一種快速鑒定多主棒孢菌對氟吡菌酰胺抗藥性的方法及專用引物對與流程

文檔序號：12300252閱讀：627來源：國知局

本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及多主棒孢菌琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb的克隆及其在氟吡菌酰胺抗性檢測及監(jiān)測中的應用，具體公開一種快速鑒定多主棒孢菌對氟吡菌酰胺抗藥性的方法及專用引物對。

背景技術(shù)：

近年來，多主棒孢菌(corynesporacassiicola(berk.&m.a.curtis)c.t.wei)引起的黃瓜棒孢葉斑病在我國黃瓜生產(chǎn)上已由次要病害上升為一種主要病害。田間發(fā)病一般減產(chǎn)20％，嚴重時可達60％～70％。該病害于1906年在歐洲首次報道，1957年美國的北卡羅來納州報道了該病害的發(fā)生，20世紀60年代，戚佩坤等首次在我國報道了該病害的發(fā)生。20世紀90年代，房德純等報道了該病害已成為遼寧省瓦房店市保護地黃瓜主要病害。近年來，在我國遼寧，河北，山東，河南，甘肅等19個省市該病已發(fā)展成為主要病害，給黃瓜生產(chǎn)造成嚴重損失，成為保護地黃瓜生產(chǎn)中亟待解決的葉部病害之一。

多主棒孢菌，隸屬于子囊菌門座囊菌綱格孢菌目棒孢科棒孢屬，是一種遺傳變異性較大的真菌。該均能夠侵染植株的葉片、莖稈和根以及線蟲的孢囊和人的皮膚，其寄主植物包括380個屬的530種植物，包括單子葉、雙子葉等。由于該病原菌是一種高度變異的群體，因此在使用抗性品種進行病害控制時存在持效期短的問題?；瘜W防治成為目前是防治該病害最為重要的手段。目前國內(nèi)外已報道的對黃瓜棒孢葉斑病有效的化學藥劑主要包括啶酰菌胺、甲霜靈、氟吡菌酰胺、甲基硫菌靈、嘧菌酯、咪鮮胺、福美雙、異菌脲、多菌靈、百菌清、吡唑醚菌酯、代森錳鋅、噁唑菌酮及它們的混配制劑及系統(tǒng)性抗病誘導劑苯并噻二唑。其中最具有代表性的是以氟吡菌酰胺和啶酰菌胺為代表的琥珀酸脫氫酶抑制劑(succinatedehydrogenaseinhibitors，sdhis)。sdhis是殺菌劑抗性行動協(xié)會(frac)按照其相似的作用機制和抗性機理新劃分出的結(jié)構(gòu)上屬酰胺類的殺菌劑。其作用靶標為病原真菌線粒體呼吸鏈上的琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase，sdh)，即復合物ⅱ或琥珀酸：泛醌氧化還原酶(succinate：ubiquinoneoxidoreductase，sqr)。包括氟吡菌酰胺，啶酰菌胺，吡噻菌胺，萎銹靈等共18種殺菌劑。該類殺菌劑由于活性高，殺菌譜廣而在全世界范圍內(nèi)被廣泛用于農(nóng)作物病害的防治。

目前，已有14種植物病原真菌報道了對該類殺菌劑的抗性發(fā)生，且大部分關(guān)于抗性機制報道的文章均將引起病原真菌抗藥性的因子鎖定在了琥珀酸脫氫酶的b/c/d亞基基因的位點突變上，其中多主棒孢菌對啶酰菌胺的抗藥性機制研究表明不同抗性水平的多主棒孢菌，其機制不同。對于超高抗菌株，主要發(fā)生sdhb-h278y(cac-tac)突變，對于高抗菌株，主要發(fā)生sdhb-h278r(cac-cgc)突變，對于中抗菌株，抗性突變包括sdhc-s73p(tcg-ccg),sdhd-g109v(ggc-gtc)，sdhd-s89p(tcc-ccc)。

用于植物病原菌抗藥性檢測或監(jiān)測的傳統(tǒng)生物學方法，包括菌落生長測定法、孢子萌發(fā)測定法等，均是通過測定藥劑對植物病原菌的ec50以區(qū)分敏感和抗性菌株，比較耗時費力。近年來，隨著核酸相關(guān)分子檢測技術(shù)的快速發(fā)展與進步，分子生物學技術(shù)在病原菌抗藥性檢測以及監(jiān)測中得到了廣泛的應用，例如as-pcr(allele-specificpcr)以及pcr-rflp(restrictionfragmentlengthpolymorphism)。相比于傳統(tǒng)的檢測方法，后者從dna提取到特異性pcr或酶切分析，耗時短、靈敏度高，檢測頻率在10^-5～10^-4，適于檢測低頻抗藥性基因，是一種田間抗藥性早期檢測或監(jiān)測的理想方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明一個目的是提供檢測多主棒孢菌基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基的物質(zhì)的用途。

