專利名稱：華支睪吸蟲特異性ppmp型抗原及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種華支睪吸蟲，具體來說是三種華支睪吸蟲的特異性抗原PPMP型抗原及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
華支睪吸蟲病(Clonorchiasissinensis)是由華支睪吸蟲[Clonorchis sinensis, Cs]感染所引起的人獸共患病。該病主要分布于亞洲，如中國、日本、韓國(為韓國主要人體寄生蟲)、朝鮮、越南、東南亞等國家。估計全球有3500萬人感染。在我國，除新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、青海、西藏、寧夏等省、自治區(qū)未見報道外，其余25個省、市、自治區(qū)以及臺灣省和香港特別行政區(qū)都已有該病的流行報道或病例報告。由于移民的流動，以及日益頻繁的全球范圍的旅游和經(jīng)濟活動，在一些非流行區(qū)和發(fā)達(dá)國家(包括北美和西歐)該病的病例報告也越來越多。根據(jù)衛(wèi)生部于2001年6月 2004年底在全國(除臺灣、香港、澳門外)進(jìn)行的人體重要寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查結(jié)果顯示，華支睪吸蟲感染率比1990年全國寄生蟲病分布的結(jié)果上升了 75%，其中廣東、廣西、吉林3省(區(qū))分別上升了 182%、164%和630%。估計目前全國華支睪吸蟲感染者達(dá)1200多萬人。華支睪吸蟲病是我國少數(shù)個別幾個呈現(xiàn)上升趨勢的寄生蟲病之一，該病的防治工作已迫在眉睫。在我國南方(如廣東、廣西)及部分北方地區(qū)(如東北3省的朝鮮族居住區(qū))，當(dāng)?shù)厝巳河谐陨幕蛭粗笫斓牡~肉的習(xí)慣，魚肉中活的囊蚴被攝入人體，引起人的感染。 這些地區(qū)居民雖知吃“魚生”會感染本病，但飲食習(xí)慣一時難以改變。而且隨著生活水平的提高，以往不吃或很少吃“魚生”的人群也開始吃“魚生”，現(xiàn)在生魚片的風(fēng)味吃法在非流行區(qū)，特別是大中城市也很盛行。同時由于市場開放，流行區(qū)含華支睪吸蟲囊蚴的魚運往各地，因此城鎮(zhèn)居民感染華支睪吸蟲的人數(shù)有增加的趨勢。華支睪吸蟲成蟲寄生于人或其它終宿主的肝膽管內(nèi)，蟲體的分泌/代謝產(chǎn)物及蟲體本身的機械刺激，可引起膽管，特別是引起次級膽管的炎癥反應(yīng)，中度感染膽管可出現(xiàn)局限性擴張，膽管上皮增生、管壁增厚、管腔狹窄，如合并細(xì)菌感染，可引起膽管炎和膽管肝炎，周圍纖維組織增生，晚期可發(fā)生肝硬化。有證據(jù)表明，華支睪吸蟲感染可增加患者患膽管癌(CLG)的風(fēng)險，華支睪吸蟲感染相關(guān)性肝膽管腫瘤是華支睪吸蟲病流行區(qū)一個重要的公共衛(wèi)生問題。為了快速診斷、及時治療和有效控制華支睪吸蟲病，需要特異、靈敏、簡便的方法檢測人群中華支睪吸蟲的感染。對于華支睪吸蟲病人的診斷，傳統(tǒng)的糞便檢查仍是目前確診華支睪吸蟲病的主要方法。但由于患者依從性較差，且華支睪吸蟲蟲卵較小易于漏檢，該方法有一定的缺陷。目前在現(xiàn)場防治工作中較廣泛地應(yīng)用了免疫診斷方法(主要是ELISA法)。但是仍存在一些問題對健康人有不同程度的假陽性，對華支睪吸蟲病人有一定的假陰性，對其它寄生蟲(血吸蟲、并殖吸蟲)感染也有一定的交叉反應(yīng)。Yong TS應(yīng)用ELISA方法檢測
548例華支睪吸蟲病人血清抗體，只有75%的陽性反應(yīng)，但在觀例正常對照和16例并殖吸蟲病例中，分別出現(xiàn)了 7. 和37. 5%的假陽性。已有研究資料表明一些寄生蟲的排泄分泌抗原(ESA)或重組的ESA可應(yīng)用于寄生蟲病的血清學(xué)診斷。Kim SI用ESA來檢測活動性華支睪吸蟲病病人血清相應(yīng)抗體動態(tài)反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)30kDa和7kDa區(qū)帶與患者血清呈強陽性反應(yīng)，而與吡喹酮治療6個月后的病人血清反應(yīng)較弱，其中7kDa區(qū)帶未見與衛(wèi)氏并殖吸蟲病、橫川后殖吸蟲病、華支睪吸蟲病患者痊愈后的血清起交叉反應(yīng)，特異性比30kDa區(qū)帶更強，據(jù)此認(rèn)為7kDa抗原可作為活動性華支睪吸蟲病的標(biāo)志性診斷抗原。Min-Ho CHOI對華支睪吸蟲的排泄分泌抗原(ESA)檢測抗體的ELISA法和成蟲粗抗原(CA)檢測抗體的ELISA法的診斷價值進(jìn)行了比較和評估。ESA 檢測抗體的ELISA法的特異性顯著高于用CA檢測抗體的ELISA法(前者特異性為93. 1 %， 后者為87. 8% )，表明ESA用于檢測華支睪吸蟲患者血清抗體優(yōu)于粗抗原。因此，與華支睪吸蟲的CA相比，ESA作為華支睪吸蟲病的診斷抗原具有更高的特異性和敏感性。然而傳統(tǒng)的蟲源性抗原制備復(fù)雜，質(zhì)量可控性較低，制備量有限，難以適應(yīng)大規(guī)模查病的需求。此外，由于該蟲寄生于肝膽管這一特定的部位，決定了宿主血清中的抗原和抗體水平較低，難以檢測(也是目前該病缺乏良好診斷試劑的原因)，但在糞樣中卻有ESA的存在。Yong TS等鑒定了與IgE抗體反應(yīng)的華支睪吸蟲抗原，發(fā)現(xiàn)^kDa的抗原與IgE反應(yīng)最強，該蛋白也存在于糞便排泄物中。Sirisinha S等人用單克隆抗體ELISA (Monoclonal antibody ELISA，McAb_ELISA)檢測麝貓后睪吸蟲患者糞樣中的抗原，能檢測的抗原最低量為0. 05ng-0. Ingo研究表明，檢測患者糞樣中的特異抗原，可提供早期診斷、現(xiàn)癥患者確診及療效考核的依據(jù)。而診斷抗體或抗原的特性決定著糞樣和血清中抗原或血清抗體檢測等免疫學(xué)方法的診斷效果。同時由于難以取得高純度的特異抗原或大量的天然抗原，故使用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建特異性重組抗原的技術(shù)路線是尋找合適抗原的必由之路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供三種華支睪吸蟲的特異性抗原及應(yīng)用，所述的這三種華支睪吸蟲的特異性抗原及應(yīng)用要解決現(xiàn)有技術(shù)診斷華支睪吸蟲病的方法特異性和敏感性不高的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原(Cs34)，所述的抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示、或者所述的抗原基因的核苷酸序列與SEQ ID N0:1所示核苷酸序列同源性達(dá)90%以上、或者其部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后如SEQ ID N0:1所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原(Cs34)蛋白質(zhì)，由上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因(Cs34)的核苷酸序列所編碼、或者與上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因(Cs34)的核苷酸序列同源性達(dá)90%以上的核苷酸序列所編碼、或者由部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后的上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因 (Cs34)的核苷酸序列所編碼。