本發(fā)明屬于熒光原位雜交探針應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種用于診斷mitf易位性腎癌的分離探針組合及其在制備mitf易位性腎癌診斷試劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

2016年新版who腎臟腫瘤病理組織學(xué)分類新增了一種腎細(xì)胞癌類型：mit家族易位性腎細(xì)胞癌。mit家族是小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子家族(microphthalmia-associatedtranscriptionfactorfamily)的縮寫，該家族成員包括mitf，tfe3、tfeb和tfec基因。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的mit家族易位性腎細(xì)胞癌包括xp11.2易位/tfe3基因融合相關(guān)性腎細(xì)胞癌和t(6；11)(p21；q12)易位/tfeb基因融合相關(guān)性腎癌。mitf和tfec基因易位的腫瘤在世界范圍內(nèi)暫無文獻(xiàn)報(bào)道。

mit家族易位性腎細(xì)胞癌致病機(jī)理清晰明確，mit家族成員基因(tfe3/tfeb)的易位是其關(guān)鍵致病因素：這類腫瘤均涉及mit家族成員基因同其它染色體易位及其所致形成融合基因，通過啟動(dòng)子變換從而高表達(dá)tfe3/tfeb融合蛋白，而tfe3/tfeb作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，通過與特異的dna結(jié)構(gòu)相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄調(diào)控體內(nèi)多種基因表達(dá)最終致病。目前至少有10種不同的易位伴侶和融合基因被報(bào)道，包括aspl-tfe3、prcc-tfe3、sfpq-tfe3、nono-tfe3、cltc-tfe3、luc7l3-tfe3、khsrp-tfe3、parp14-tfe3、dvl2-tfe3、rbm10-tfe3和malat1-tfeb等，每例腫瘤內(nèi)僅存在單一的易位形式。

mit家族易位性腎細(xì)胞癌是一罕見類型腫瘤，tfe3基因易位性腎癌約占所有腎細(xì)胞癌的1.6％-4％，tfeb基因易位性腎癌相對(duì)更加罕見。但該疾病以發(fā)病年齡輕為突出特征，占兒童腎細(xì)胞癌的40％，且造成極其沉重的家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)。此外，有明確證據(jù)表明mit家族易位性腎細(xì)胞癌的患者對(duì)血管內(nèi)皮生長因子受體(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，vegfr)或哺乳動(dòng)物雷帕霉素(mammaliantargetofrapamycin，mtor)分子靶向治療敏感。另有研究表明，met酪氨酸激酶為aspl-tfe3融合基因的靶基因，并有望成為tfe3易位性腫瘤的治療靶點(diǎn)。因此，精確診斷此類腫瘤顯得十分重要。

本發(fā)明團(tuán)隊(duì)通過高通量測(cè)序技術(shù)，在一例形態(tài)學(xué)符合mit家族易位性腎細(xì)胞癌特征的病例中檢測(cè)出prcc-mitf融合基因，該融合基因型為首次發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外均無報(bào)道，且這是國際首次發(fā)現(xiàn)mitf基因易位相關(guān)性腎細(xì)胞癌。由于以往沒有針對(duì)該基因易位的檢測(cè)手段，可以猜想，以往的mitf基因易位相關(guān)性腎細(xì)胞癌都被誤診或漏診了。

目前高通量測(cè)序是唯一可以明確未知易位位點(diǎn)的檢測(cè)手段，然而高通量測(cè)序費(fèi)用高昂，檢測(cè)周期長，檢測(cè)平臺(tái)稀缺，對(duì)樣品質(zhì)量要求高，不利于普及推廣，對(duì)于大多數(shù)患者來說也不是首選檢測(cè)手段。

染色體熒光原位雜交(fish)始于傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)和dna技術(shù)的結(jié)合，快速靈敏、特異性好，可以檢測(cè)隱匿或微小的染色體畸變以及復(fù)雜核型；還可以使用多種熒光標(biāo)記，顯示dna片段及基因之間的相對(duì)位置與方向，空間定位精確。此外，fish的方法，可以在石蠟包埋的樣本上進(jìn)行回顧性研究，大大降低了對(duì)研究樣本的要求。目前，利用熒光原位雜交(fish)診斷該腫瘤的方法國內(nèi)外均無報(bào)道。

