鏈合成，結(jié)果生成含有若干倍莖長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜的結(jié)構(gòu)。采用4條特異性引物及一種具有鏈置換活性的dna聚合酶(bstdna聚合酶)，在60～65℃對核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)需在恒溫條件下進(jìn)行(如63℃)，反應(yīng)時(shí)間一般為60min左右，在45～90min的短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增效率可以達(dá)到10⁹～10¹⁰個(gè)拷貝。加入模板dna，在63℃反應(yīng)60min后，在95℃保溫5min，終止反應(yīng)，降溫至室溫25℃。該反應(yīng)會產(chǎn)生大量白色沉淀，是由于在反應(yīng)發(fā)生有核酸大量合成時(shí)，從dntp析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中mg²⁺離子結(jié)合，生成了白色的焦磷酸鎂沉淀。

與pcr技術(shù)或其他技術(shù)相比，本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、響應(yīng)速度快、靈敏度高、結(jié)果判定簡單、操作簡便、價(jià)格低廉、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，具體地來說，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1)特異性強(qiáng)：設(shè)計(jì)的4條引物對靶序列6個(gè)區(qū)域的識別保證了lamp擴(kuò)增反應(yīng)的高特異性，可以從相差一個(gè)核苷酸的基因樣品中找出相應(yīng)的靶序列進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。

2)響應(yīng)速度快：lamp技術(shù)能在60min內(nèi)完成高效率的基因擴(kuò)增。

3)靈敏度高：lamp擴(kuò)增的靈敏度是普通pcr擴(kuò)增的10～100倍，所需模板數(shù)為10copies或者更少。

4)結(jié)果判定簡單：可根據(jù)熒光檢測儀上的熒光曲線判定結(jié)果，或者加入顯色劑，即可通過裸眼觀察反應(yīng)液的顏色變化來判定擴(kuò)增結(jié)果，不需要經(jīng)過凝膠電泳檢測。

5)操作簡便，價(jià)格低廉：只需將反應(yīng)液配制好，在63℃恒溫水浴鍋中加熱60min左右即可判斷擴(kuò)增與否。

6)應(yīng)用范圍廣：lamp擴(kuò)增技術(shù)不僅可以用來檢測dna、rna，還可以通過聯(lián)合其他技術(shù)，如納米技術(shù)、核酸適配體技術(shù)，檢測microrna、蛋白質(zhì)以及金屬離子等。

附圖說明

圖1是本發(fā)明一實(shí)施例中的大豆特異性熒光檢測結(jié)果圖；

圖2是本發(fā)明一實(shí)施例中的不同產(chǎn)地大豆熒光檢測結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明一實(shí)施例中的大豆靈敏度熒光檢測結(jié)果圖(dna濃度分別為10，1，1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，單位ng/μl)；

圖4是本發(fā)明一實(shí)施例中的大豆特異性比色檢測結(jié)果圖(1～8分別表示大豆、開心果、杏仁、榛子、芝麻、花生、核桃、芥末)；

圖5是本發(fā)明一實(shí)施例中的大豆靈敏度比色檢測結(jié)果圖(1～6分別表示大豆樣品濃度梯度：1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0，單位ng/μl)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例一

本實(shí)施例為大豆過敏原熒光檢測方法：

一、大豆過敏原glymbd28k基因的lamp檢測試劑盒，其包括lamp工作液、引物液、bstdna聚合酶、對照，具體如下：

1)lamp工作液：20mmtris-hcl(ph8.8，25℃)，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，8mmmgso4，0.1％tween-20；