進(jìn)一步的，上述分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原(Cs34)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示、或者對SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或者幾個氨基酸后的由SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。進(jìn)一步的，上述分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原(Cs34)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :7所示、或者對SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或者幾個氨基酸后的由SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。進(jìn)一步的，上述分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原(Cs34)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示、或者對SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或者幾個氨基酸后的由SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種抗體，特異性的結(jié)合上述的一種華支睪吸蟲的特異性PPMP 型抗原(Cs34)蛋白。進(jìn)一步的，所述的抗體為單克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種載體，含有上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因 (Cs34)
本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，含有上述的載體，或者用上述的所述的一種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原基因(Cs34)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。本發(fā)明還提供了一種疫苗，含有上述的一種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原 (Cs34)蛋白、或者上述的抗體、或者上述的載體。本發(fā)明還提供了上述的一種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原(Cs34)蛋白在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述的抗體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述的疫苗在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述的載體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，含有上述的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原 (Cs34)蛋白、或者上述的抗體。本發(fā)明還提供了第二種華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原(Cs2)，所述的抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示、或者或者所述的抗原基因的核苷酸序列與SEQ ID NO 2 所示核苷酸序列同源性達(dá)90%以上的核苷酸序列、或者其部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后如SEQID NO 2所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了第二種分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原(Cs2)蛋白，由上述的第二種華支睪吸蟲的特異性抗原基因(Cs2)的核苷酸序列所編碼、或者與上述的第二種華支睪吸蟲的特異性抗原基因(Cs2)的核苷酸序列同源性達(dá)90%以上的核苷酸序列所編碼、或者由部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后的上述的第二種華支睪吸蟲的特異性抗原基因 (Cs2)的核苷酸序列所編碼。進(jìn)一步的，上述的分離的分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原(Cs2)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :5所示、或者對SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或者幾個氨基酸后的由SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了第二種抗體，特異性的結(jié)合上述的第二種華支睪吸蟲的特異性