應(yīng)用fish方法檢測(cè)可有兩種探針設(shè)計(jì)思路，一種是設(shè)計(jì)mitf基因分離探針，另一種是設(shè)計(jì)prcc-mitf基因融合探針。兩種設(shè)計(jì)各有優(yōu)缺點(diǎn)，融合探針檢測(cè)結(jié)果更精確具體，但由于mitf基因易位腫瘤以往未被發(fā)掘，暫時(shí)僅本課題組發(fā)現(xiàn)了一種易位伴侶(prcc基因)，不除外mitf易位性腫瘤也和同家族的tfe3一樣，具有多樣的易位伴侶，因此prcc-mitf融合探針恐怕不能篩選出所有mitf易位腫瘤。mitf分離探針則彌補(bǔ)這一缺陷，只要mitf基因發(fā)生斷裂，無論其易位伴侶是哪個(gè)基因，mitf分離探針均能檢測(cè)出陽性結(jié)果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明團(tuán)隊(duì)通過高通量測(cè)序技術(shù)，在一例形態(tài)學(xué)符合mit家族易位性腎細(xì)胞癌特征的病例中檢測(cè)出prcc-mitf融合基因,該基因?yàn)閙itf基因發(fā)生斷裂并易位至染色體其他位置與所在位置的基因形成的融合基因；具體是由prcc外顯子5和mitf外顯子4融合形成。mitf、prcc基因序列來自genebank，序列版本號(hào)grch38.p7,prcctranscript_id＝"xm_005245313.1",mitftranscript_id＝"nm_198159.2"。融合基因序列為：

tggtccccccccaggaaattgccccagatgcctccttcatcgatgacgaagcaggattttataagtttgaagagcaaaacagggcagagagcgagtgcccaggcatgaacacacattcacgagcg(seqidno.1)

本發(fā)明針對(duì)該mit家族易位性腎細(xì)胞癌的新融合基因設(shè)計(jì)了診斷mitf易位性腎癌的分離探針組合。

一種用于診斷mitf易位性腎癌的分離探針組合，該組合為bac克隆探針rp11-26p2和bac克隆探針rp11-963h1。

所述的探針組合，其中，bac克隆探針rp11-26p2定位于mitf著絲粒一側(cè)，標(biāo)記為任意一種顏色的熒光；bac克隆探針rp11-963h1定位于mitf端粒一側(cè)，標(biāo)記為與著絲粒一側(cè)標(biāo)記的顏色不同的熒光。

所述的分離探針組合，其中rp11-26p2優(yōu)選標(biāo)記為綠色熒光，rp11-963h1優(yōu)選標(biāo)記為紅色熒光；標(biāo)記的熒光顏色可以互換。

本發(fā)明所述的探針在制備mitf易位性腎癌診斷試劑中的應(yīng)用。

一種mitf易位性腎癌診斷試劑盒，包含本發(fā)明所述的探針組合。

以下是本發(fā)明技術(shù)方案詳細(xì)的說明：

本發(fā)明中，mitf著絲粒一側(cè)bac克隆片段為rp11-26p2(片段長度163kb),mitf端粒一側(cè)bac克隆片段為rp11-963h1(片段長度196kb)，這些片段為細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome，bac)克隆，其在人類染色體上的定位已經(jīng)公開，分別為rp11-26p2，定位于3號(hào)染色體69542872-69705988和rp11-963h1，定位于3號(hào)染色體70151790-70348243。mitf基因的定位為3號(hào)染色體69788586-70017488。bac克隆片段與mitf基因的鏈接順序?yàn)閞p11-26p2，mitf，rp11-963h1。