2)熒光指示劑：sybrgreen?。?/p>

3)引物液：含有l(wèi)amp引物組合物，4條引物濃度都為100μm；4條引物為：

正向外引物f3：ggaagcaaagctgggatt(seqidno：1)；

反向外引物b3：gaaatatgtgaacttatgatggatg(seqidno：2)；

正向內(nèi)引物fip：

tgaaccagatggaatcatgtacaatgatgatgaactagcggaa

(seqidno：3)；

反向內(nèi)引物bip：

taggagaaggtcagagacttcacgatgcatgtacctggaagg

(seqidno：4)；

4)bstdna聚合酶：濃度為8u/μl；

5)對照：陽性對照為含有大豆過敏原glymbd28k基因的樣品稀釋液，陰性對照為不含大豆過敏原基因的去離子水。

二、利用上述試劑盒按以下方法對待測樣品進(jìn)行檢測：

1)采用ctab法提取純化待測樣品的dna；

a)取150mg大豆或其他樣品放入研缽中，加入少量液氮迅速磨碎，液氮反復(fù)加入3～4次，磨碎成粉末為止；

b)將上述粉末置于1.5ml離心管中，加入600ulctab，15ul蛋白酶k，在65℃條件下溫育30min；

c)加入500ultris飽和酚：氯仿：異戊醇(體積比25：24：1)混合液，強(qiáng)烈振蕩，12000r/min離心15min；

d)加入等體積的氯仿：異戊醇(體積比24：1)，上下顛倒混勻；12000r/min常溫離心15min；

e)吸取上清液加入等體積異丙醇，強(qiáng)烈振蕩后12000r/min離心10min，棄上清液；

f)將沉淀用70％乙醇反復(fù)洗滌2～3次，吸棄；

g)用60ulte緩沖液溶解dna沉淀(te量視dna沉淀多少而定)；

h)用dna/rna蛋白分析儀檢測其純度。

2)等溫?cái)U(kuò)增檢測：在pcr八聯(lián)管中配制反應(yīng)混合體系：lamp工作液17.7μl(包含熒光指示劑sybrgreeni1μl)，引物液1.3μl，bstdna酶1μl，樣品dna5μl，用含有大豆過敏原glymbd28k基因替代待檢dna設(shè)置陽性對照，用不含大豆過敏原基因的去離子水替代待檢dna作為陰性對照。將配制好的體系均勻并離心，使pcr八聯(lián)管中沒有氣泡為止，于60～65℃反應(yīng)60min，同時(shí)采集熒光信號，并在95℃保持5min，最后降到室溫25℃即可。

3)結(jié)果判斷：根據(jù)是否出現(xiàn)“s”型擴(kuò)增曲線判斷擴(kuò)增結(jié)果。

如圖1所示，本實(shí)施例中大豆特異性熒光檢測，陽性樣品出現(xiàn)“s”型擴(kuò)增曲線，即為大豆(圖1中黑色曲線)，其他陰性對照沒有擴(kuò)增曲線，分別為開心果、杏仁、榛子、芝麻、花生、核桃、水。

實(shí)施例二

本實(shí)施例采用實(shí)施一的檢測方法對不同產(chǎn)地大豆進(jìn)行熒光檢測，其檢測結(jié)果如圖2所示。

通過對不同產(chǎn)地大豆樣品(購買自臨沂、佳木斯、南京、杭州)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)不同產(chǎn)地的大豆樣品均有擴(kuò)增信號(圖2)，其他陰性對照沒有擴(kuò)增信號(陰性對照為花生、開心果、杏仁、榛子、芝麻、核桃、芥末、水)。

實(shí)施例三

本實(shí)施例采用實(shí)施一的檢測方法對不同濃度的dna樣本進(jìn)行檢測，以對大豆靈敏度進(jìn)行分析，dna濃度分別為10，1，1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，單位ng/μl，其熒光檢測結(jié)果圖如圖3所示。

根據(jù)圖3所示的大豆靈敏度熒光檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)10ng/μl和1ng/μl有擴(kuò)增信號(圖3)，而其他濃度沒有擴(kuò)增信號，可進(jìn)一步探索1ng/μl至0.1ng/μl區(qū)間的擴(kuò)增信號，以進(jìn)一步確定檢測靈敏度。

實(shí)施例四

本實(shí)施例中試劑盒采用顯色劑neured染料替代實(shí)施例一中的熒光指示劑sybrgreenⅰ，其余均與實(shí)施例一相同。

本實(shí)施例中大豆過敏原glymbd28k基因特異性比色檢測，其結(jié)果如圖4所示，陽性樣品出現(xiàn)粉紅色(圖4中1所示)，其他樣品均是淡棕色，為陰性樣品(圖4中2～8所示，分別為開心果、杏仁、榛子、芝麻、花生、核桃、芥末)。

本實(shí)施例還進(jìn)行大豆過敏原arah6基因靈敏度比色檢測，其結(jié)果如圖5所示，出現(xiàn)粉紅色的樣品濃度依次為1.0、0.8、0.6、0.4ng/μl(即圖5中1～4)，其他淡棕色樣品濃度為0.2、0ng/μl(即圖5中5～6)，也即檢測限為0.4ng/μl。

雖然實(shí)施例一和實(shí)施例四為分別單獨(dú)采用熒光指示劑或顯色劑，但可理解的是，也可在同一反應(yīng)體系中同時(shí)加入熒光指示劑和顯色劑。

由上述實(shí)施例可知，本發(fā)明所述的檢測方法具有快捷迅速、操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于實(shí)時(shí)現(xiàn)場檢測。

以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對該實(shí)用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司；復(fù)旦大學(xué)；上海大學(xué)

<120>一種用于檢測大豆過敏原glymbd28k基因的lamp引物組合物及其試劑盒

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>正向外引物f3

<400>1

ggaagcaaagctgggatt18

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>反向外引物b3

<400>2

gaaatatgtgaacttatgatggatg25

<210>3

<211>43

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>正向內(nèi)引物fip

<400>3

tgaaccagatggaatcatgtacaatgatgatgaactagcggaa43

<210>4

<211>42

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>反向內(nèi)引物bip

<400>4

taggagaaggtcagagacttcacgatgcatgtacctggaagg42