7PPMP型抗原(Cs2)蛋白。進(jìn)一步的，所述的抗體為單克隆抗體。本發(fā)明還提供了第二種載體，含有上述的第二種華支睪吸蟲的特異性抗原基因 (Cs2)。進(jìn)一步的，上述的載體的氨基酸序列如SEQ ID NO 9所示。本發(fā)明還提供了第二種宿主細(xì)胞，含有上述的第二種載體，或者用上述的所述的第二種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原基因(Cs2)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。本發(fā)明還提供了第二種疫苗，含有上述的第二種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP 型抗原(Cs2)蛋白、或者第二種所述的抗體、或者上述的第二種載體。本發(fā)明還提供了上述的第二種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原(Cs2)蛋白在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述的第二種抗體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述的第二種疫苗在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述的第二種載體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了第二種試劑盒，含有上述的第二種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原(Cs2)蛋白、或者上述的第二種抗體。本發(fā)明還提供了第三種華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原(Cs3)，所述的抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示、或者或者所述的抗原基因的核苷酸序列與SEQ ID NO 3 所示核苷酸序列同源性達(dá)90%以上的核苷酸序列、或者其部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后如SEQID NO 3所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了第三種分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原(Cs3)蛋白，由上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因(Cs3)的核苷酸序列所編碼、或者與上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因(Cs3)的核苷酸序列同源性達(dá)90%以上的核苷酸序列所編碼、或者由部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后的上述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因(Cs3)的核苷酸序列所編碼。進(jìn)一步的，上述第三種分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原(Cs3)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :6所示、或者對SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或者幾個氨基酸后的由SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了第三種抗體，特異性的結(jié)合上述的第三種華支睪吸蟲的特異性 PPMP型抗原(Cs3)蛋白。進(jìn)一步的，所述的抗體為單克隆抗體。本發(fā)明還提供了第三種載體，含有上述的第三種華支睪吸蟲的特異性抗原基因 (Cs3)。進(jìn)一步的，上述的第三種載體的氨基酸序列如SEQ ID NO 10所示。本發(fā)明還提供了第三種宿主細(xì)胞，含有上述的第三種載體，或者用上述的第三種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原基因(Cs3)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明還提供了第三種疫苗，含有上述的第三種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原(Cs3)蛋白、或者上述的第三種抗體、或者第三種載體。本發(fā)明還提供了第三種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原(Cs3)蛋白在制備治療、 診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了第三種上述的抗體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了第三種上述疫苗在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了第三種上述的載體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了第三種一種試劑盒，含有上述的第三種華支睪吸蟲的特異性 PPMP型抗原(Cs3)蛋白、或者上述的第三種抗體。本文中的術(shù)語“表達(dá)載體”，是指本領(lǐng)域中常用的細(xì)菌質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒及其它各種病毒載體。本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)用的載體(原核表達(dá)載體)、 在酵母中表達(dá)用的載體(如畢赤酵母載體)、在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)用的載體(逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等)。在一優(yōu)選實施方式中，所述表達(dá)載體為大腸桿菌表體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用DNA重組技術(shù)等一系列技術(shù)，構(gòu)建含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的DNA序列、 合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列、啟動子及選擇性標(biāo)記基因等特定元件的表達(dá)載體。上述載體可用來轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，以便獲得所需要的融合蛋白。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞，如，細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等。宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含本發(fā)明所述編碼融合蛋白的基因序列后，即構(gòu)成工程化細(xì)胞或細(xì)胞株，可用于生產(chǎn)所需融合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠恰當(dāng)?shù)剡x擇適當(dāng)?shù)妮d體、宿主細(xì)胞，并熟知如何將載體高效地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，所用方法包括但不限于氯化鈣法、電穿孔法用于細(xì)菌細(xì)胞，脂質(zhì)體包裹、電融合法用于哺乳動物細(xì)胞等真核細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以通過常規(guī)方法培養(yǎng)、誘導(dǎo)來表達(dá)所需要的融合蛋白，包括發(fā)酵過程和純化工藝。