本發(fā)明提供了多主棒孢菌基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基的物質(zhì)在檢測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺抗性中的應用；

所述a1020g位點為所述琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因中第1020位；

所述a1020g位點的堿基為a或g。

本發(fā)明另一個目的是提供檢測多主棒孢菌基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基第280位氨基酸殘基的物質(zhì)的用途。

本發(fā)明提供了檢測多主棒孢菌基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基第280位氨基酸殘基的物質(zhì)在檢測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺抗性中的應用；

所述第280位氨基酸殘基為所述琥珀酸脫氫酶b亞基氨基酸序列第280位；

所述第280位氨基酸殘基為ile或val。

本發(fā)明第3個目的是提供一種檢測或輔助檢測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺抗性的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：檢測待測多主棒孢菌中基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基，所述a1020g位點的堿基為a或g；若該位點的堿基為a，則該多主棒孢菌為或候選為對氟吡菌酰胺敏感；若該位點的堿基為g，則該多主棒孢菌為或候選為對氟吡菌酰胺具有抗性。

本發(fā)明第4個目的是提供一種檢測或輔助檢測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺抗性的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：檢測待測多主棒孢菌中基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因編碼的蛋白第280位的氨基酸殘基，所述第280位氨基酸殘基為ile或val；若該位點的氨基酸殘基為ile，則該多主棒孢菌為或候選為對氟吡菌酰胺敏感；若該位點的氨基酸殘基為val，則該多主棒孢菌為或候選為對氟吡菌酰胺具有抗性。

本發(fā)明第5個目的是提供一種檢測或輔助檢測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺抗性的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：檢測待測多主棒孢菌中基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基，所述a1020g位點的堿基為a或g；該位點的堿基為g的待測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺的抗性高于該位點的堿基為a的待測多主棒孢菌。

本發(fā)明第5個目的是提供一種檢測或輔助檢測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺抗性的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：檢測待測多主棒孢菌中基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因編碼的蛋白的第280位的氨基酸殘基，所述第280位氨基酸殘基為ile或val；該位點的氨基酸殘基為val的待測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺的抗性高于該位點的氨基酸殘基為異亮氨酸的待測多主棒孢菌。

上述方法中，

所述檢測待測多主棒孢菌中基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因編碼的蛋白第280位的氨基酸殘基通過檢測待測多主棒孢菌中基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基實現(xiàn)；

所述檢測待測多主棒孢菌中基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基通過如下1)或2)方法實現(xiàn)：

1)測序；

2)用所述檢測多主棒孢菌基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基的物質(zhì)擴增所述待測多主棒孢菌，檢測擴增產(chǎn)物，若所述擴增產(chǎn)物得到特異片段，則所述檢測待測多主棒孢菌中基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基為g，若擴增產(chǎn)物未得到特異片段，則所述檢測待測多主棒孢菌中基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基為a；

所述檢測多主棒孢菌基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基的物質(zhì)包括如下a或b：

a)擴增所述a1020g位點的引物對；

b)含有所述引物對的pcr試劑或試劑盒。

上述方法中，

所述擴增所述a1020g位點的引物對由序列5所示的核苷酸和序列6所示的核苷酸組成；

或所述特異片段大小為250-270bp；

或所述擴增的退火溫度為61.4-68.4℃。

上述應用或上述方法中的所述檢測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺抗性的物質(zhì)也是本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明第6個目的是提供一種檢測待測多主棒孢菌中基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：用所述檢測多主棒孢菌基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基的物質(zhì)擴增所述待測多主棒孢菌，檢測擴增產(chǎn)物，若所述擴增產(chǎn)物得到特異片段，則所述檢測待測多主棒孢菌中基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基為g，若擴增產(chǎn)物未得到特異片段，則所述檢測待測多主棒孢菌中基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基為a；