mitf基因與染色體上結(jié)合的bac克隆片段之間保持一定距離而不會(huì)重疊(本發(fā)明中最大為134kb，最小為83kb)，因而mitf基因內(nèi)部的斷裂重排不會(huì)影響bac克隆片段與染色體相應(yīng)位置結(jié)合。這樣，由于采用的bac克隆片段大小相近(本發(fā)明中兩個(gè)探針相差僅為33kb)，兩端bac克隆片段之間最遠(yuǎn)距離控制在1500kb以內(nèi)，彼此之間存在適當(dāng)?shù)拈g隔，使得在進(jìn)行熒光觀察時(shí)，端粒側(cè)bac克隆片段顯示一種熒光，如紅色，著絲粒側(cè)bac克隆片段顯示另一種熒光，如綠色，在非mitf易位性腎癌時(shí)，mitf基因不斷裂，紅綠兩種熒光靠得比較近，觀察時(shí)出現(xiàn)紅綠融合信號(hào)(表現(xiàn)為紅綠相連或黃色信號(hào)點(diǎn))，而在mitf易位性腎癌時(shí)，mitf基因斷裂，導(dǎo)致紅綠兩種熒光離得比較遠(yuǎn)，觀察時(shí)無需放大即可見到分離較遠(yuǎn)的紅綠兩種信號(hào)，很容易觀察。

選擇這2種bac克隆片段有以下兩個(gè)方面的考慮：①兩個(gè)片段位于mitf基因兩側(cè)，因此只要mitf基因發(fā)生斷裂，無論易位對(duì)象是哪個(gè)基因，均能得到陽性檢測(cè)結(jié)果。②這兩個(gè)bac克隆片段大小相近，帶來的好處是：每一端的熒光強(qiáng)度保持一致，防止一端過強(qiáng)而另一端過弱而影響觀察；另外可使原位雜交條件保持一致性。③可使mitf基因兩端bac克隆片段最遠(yuǎn)距離控制在1500kb之內(nèi)，兩種熒光顏色之間存在mitf基因，使得在mitf基因未斷裂時(shí)呈現(xiàn)融合信號(hào)(如表現(xiàn)為紅綠相連或黃色信號(hào)點(diǎn))，而在mitf基因斷裂時(shí)兩種熒光顏色分離比較遠(yuǎn)，很容易觀察。否則，若mitf基因兩端bac克隆片段最遠(yuǎn)距離過大，如超過1500kb甚至更大，則無論mitf基因是否斷裂，均觀察到明顯分離的兩種熒光，就很難判斷是否存在mitf易位性腎癌。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明根據(jù)mitf易位性腎癌的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)結(jié)合在mitf基因兩端的熒光標(biāo)記dna探針組合，在石蠟包埋組織切片的基礎(chǔ)上進(jìn)行原位雜交，檢測(cè)融合及分離信號(hào)，可大大提高診斷該類腫瘤的準(zhǔn)確率，為分子靶向治療提供依據(jù)。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該探針組合診斷的特異性和敏感性均達(dá)到了100％，且操作對(duì)象只需要在石蠟包埋組織切片上進(jìn)行，時(shí)間僅為兩個(gè)工作日。采用本發(fā)明提供的探針組合進(jìn)行檢測(cè)mitf易位性腎癌，不但方便、快速、可靠而且成功率高，可用于制備mitf易位性腎癌診斷試劑盒，為mitf易位性腎癌的快速準(zhǔn)確的診斷提供了新的工具。

附圖說明

圖1：bac克隆探針定位模式圖。

圖2：mitf易位性腎癌融合基因的測(cè)序圖

rt－pcr結(jié)果示1例mitf易位性腫瘤組織檢測(cè)出prcc-mitf融合基因(prcc外顯子5與mitf外顯子4相連)；

圖3：mitf易位性腎癌腫瘤組織細(xì)胞核內(nèi)箭頭所指可見1個(gè)紅綠融合信號(hào)(紅綠重疊部分表現(xiàn)為黃色，放大后觀察實(shí)為靠得很近的紅綠信號(hào))和1對(duì)紅綠分離信號(hào)(無需放大即可清楚地觀察到紅綠信號(hào)分離較遠(yuǎn))，代表一條染色體上mitf基因完整而另一條染色體mitf基因斷裂。

圖4：正常腎組織每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)可見2個(gè)紅綠融合信號(hào)(紅綠重疊部分表現(xiàn)為黃色，放大后觀察實(shí)為靠得很近的紅綠信號(hào))，代表2條染色體上的mitf基因均完整。

圖5：乳頭狀腎細(xì)胞癌中每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)可見2個(gè)紅綠融合信號(hào)(紅綠重疊部分表現(xiàn)為黃色，放大后觀察實(shí)為靠得很近的紅綠信號(hào))，未見紅綠分離信號(hào)。