上述表達(dá)的蛋白可在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜上或分泌到細(xì)胞周質(zhì)、細(xì)胞外。 根據(jù)需要，可利用融合蛋白的物理的、化學(xué)的以及其它生物學(xué)特性，進(jìn)行分離純化。方法包括但不限于裂菌，離心，鹽析，分子篩色譜，離子交換色譜，吸附色譜，反向色譜，以及常規(guī)的變性、復(fù)性處理等，這些方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通過對本發(fā)明人構(gòu)建的華支睪吸蟲成蟲cDNA表達(dá)文庫，用采自廣西壯族自治區(qū)的華支睪吸蟲病人混合血清，使用免疫篩選法篩選華支睪吸蟲成蟲cDNA表達(dá)文庫。共獲得51個陽性克隆，有44個克隆完成測序。發(fā)現(xiàn)其中3例蛋白氨基酸序列中含有特異性 KPPMPGDRDA或QPPMPGGRDA重復(fù)串列序列，因均含有PPMP序列特征，故命名為華支睪吸蟲 PPMP型抗原。并將含有KPPMPGDRDA重復(fù)串列序列的該類抗原稱為PPMP I型抗原，含有 QPPMPGGRDA重復(fù)串列序列的則稱為PPMP II型抗原。經(jīng)同源性比較，本發(fā)明的華支睪吸蟲 PPMP型抗原是迄今為止還沒有公開的華支睪吸蟲新穎的特異性抗原。但與華支睪吸蟲的 GRA(富甘氨酸蛋白)、Glycine rich antigen 2 (富甘氨酸蛋白2)、PRA(富脯氨酸蛋白) 和PRA2(富脯氨酸蛋白2)等有較高的同源性。通過華支睪吸蟲抗原PPMP I型抗原Cs2抗原和PPMP II型抗原Cs3抗原的表達(dá)純化，已進(jìn)一步建立了高特異性和敏感性的華支睪吸
9蟲病診斷初步方法；并易制備多/單克隆抗體，可應(yīng)用華支睪吸蟲病的科研和防治等不同方面。本發(fā)明的試劑盒還可以用來檢測華支睪吸蟲病。


圖1、圖2是華支睪吸蟲PPMP型抗原基因Alignment分析結(jié)果。圖中1_3號序列為本發(fā)明人獲得的華支睪吸蟲PPMP型抗原基因Cs34、Cs2和Cs3的氨基酸序列，GRA為 Glycine rich antigen序列，GRA2 為 Glycine rich antigen 2 序列，PRA 為 Pro line rich antigen序列(注本發(fā)明人對原序列中不正確的編碼進(jìn)行了修正)，PRA2為ftOline rich antigen 2 序列。圖3是將CS;34抗原全長氨基酸序列傳送至SignalP 3. 0 Server (網(wǎng)址http:// www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)，使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(NN)進(jìn)行在線信號肽剪切位點分析圖。圖4將CsiM抗原全長氨基酸序列傳送至SignalP 3.0 Server (網(wǎng)址http// www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)，使用隱馬可夫模型(HMM)進(jìn)行在線信號肽剪切位點分析圖。圖5是pBluescript SK_Cs2噬菌粒EcoRI/XhoI雙酶切1 %的瓊脂糖凝膠電泳圖， M =DNA Marker ；1 :pBluescript SK_Cs2 質(zhì)粒 EcoRI/XhoI 雙酶切結(jié)果(755bp)。圖6是pET28b質(zhì)粒EcoRlAhoI雙酶切的1 %的瓊脂糖凝膠電泳圖，M =DNA Marker ；1 :pET28b 質(zhì)粒 Ncol/Xhol 雙酶切結(jié)果。圖7是pBluescript SK_Cs3噬菌粒和pET28b質(zhì)粒EcoRI/XhoI雙酶切的1 %的瓊脂糖凝膠電泳圖，M =DNA Marker ；1 :pET28b 質(zhì)粒 NcoI/XhoI 雙酶切結(jié)果。2 :pBluescript SK_Cs3 質(zhì)粒 EcoRI/XhoI 雙酶切結(jié)果(1157bp)。圖8是pET28b_Cs2[BLR(DE3)宿主菌]重組蛋白表達(dá)鑒定12%的聚丙烯胺凝膠電泳圖，M =Protein Marker (FERMENTAS MBI) ；NI :pET28b_Cs2 未誘導(dǎo)；I :pET28b_Cs2 誘導(dǎo)； S:誘導(dǎo)上清；P:誘導(dǎo)沉淀。圖9是pET28b-CS3[BLR(DE3)pLySS宿主菌]重組蛋白表達(dá)鑒定12%的聚丙烯胺凝膠電泳圖，M =Protein Marker (FERMENTAS MBI) ；NI :pET28b-Cs3 未誘導(dǎo)；I :pET28b-Cs3 誘導(dǎo)；S:誘導(dǎo)上清；P:誘導(dǎo)沉淀。圖10是pET28b_Cs2[BLR(DE3)宿主菌]可溶性蛋白純化12%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，M =Protein marker ；1 =Ni-NTA純化流出液(含IOmM咪唑)；2_3 含20mM咪唑洗滌液管4、6 ；4-9 含50mM咪唑洗脫液1-6管；9-11 含IOOmM咪唑洗脫液1-3管；12-14 含 250mM咪唑洗脫液1-3管，其中，pET28b_Cs2可溶性蛋白集中在含50mM-100mM咪唑的洗脫液中。圖11是pET2m3-CS3[BLR(DE3)pLySS宿主菌]可溶性蛋白純化12%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，M =Protein marker ；1 :Ni_NTA純化流出液(含IOmM咪唑)；2_3 含20mM咪唑洗滌液管4、6 ；4-9 含50mM咪唑洗脫液1-6管；10-12 含IOOmM咪唑洗脫液1-3管；13-14 含250mM咪唑洗脫液1-2管，其中，pEI^8b_Cs3可溶性蛋白集中在含50mM-100mM咪唑的洗脫液中。圖12是pET28b_CS2可溶性純化蛋白ELISA法檢測各類血清抗體散點圖。
圖13是pET28b_CS3可溶性純化蛋白ELISA法檢測各類血清抗體散點圖。為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見了，而這些等價修改， 均應(yīng)屬于本發(fā)明所限定的范圍。