所述檢測多主棒孢菌基因組中的琥珀酸脫氫酶b亞基編碼基因a1020g位點堿基的物質(zhì)包括如下a或b：

a)擴增所述a1020g位點的引物對；

b)含有所述引物對的pcr試劑或試劑盒。

上述方法的中，所述擴增所述a1020g位點的引物對由序列5所示的核苷酸和序列6所示的核苷酸組成；

或所述特異片段大小為250-270bp，在實施例中具體為260bp，核苷酸序列為序列1中自5’末端起第785至1044位。

或所述擴增的退火溫度為61.4-68.4℃。

本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供檢測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺產(chǎn)生抗藥性的點突變的方法，可以用于快速、靈敏地檢測田間多主棒孢菌對氟吡菌酰胺的抗性發(fā)生發(fā)展動態(tài)，以便及時調(diào)整黃瓜棒孢葉斑病的防治策略，以延緩和控制抗藥性的進一步發(fā)展。

附圖說明

圖1為對氟吡菌酰胺表現(xiàn)抗性和敏感的多主棒孢菌菌株琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb全序列比對結(jié)果。

圖2為對氟吡菌酰胺表現(xiàn)抗性和敏感的多主棒孢菌菌株琥珀酸脫氫酶b亞基sdhb全序列比對結(jié)果。

圖3為采用不同as-pcr引物對進行溫度梯度pcr擴增電泳圖。

圖4為引物對特異性檢測結(jié)果。

圖5為引物對靈敏度檢測結(jié)果。

圖6為引物對在檢測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺抗性中的應用。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

文中“抗性菌株”均指對氟吡菌酰胺抗性或?qū)Ψ辆０積c50大于等于25μg/ml的多主棒孢菌菌株；“敏感菌株”均指對氟吡菌酰胺敏感或?qū)Ψ辆０積c50小于2μg/ml的多主棒孢菌菌株。

下述實施例中使用的多主棒孢菌菌株：hg15050729-5(cgmccno.14544)、hg15050825-6、hg15050731和hg15050737為抗性菌株；hg14102405-2,hg14102524-4(cgmccno.14543)，hg15050755-3、hg15041321-2和hg15041414-2為敏感菌株。

上述菌株hg15050755-3、hg15050729-5及hg15050825-6均由本課題組成員于2015年采自于中國遼寧地區(qū)；hg15041321-2和hg15041414-2采自于中國山東地區(qū)。hg14102405-2和hg14102524-4采自于中國河北地區(qū)。以上各菌株均經(jīng)過現(xiàn)有的形態(tài)學和分子生物學方法鑒定為多主棒孢菌菌株。上述各菌株均經(jīng)過菌落生長速率法進行敏感性測定和抗藥性驗證。

實施例1、多主棒孢菌中琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb及其對應蛋白突變位點的發(fā)現(xiàn)

一、多主棒孢菌對氟吡菌酰胺的敏感性測定

5株敏感菌株hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2、hg14102405-2和hg14102524-4；4株抗性菌株hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(pda)：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水定容至1l，121℃濕熱滅菌30min。

1)將氟吡菌酰胺用丙酮配成5×10⁴μg/ml的母液。對于5株多主棒孢菌敏感菌株及4株多主棒孢菌抗性菌株的敏感性測定，將氟吡菌酰胺稀釋成10μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10000μg/ml和25000μg/ml的濃度梯度。

2)按由低到高的順序，用移液槍吸取各個濃度梯度的藥液135μl加入已滅菌的冷卻至55℃的135mlpda培養(yǎng)基中，使溶劑含量為1‰，混勻，將含藥的培養(yǎng)基倒入直徑為5.5cm的培養(yǎng)皿中，以只加135μl丙酮的處理為空白對照。每個濃度重復3次。

3)自保存于4℃的斜面上活化供試菌株，26℃下黑暗培養(yǎng)5天后，用打孔器沿菌落邊緣打取直徑為0.5cm的菌餅，菌絲面向下接種于步驟2)中的含藥和對照平板中，置于26℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，5d后測量菌落直徑。

4)十字交叉法測量菌落直徑，根據(jù)菌落平均直徑值計算出各個濃度下對供試多主棒孢菌菌株的菌絲生長抑制率。然后運用sas9.4probit分析計算各菌株的ec50值及其置信區(qū)間。

結(jié)果如表1所示，敏感性測定結(jié)果表明，氟吡菌酰胺對敏感菌株hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2、hg14102405-2和hg14102524-4的ec50均小于2μg/ml，而對抗性菌株hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6的ec50均大于25μg/ml，抗性倍數(shù)均在12.5倍以上。