圖6：透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌中每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)可見2個(gè)紅綠融合信號(hào)(紅綠重疊部分表現(xiàn)為黃色，放大后觀察實(shí)為靠得很近的紅綠信號(hào))，未見紅綠分離信號(hào)。

圖7：tfe3易位性腎癌中每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)可見2個(gè)紅綠融合信號(hào)(紅綠重疊部分表現(xiàn)為黃色，放大后觀察實(shí)為靠得很近的紅綠信號(hào))，未見紅綠分離信號(hào)。

圖8：tfeb易位性腎癌中每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)可見2個(gè)紅綠融合信號(hào)(紅綠重疊部分表現(xiàn)為黃色，放大后觀察實(shí)為靠得很近的紅綠信號(hào))，未見紅綠分離信號(hào)。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。

實(shí)施例中所述的探針即bac克隆片段，也可以叫bac克隆探針。

實(shí)施例1：dna探針組合的制備：

選擇能夠在3號(hào)染色體mitf基因兩端分別連接的2個(gè)bac克隆片段，控制兩端探針之間最遠(yuǎn)距離在1500kb以內(nèi)，bac克隆片段之間保持一定距離不重疊，片段大小相近?？寺∑纬鎏帪閑mpiregenomics公司的人類bac克隆中心(http://www.empiregenomics.com/helixhq/clonecentral/search/human)。mitf著絲粒一側(cè)bac克隆片段為rp11-26p2(片段長度163kb),mitf端粒一側(cè)bac克隆片段為rp11-963h1(片段長度196kb)。bac克隆片段與mitf基因的鏈接順序?yàn)閞p11-26p2，mitf，rp11-963h1。探針組合的定位結(jié)構(gòu)如圖1所示。利用缺口平移方法將端粒側(cè)的bac克隆片段標(biāo)記成任意一種顏色的熒光，優(yōu)選紅色熒光，將著絲粒側(cè)的bac克隆片段標(biāo)記成與著絲粒一側(cè)標(biāo)記的顏色不同的熒光，優(yōu)選綠色熒光；兩端標(biāo)記的熒光顏色可以互換。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(由美國empiregenomics公司提供上述這些服務(wù))。mitf著絲粒一側(cè)bac克隆片段在熒光顯微鏡下為一個(gè)綠色熒光信號(hào)，代表mitf基因著絲粒側(cè)。mitf端粒一側(cè)bac克隆片段在熒光顯微鏡下為一個(gè)紅色熒光信號(hào)，代表mitf基因端粒側(cè)。兩端標(biāo)記的熒光顏色可以互換。正常情況下紅綠信號(hào)相連或重疊為融合信號(hào)，在mitf易位性腎癌時(shí)，由于3號(hào)染色體mitf基因斷裂易位使得紅綠信號(hào)分離。

進(jìn)一步，可將制備的探針組合采用熒光原位雜交方法，在mitf易位性腎癌、非mitf易位性腎癌和癌旁組織中驗(yàn)證其定位和/或診斷效果是否可靠。

實(shí)施例2：熒光原位雜交過程：

通過高通量測(cè)序及rt-pcr檢測(cè)融合基因結(jié)果確診mitf易位性腎癌1例(圖2，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互對(duì)應(yīng)更能體現(xiàn)出本實(shí)驗(yàn)的可靠性)，以及由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生參照who2016泌尿及男性生殖系統(tǒng)分類標(biāo)準(zhǔn)，收集南京軍區(qū)南京總醫(yī)院診斷腎細(xì)胞癌30例作為對(duì)照組。