具體實施例方式以下所述實驗方法，沒有具體說明的，均按照《分子克隆實驗指南》，2002年，科學(xué)出版社)所述方法進(jìn)行。實施例1華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫的構(gòu)建用采自廣西壯族自治區(qū)的華支睪吸蟲囊蚴，通過灌胃法感染貓5只。40天后，檢查糞便蟲卵，然后剖殺，收集華支睪吸蟲成蟲，用滅菌的生理鹽水沖洗干凈，液氮保存。利用TRIzol (GIBC0/BRL公司)試劑盒抽提華支睪吸蟲成蟲(1克華支睪吸蟲成蟲壓積，液氮保存)的總RNA。采用mRNA純化試劑盒(mRNA Purification Kit，Amersham公司)，從提取的總 RNA 中純化mRNA。具體步驟見產(chǎn)品說明書。華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫采用定向克隆法，利用ZAP-cDNASynthesis Kit(Stratagene公司)構(gòu)建。參照試劑盒說明書操作，主要過程包括1. cDNA第一鏈的合成，應(yīng)用含有Bio I內(nèi)切酶位點的多聚T引物，為了使cDNA第一鏈在合成過程中不受限制性內(nèi)切酶的破壞，用5-甲基dCTP替代dNTP中的dCTP，使合成的DNA半甲基化，從而在B10 I消化cDNA時，只有位于多聚T引物內(nèi)的非甲基化位點可被裂解；2. cDNA第二鏈的合成，由RNase H消化第一鏈合成產(chǎn)物mRNA_DNA雜合體中的RNA， 產(chǎn)生的cDNA片段作為引物在DNA聚合酶I作用下合成第二鏈；3.用Pfu DNA聚合酶將合成的雙鏈cDNA的末端補平，之后在補平的雙鏈DNA的 5’端加上含有EcoR I酶切位點的接頭(adaptor)，并使接頭磷酸化；
4.用限制性內(nèi)切酶Β ο I消化，消化后的雙鏈DNA通過kphar0SeCL-2B凝膠柱層析，進(jìn)行分級分離，去除游離接頭；5.將分離后的DNA片段合并濃縮，連接到Uni-ZAP xR載體上；6. MBffl 1 !!^ (Gigapack III Gold Packing Extract, Stratagene) 1 噬菌體蛋白外殼。華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫構(gòu)建完成后，進(jìn)一步對文庫容量及插入片段平均長度等進(jìn)行檢測。檢測計算結(jié)果，華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫的容量為1. 43X 106pfu/ml。從文庫中隨機挑取16個重組克隆進(jìn)行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物鑒定。重組克隆擴增片段長度范圍在0.61Λ 21Λ。平均插入片段長度為1. 11Λ。重組插入率為99. 6 %。實施例2 cDNA文庫的免疫篩選噬菌體感染
11
取XLl-blue MRF'菌液200 μ 1與適量cDNA文庫噬菌體液混合(根據(jù)文庫滴度預(yù)先確定，約3000噬菌斑/每板)，37°C溫育15分鐘后，加入:3ml 48°C的上層瓊脂(top agar) 混勻，立即鋪于NZY培養(yǎng)基平板上。室溫下凝固10分鐘，于42°C孵育。融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)觀察到噬菌斑出現(xiàn)后(約3. 5小時)，用經(jīng)IPTG (15mM/L)浸泡30分鐘的硝酸纖維素膜(Hybond-C extra, Amersham, NC)覆蓋平板，于37°C再培育3. 5小時；取出平板4°C冷卻15分鐘，然后用針在膜以及板上做上標(biāo)記。將膜取下置于TBST中洗3次，每次10分鐘， 然后浸于NC膜浸在封閉液中，室溫，輕微振蕩，封閉過夜。將NC膜從封閉液中取出，用TBST洗膜2次，每次5分鐘。加入華支睪吸蟲病人混合血清(采自廣西壯族自治區(qū))5ml/膜，室溫下輕微振蕩3小時。再用TBST洗膜3次，每次10分鐘。加入二抗(5ml/膜)即羊抗人堿性磷酸酶結(jié)合物(AP-GAH，BI0-RAD，1 3 000 稀釋)室溫下反應(yīng)1小時，用TBST洗膜3次，每次10分鐘，用TBS洗膜2次，每次5分鐘， 洗去殘留的Tween20。將NC膜從TBS中取出，用Whatman 3MM的濾紙吸干多余的溶液，放入AP buffer 浸泡NC膜3分鐘。用Color Development Solution 稀釋 NBT 至終濃度 0. 3mg/ml, BCIP 終濃度為 0. 15mg/ml(BCIP應(yīng)逐滴加入已稀釋的NBT中，防止沉淀形成。)，配制成NBT-BCIP顯色液。 將NC膜浸入NBT-BCIP顯色液中，在暗處進(jìn)行顯色反應(yīng)直到陽性斑點清晰可見。終止顯色反應(yīng)。根據(jù)NC膜上陽性斑點在原培養(yǎng)板上的相應(yīng)位置，挑取陽性噬菌斑，再經(jīng)過復(fù)篩、 三篩使得陽性噬菌體單克隆化。實施例3 噬菌體刪除環(huán)化為pBluescript SK_噬菌粒及提取噬菌粒E. coli XLl-blue MRF'于 LB 培養(yǎng)基(含有 IOmM MgS04，0. 2%麥芽糖，15μ g/ml Tet)中培養(yǎng)過夜。次日，取培養(yǎng)液100μ1轉(zhuǎn)接到新的LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)約2小時。培養(yǎng)液經(jīng)2 000g，離心10分鐘，沉淀細(xì)菌，用IOmM MgS04重懸至0D_ = 1. 0。 在細(xì)菌培養(yǎng)管中加入200 μ 1 Ε. coli XLl-blue MRF'重懸液、50 μ 1含有陽性噬菌體的SM buffer和1 μ 1輔助噬菌體。將細(xì)菌培養(yǎng)管放置于37°C水浴中15分鐘。然后加入:3ml LB, 于37°C振蕩培養(yǎng)5小時。取出細(xì)菌培養(yǎng)管，在65°C加熱20分鐘，然后3000g，離心15分鐘， 將上清轉(zhuǎn)入一個新離心管中，置于4°C保存。SOLR菌于LB培養(yǎng)基(含有IOmM MgS04, 50 μ g/ml Kan)中振蕩培養(yǎng)，然后2 000g, 離心10分鐘，用IOmM MgS04重懸至OD600 = 1. 0，在1. 5ml Ep離心管中加入200 μ 1 SOLR 和上述制備的上清保存液1 μ 1，在37°C溫育15分鐘，然后取出25 μ 1均勻涂布于LB (含 100 μ g/ml Amp)瓊脂平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)基上生長的菌落，即為含華支睪吸蟲cDNA插入片段的pBluescript SK_噬菌粒的SOLR菌落。使用Axyft^p質(zhì)粒DNA小量試劑盒[愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司]提取 pBluescript 51(_噬菌粒。實施例4華支睪吸蟲PPMP型抗原基因的分離篩選獲得的陽性克隆，經(jīng)刪除環(huán)化為pBluescript SK_質(zhì)粒。由上海hvitrogen公司測序，共得到3個華支睪吸蟲PPMP型抗原基因的部分mRNA(cDNA)序列。分別是華支睪吸蟲Cs34、Cs2和Cs3基因，插入片段長度分別為1044、734和1136個堿基。華支睪吸蟲Cs34基因的mRNA(cDNA)序列如SEQ ID NO 1所示。華支睪吸蟲Cs2基因的mRNA(cDNA)序列如SEQ ID NO 2所示。華支睪吸蟲Cs3基因的mRNA(cDNA)序列如SEQ ID NO 3所示。Cs34、Cs2和Cs3克隆中插入的cDNA片段推導(dǎo)的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 4-6所示，Cs34、Cs2和Cs3蛋白分別含265、157和284個氨基酸。