表15株多主棒孢菌敏感菌株和4株多主棒孢菌抗性菌株對氟吡菌酰胺的敏感性

二、多主棒孢菌中琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb及其對應蛋白突變位點的發(fā)現(xiàn)

1、菌株：抗性菌株hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6，敏感菌株hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2、hg14102405-2和hg14102524-4。

2、方法：

1)模板：分別以抗性菌株和敏感菌株的基因組dna為模板。

2)琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb全序列的pcr擴增

引物(表2)：ccsdhb-f(5’-cgcaacgacactcttctt-3’)

ccsdhb-r(5’-ccattcagcaacgactct-3’)

采用北京博邁德科技發(fā)展有限公司試劑，50μl反應體系中包括2μl模板dna(30-50ng)，每條引物(10μm)2μl，25μl2×taqmix(購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司)，19μlddh2o，反應體系根據(jù)后續(xù)試驗需要進行成倍增減。反應程序為：預變性94℃5min；94℃45s，58℃45s，72℃2min，35個循環(huán)；最后72℃下延伸5min。擴增產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

3)測序

將pcr產(chǎn)物進行測序，測序引物見表2。以基因組dna為模板時，抗性菌株的琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb全序列共1106bp，序列如序列1所示，存在3段內(nèi)含子序列，共編碼307個氨基酸，序列如序列2所示。

分別將抗性菌株hg15050729-5hg15050731、hg15050737和hg15050825-6，與敏感菌株hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2和hg14102405-2的琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb全序列進行測序。通過danman軟件分析序列結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在如下突變位點：與敏感菌株相比，抗性菌株hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6的琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb自5’末端起在基因序列的第1020位核苷酸由a突變?yōu)間(圖1)，該位點為a1020g的突變位點，該位點堿基突變導致氨基酸序列在第280位發(fā)生突變，由異亮氨酸(ile，i)突變?yōu)槔i氨酸(val，v)(圖2)。

上述抗性菌株hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6中的琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb核苷酸序列為序列1，其編碼的蛋白琥珀酸脫氫酶b亞基的氨基酸序列為序列2，抗性菌株中的琥珀酸脫氫酶b亞基記作多主棒孢菌琥珀酸脫氫酶b亞基突變體，命名為sdhb-v280。

上述敏感菌株hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2、hg14102405-2和hg14102524-4中的琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb核苷酸序列為序列3，其編碼的蛋白琥珀酸脫氫酶b亞基的氨基酸序列為序列4，敏感菌株中的琥珀酸脫氫酶b亞基記作多主棒孢菌琥珀酸脫氫酶b亞基，命名為sdhb-i280。

序列1為將序列3第1020位a突變?yōu)間，其他核苷酸不變得到的序列；

序列2為將序列4第280位i突變?yōu)関，其他氨基酸不變得到的序列。

因此，可以通過檢測多主棒孢菌琥珀酸脫氫酶b亞基基因核苷酸序列第1020位的堿基是a還是g，來檢測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺為抗性還是敏感。

實施例2、檢測多主棒孢菌中突變位點a1020g的方法

一、引物設(shè)計、篩選及擴增方法

菌株為實施例1中所用菌株hg15050729-5、hg15050825-6、hg14102524-4、hg14102405-2、hg15041321-2、hg15041414-2、hg15050755-3。

根據(jù)突變體hg15050729-5琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb的序列設(shè)計as-pcr引物。引物對cc1020f-cc1020a/t/c/g.c.r用于檢測a1020g的突變位點。其中，反向引物cc1020a.c.r的3’-端最后一個堿基為突變后的堿基，正向引物為cc1020f(表2)。為了增加引物的特異性，在反向引物3’-端第2和第3個堿基引入錯配堿基(表2，引物cc1020t/c/g.c.r)。

表2檢測對氟吡菌酰胺表現(xiàn)抗性的多主棒孢菌菌株所使用的pcr引物

以待測多主棒孢菌的基因組dna為模板，采用cc1020f和cc1020a/t/c/g.c.r進行pcr擴增，25μl擴增體系為：1μl模板dna(30-50ng)，每條引物(10μm，在l擴增體系中的濃度為0.4μm/l)1μl，12.5μl2×taqmix(購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司)，9.5μlddh2o。對各引物對進行不同退火溫度梯度pcr，確定特異性高的退火溫度。反應程序為：預變性94℃5min；94℃30s，50-70℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；最后72℃下延伸5min。擴增產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