蠟塊3μm厚切片，在脫蠟后，依次置于100％、85％、70％乙醇中各2min，隨后浸入去離子水中，100℃水浴15min。將組織切片放入胃蛋白酶k溶液(0.1g胃蛋白酶，40ml0.01mhcl)37℃，15min；2×ssc(氯化鈉、檸檬酸鈉)漂洗2次，各5min，切片置于0.1mol/lhcl中室溫浸泡10min，用2×ssc漂洗2次，各5min；經(jīng)70％、85％、100％乙醇各脫水2min，于空氣中干燥；在組織區(qū)域加10μl探針混合液(其中每個(gè)探針各1μl，2個(gè)探針共2μl，另加8μl的雜交緩沖液，雜交緩沖液在購買探針時(shí)由empiregenomics公司提供，內(nèi)含人類cot1dna)，加蓋玻片，用橡皮膠封邊；放入原位雜交儀(geneampinsitupcrsystem1000)中88℃變性6min后37℃過夜(16h)；移去蓋玻片，將玻片置于0.4×ssc(氯化鈉、檸檬酸鈉、0.3％np-40)溶液中，69℃漂洗1min；2×ssc(氯化鈉、檸檬酸鈉、0.1％np-40)溶液中漂洗1min，70％乙醇3min，室溫暗處干燥；靶區(qū)域滴加10μl4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindoledapi)，用蓋玻片封片后，再用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

結(jié)果判定：

正常細(xì)胞可見2個(gè)紅綠融合信號(hào)，表現(xiàn)為紅綠相連或黃色信號(hào)點(diǎn)。

mitf易位性腎癌病例的mitf易位性腫瘤細(xì)胞，可見一個(gè)正常的融合信號(hào)和一對(duì)異常的紅綠分離信號(hào)。

為排除假陽性和假陰性，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，只有當(dāng)4個(gè)熒光信號(hào)均存在時(shí)，才納入計(jì)數(shù)對(duì)象(無論正常和腫瘤我們都會(huì)看到4個(gè)單信號(hào)(兩綠和兩紅)，只不過在正常組織紅綠信號(hào)是成對(duì)融合的，看上去是兩個(gè)融合信號(hào)，但實(shí)際是由四個(gè)單信號(hào)組成。在腫瘤中見到一個(gè)融合信號(hào)和一對(duì)紅綠分離的單信號(hào)，表面上看是3個(gè)信號(hào)，但實(shí)際還是由4個(gè)單信號(hào)組成的)。紅綠熒光信號(hào)之間的距離大于一個(gè)信號(hào)寬度時(shí)計(jì)為分離信號(hào)。當(dāng)異常信號(hào)大于10％時(shí)記為陽性。以上結(jié)果判斷方法依據(jù)市面上多數(shù)類似的商業(yè)化探針?biāo)惺沟脑u(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，如vysis公司和dako公司的探針使用方法。

結(jié)果：

我們對(duì)31例腎癌進(jìn)行檢測(cè)，其中mitf易位性腎癌1例、tfe3易位性腎癌6例、tfeb易位性腎癌4例、透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌10例、乳頭狀腎細(xì)胞癌10例。結(jié)果1例mitf易位性腎癌檢測(cè)出異常分離信號(hào)(圖3)，其陽性細(xì)胞數(shù)范圍在85％，其余對(duì)照組腫瘤組織及癌旁正常腎組織均未檢測(cè)出異常信號(hào)(圖4－8給出了正常腎組織、乳頭狀腎細(xì)胞癌、透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌、tfe3易位性腎癌、tfeb易位性腎癌的陰性圖片)。說明使用該探針檢測(cè)mitf易位性腎癌的特異性和敏感性同為100％

敏感性＝真陽性/所有mitf易位性腎癌腫瘤病人數(shù)×100％；

特異性＝真陰性/所有非mitf易位性腎癌腫瘤病人數(shù)×100％；

評(píng)價(jià)：

本組探針使用的克隆片段相對(duì)較少，且克隆片段大小相對(duì)一致，在設(shè)計(jì)上即考慮到了經(jīng)濟(jì)性又考慮到了原位雜交條件的一致性。此外，在本實(shí)驗(yàn)中mitf雙色破裂分離熒光原位雜交探針的特異性和敏感性均達(dá)到了100％。利用fish技術(shù)，使用mitf雙色破裂分離熒光原位雜交探針來診斷mitf易位性腎癌?？焖?、可靠且成功率高，是診斷mitf易位性腎癌的一項(xiàng)新技術(shù)，值得推廣。

序列表

<110>中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院

<120>一種用于診斷mitf易位性腎癌的分離探針組合及其應(yīng)用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>125

<212>dna

<213>人類(human)

<400>1

tggtccccccccaggaaattgccccagatgcctccttcatcgatgacgaagcaggatttt60

ataagtttgaagagcaaaacagggcagagagcgagtgcccaggcatgaacacacattcac120

gagcg125