0109]華支睪吸蟲Cs34基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。0110]華支睪吸蟲Cs2基因的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。0111]華支睪吸蟲Cs3基因的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。0112]實施例5華支睪吸蟲Cs34抗原同源性比較0113]使用Blastp對GenBank中nr庫進(jìn)行同源性比較，結(jié)果如下0114]Search database N^r-redundant protein sequaices (hr) using Blastp (proteiirprotein ELAST)0115]SoareE0116]Sequences producing significant alignments (Bits)Value0117]gbIAAD33058.11AF136608_1 antigen Cs44[Clonorchis sinensis]2492e-640118]gb IEAW95432.11 h0G1645603, isoforai CRA_b[HonD sapiens]1877e-460119]gb AA061699.1 antigen[Clonorchis sinensis]1862e-450120]sp|Q25060.11 LWAJfflEC RecName =Full = Lffamide neuropeptides ；Co. · ·1322e-290121]gb AAM18465.1 AF461711_1 proline rich antigen 2[Clonorchis s...127le-270122]gbIAAM18463.11AF461709_1 glycine rich antigen 2[Clonorchis s...1252e-270123]ref XP_844266. 1 hypothetical protein[Trypanosoma brucei TRE...1117e-230124]ref ZP_03206353.1 multiple banded antigen[Ureaplasma urealy...1062e-210125]gb AAT79412.1 multiple banded antigen[Ureaplasma urealyticum]1053e-210126]sp|Q27409. l|FPl_MYTGA RecName =Full = Adhesive plaque natrix pr. · ·1022e-200127]ref XP_001625536. 1 predicted protein[Nematostella vectensis...97.1le-180128]gb ABD75543.1 orflab polyprotein[Human coronavirus HKU1]95.54e-180129]sp|Q25460. l|FPl_MYTED RecName =Full = Adhesive plaque natrix pr. · ·94.49e-180130]gb AAT79415.1 multiple banded antigen[Ureaplasma urealyticum]92.43e-170131]ref|XP_002243306.11hypothetical protein BRAFLDRAFT_139244[B. · ·90.5le-160132]ref ZP_02558216. 1 multiple banded antigen[Ureaplasma urealy...90.1le-160133]gb|AAX23968. l|foot protein l[Mytilus edulis]88.65e_160134]ref|XP_001601102. l| PREDICTED similar to Sec24B protein, put. · ·84.76e_150135]gb AAK35165.1 proline-rich antigen[Clonorchis sinensis]84.77e-150136]ref ZP_02696229. 1 conserved hypothetical protein[Ureaplasma...82.05e-140137]ref XP_001818288. 1 hypothetical protein[Aspergillus oryzae...80.12e-130138]ref|XP_001714252. l| PREDICTED :similar to RE32881p[HonD sapi. · ·80.12e-130139]gb EED57898.1 cell surface protein, putative [Aspergillus fl...79.04e-130140]ref|XP_001377293. l| PREDICTED hypothetical protein [Monodelp. · ·78.27e-1權(quán)利要求
1.一種華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原，其特征在于所述的抗原基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1所示、或者所述的抗原基因的核苷酸序列與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列同源性達(dá)90%以上、或者其部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。
2.一種分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原蛋白，其特征在于由權(quán)利要求1所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列所編碼、或者與權(quán)利要求1所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列同源性達(dá)90%以上的核苷酸序列所編碼、或者由部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后的權(quán)利要求1所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列所編碼。