結(jié)果如圖3所示，s：敏感菌株；r：抗性菌株；由上至下正向引物依次為cc1020a.c.r、cc1020t.c.r、cc1020c.c.r、cc1020g.c.r，正向引物均為cc1020f，引物對cc1020f-cc1020a/c.c.r在51.3-68.4℃的退火溫度下能從敏感菌株和抗性菌株的基因組dna中擴增出260bp的片段，不能很好地將之區(qū)分開。當退火溫度為61.4-68.4℃時，引物對cc1020f-cc1020t/g.c.r能夠從抗性菌株hg15050729-5的基因組dna中擴增出260bp的片段。其中cc1020f-cc1020g.c.r引物對在該溫度下亦能從敏感菌株中擴增出微弱的條帶，而cc1020f-cc1020t.c.r不能從敏感菌株中擴增出相應的片段。

因此選擇cc1020f-cc1020t.c.r引物對作為as-pcr引物用來檢測a1020g的突變位點，退火溫度為61.4-68.4℃。

將引物對cc1020f-cc1020t.c.r對抗性菌株hg15050729-5的擴增產(chǎn)物260bp的片段進行測序，結(jié)果260bp的片段的核苷酸序列為序列1中自5’末端起第785至1044位。

因此，檢測多主棒孢菌中突變位點a1020g的試劑盒包括cc1020f和cc1020t.c.r組成的引物對；

或檢測多主棒孢菌中突變位點a1020g的試劑盒包括含有cc1020f和cc1020t.c.r組成的引物對的pcr試劑，該pcr試劑包括：cc1020f、cc1020t.c.r、2×taqmix和水，其中cc1020f、cc1020t.c.r在試劑中的濃度分別為0.4μm/l和0.4μm/l。

二、引物對的特異性檢測

以供試多主棒孢菌和其他真菌及細菌的基因組dna為模板，采用cc1020f和cc1020t.c.r進行pcr擴增。

25μl擴增體系為：1μl模板dna(30-50ng)，每條引物(0.4μm/l)1μl，12.5μl2×taqmix(購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司)，9.5μlddh2o。

反應程序為：94℃5min；94℃30s，68℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃下延伸5min。擴增產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

結(jié)果如圖4所示，m：marker(bm5000，北京博邁德科技發(fā)展有限公司)；1,多主棒孢菌(corynesporacassiicola)hg15050729-5(抗性)；2,多主棒孢菌(c.cassiicola)hg15050825-6(抗性)；3,多主棒孢菌(c.cassiicola)hg14102524-4(敏感)；4,辣椒疫霉菌(phytophthoracapsici)lj12010805；5,茄病鐮刀(fusariumsolani)hg13060501；6,煤污假尾孢(pseudocercosporafuligena)fq10013003；7,茄匍柄霉菌(stemphyliumsolani)fq14111912；8,多主棒孢菌(c.cassicola)hg15030802(敏感)；9,尖孢鐮刀菌(fusariumoxysporum)hg15060516；10,立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)dbc16070604；11,灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)fq13010701；12,茄鏈格孢菌(alternariasolani)jgfq15080702；13,丁香假單胞菌黃瓜致病變種(pseudomonassyringaepv.lachrymans)hg1501050702；14,胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(pectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliensis)hg0903060203；15,陰性對照“-”；引物對cc1020f-cc1020t.c.r僅能從攜帶sdhb-v280突變的多主棒孢菌株中擴增出大小為260bp的片段。

三、引物對的靈敏度檢測

對供試的多主棒孢菌hg15050729-5的基因組dna(nanodrop2000測定其初始濃度為：9.9ng/μl)進行10倍梯度稀釋(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9)，采用cc1020f和cc1020t.c.r進行pcr擴增。

25μl擴增體系為：1μl模板dna(30-50ng)，每條引物(0.4μm/l)1μl，12.5μl2×taqmix(購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司)，9.5μlddh2o。

反應程序為：預變性94℃5min；94℃30s，68.4℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃下延伸5min。擴增產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

結(jié)果如圖5所示，m：marker(bm5000，北京博邁德科技發(fā)展有限公司)；1,9.9ng/μl；2,9.9×10^-1ng/μl；3,9.9×10^-2ng/μl；4,9.9×10^-3ng/μl；5,9.9×10^-4ng/μl；6,9.9×10^-⁵ng/μl；7,9.9×10^-6ng/μl；8,9.9×10^-7ng/μl；9,9.9×10^-8ng/μl；10,9.9×10^-9ng/μl；11,陰性對照“-”，可以看出，該體系的檢測靈敏度為9.9×10^-2ng/μl。