3.如權(quán)利要求2所述的分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示、或者對SEQ IDNO 4所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或者幾個氨基酸后的由SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求2所述的分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO :7所示、或者對SEQ IDNO :7所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或者幾個氨基酸后的由SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求2所述的分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示、或者對SEQ IDNO :8所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或者幾個氨基酸后的由SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
6.一種抗體，其特征在于特異性的結(jié)合權(quán)利要求2、或者權(quán)利要求3、或者權(quán)利要求4、 或者權(quán)利要求5所述的一種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的一種抗體，其特征在于所述的抗體為單克隆抗體。
8.一種載體，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因。
9.一種宿主細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求8所述的載體，或者用權(quán)利要求1所述的所述的一種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
10.一種疫苗，其特征在于含有權(quán)利要求6所述的抗體、或者權(quán)利要求2所述的分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求3所述的分離的華支睪吸蟲特異性 PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求4所述的分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求5所述的分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求8所述的載體。
11.權(quán)利要求2、或者權(quán)利要求3、或者權(quán)利要求4、或者權(quán)利要求5所述的一種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求6所述的抗體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求8所述的載體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求10所述的疫苗在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
15.一種試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求2—種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP 型抗原蛋白、或者權(quán)利要求3 —種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求4 一種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求5所述的一種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求6所述的抗體。
16.一種華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原，其特征在于所述的抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示、或者所述的抗原基因的核苷酸序列與SEQ ID NO :2所示核苷酸序列同源性達(dá)90%以上、或者其部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后如SEQ ID NO :2所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。
17.一種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白，其特征在于由權(quán)利要求16所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列所編碼、或者與權(quán)利要求16所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列同源性達(dá)90%以上的核苷酸序列所編碼、 或者由部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后的權(quán)利要求16所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列所編碼。
18.如權(quán)利要求17所述的分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白，其特征在于 其氨基酸序列如SEQ ID NO :5所示、或者對SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或者幾個氨基酸后的由SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
19.一種抗體，其特征在于特異性的結(jié)合權(quán)利要求17、或者權(quán)利要求18所述的一種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白。
20.如權(quán)利要求19所述的一種抗體，其特征在于所述的抗體為單克隆抗體。
21.一種載體，其特征在于含有權(quán)利要求16所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因。
22.如權(quán)利要求21所述的載體，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO :9所示。
23.一種宿主細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求21所述的載體，或者所述的細(xì)胞用權(quán)利要求16所述的所述的一種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
24.一種疫苗，其特征在于含有權(quán)利要求19所述的抗體、或者權(quán)利要求17所述的分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求18所述的分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求21所述的載體。
25.權(quán)利要求17、或者權(quán)利要求18所述的一種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
26.權(quán)利要求19所述的抗體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
27.權(quán)利要求21所述的載體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
28.權(quán)利要求M所述的疫苗在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
29.—種試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求17或者權(quán)利要求18所述的一種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求19所述的抗體。
30.一種華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原，其特征在于所述的抗原基因核苷酸序列如 SEQ ID NO :3所示、或者所述的抗原基因核苷酸序列與SEQ ID NO :3所示核苷酸序列同源性達(dá)90%以上、或者其部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。
31.一種分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原蛋白，其特征在于由權(quán)利要求30所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列所編碼、或者與權(quán)利要求30所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列同源性達(dá)90%以上的核苷酸序列所編碼、或者由部分經(jīng)過取代、缺失或者添加后的權(quán)利要求30所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列所編碼。
32.如權(quán)利要求31所述的分離的華支睪吸蟲特異性PPMP型抗原蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO :6所示、或者對SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或者添加一個或者幾個氨基酸后的由SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
33.一種抗體，其特征在于特異性的結(jié)合權(quán)利要求31所述的一種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求32所述的一種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白。
34.如權(quán)利要求33所述的一種抗體，其特征在于所述的抗體為單克隆抗體。
35.一種載體，其特征在于含有權(quán)利要求30所述的一種華支睪吸蟲的特異性抗原基因。
36.如權(quán)利要求35所述的載體，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDN0:10所示。
37.一種宿主細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求35所述的載體，或者所述的細(xì)胞用權(quán)利要求30所述的所述的一種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
38.一種疫苗，其特征在于含有權(quán)利要求31所述的一種分離的華支睪吸蟲的特異性 PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求32所述的一種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求33所述的抗體、或者權(quán)利要求35所述的載體。
39.權(quán)利要求31或者權(quán)利要求32所述的一種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
40.權(quán)利要求33所述的抗體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
41.權(quán)利要求35所述的載體在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
42.權(quán)利要求38所述的疫苗在制備治療、診斷或者預(yù)防華支睪吸蟲病的藥物中的應(yīng)用。
43.一種試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求31所述的一種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求32所述的分離的一種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白、或者權(quán)利要求33所述的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了三種華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原，還提供了三種特異性的結(jié)合華支睪吸蟲的特異性抗原的抗體。本發(fā)明還提供了三種分離的華支睪吸蟲的特異性PPMP型抗原蛋白，由華支睪吸蟲的特異性抗原基因的核苷酸序列所編碼。本發(fā)明還提供了三種含有華支睪吸蟲的特異性抗原基因的載體。本發(fā)明還提供了三種試劑盒。本發(fā)明還提供了上述的三種華支睪吸蟲的特異性抗原蛋白、抗體、載體和試劑盒在制備診斷華支睪吸蟲病的應(yīng)用。本發(fā)明的華支睪吸蟲PPMP型抗原具有較高的免疫原性，易制備多/單克隆抗體，進(jìn)而進(jìn)一步應(yīng)用于抗原檢測等方面，實驗證明實驗動物(小鼠)對該抗原免疫應(yīng)答較強。
文檔編號C07K16/18GK102250231SQ20101017868
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者馮正, 包意芳, 周巖, 徐斌, 董玉婷, 許學(xué)年 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所