四、檢測多主棒孢菌中突變位點a1020g的引物對在檢測多主棒孢菌對氟吡菌酰胺抗性中的應用

以待測多主棒孢菌hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2、hg14102405-2、hg14102524-4、hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6的基因組dna為模板，采用引物對cc1020f-cc1020t.c.r進行pcr擴增。

pcr反應體系如下：

25μl反應體系中包括1μl模板dna(30-50ng)，cc1020f(0.4μm/l)和cc1020t.c.r(0.4μm/l)各1μl，12.5μl2×taqmix(購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司)，9.5μlddh2o。

反應程序為：預變性94℃5min；94℃30s，68.4℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；最后72℃下延伸5min。擴增產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

若得到260bp的片段，則該多主棒孢菌基因組中琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb核苷酸序列第1020位核苷酸為g，則該多主棒孢菌為或候選為氟吡菌酰胺抗性菌株；

若未得到260bp的片段，則該多主棒孢菌基因組中琥珀酸脫氫酶b亞基基因sdhb核苷酸序列第1020位核苷酸不為g，則該多主棒孢菌不為或候選不為氟吡菌酰胺抗性菌株。

結(jié)果如圖6所示，m：marker(bm5000，北京博邁德科技發(fā)展有限公司)；1,hg15050729-5；2,hg15050731；3,hg15050737；4,hg15050825-6；5,hg14102524-4；6,hg14102405-2；7,hg15041321-2；8,hg15041414-2；9,hg15050755-3；10,陰性對照“-”；引物對cc1020f-cc1020t.c.r從多主棒孢菌菌株hg15050729-5、hg15050731、hg15050737和hg15050825-6擴增出約260bp特異性片段，其為對氟吡菌酰胺表現(xiàn)抗性，這與前面的對氟吡菌酰胺敏感性檢測一致；

引物對cc1020f-cc1020t.c.r從多主棒孢菌菌株hg15050755-3、hg15041321-2、hg15041414-2、hg14102405-2和hg14102524-4中未擴增出約260bp特異性片段，其為對氟吡菌酰胺表現(xiàn)敏感，這與前面的對氟吡菌酰胺敏感性檢測一致。

表明該對引物可以用于特異性檢測多主棒孢菌是否對氟吡菌酰胺產(chǎn)生了抗性。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所

<120>一種快速鑒定多主棒孢菌對氟吡菌酰胺抗藥性的方法及專用引物對

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1106

<212>dna

<213>多主棒孢菌(corynesporacassiicola)

<400>1

atggcttgcacacgcgctttcgctcgtctggctacgacgcggaccggtacgtgaacccct60

ctacgtgcactacacacccattggagctctactgacagctctccccgcagccgtacggcc120

cgctgccgtcttcacgcgcggttttgcctccgtgaccgacacggccgcccgcgagcccgt180

ctccaaggtggccgagaagatcgtgcccgacccggcccgcaaggtggttcccgagagtca240

gaccagcactgtcaaggacccccagccggacaaggacgcgaagaccaagaccttccacat300

ctaccgctggaacccggacgagcccacgtcgaagccaaagatgcagacgtacacgctgga360

cctgaacaagaccggccccatgatgttggatgcgctgatccgcatcaagaacgagctcga420

cccgaccttgacctttaggcgaagttgccgtgagggaatttgtggaagctgcgcaatgaa480

cattgacggcgtgaacacgctggcctgtctttgtacgtggaaccgcagtctccacgaatg540

cggaattgggtggctaacgagtgcgcaacaggccgcatccccaccgataccaccaaggaa600

tcgcgcatttaccctctccctcacatgtacattgtcaaggacttggtccccgacatgacg660

ctcttctacaagcagtaccgctccgtgaagccctacctccagcgcgacactcctgctcct720

gacgtaagaacaccgcacacctcaccatagcctcgaactcgccactaacgattgctctct780

agggccgtgaataccgccagtccaaggaggagcgcaagaagctcgacggcctgtacgagt840

gcattctgtgcgcctgctgctcaacgtcctgcccgtcgtactggtggaaccaggaggagt900

acctcggccctgccgtgctgctccagtcgtaccgctggatcgccgattcgcgtgacgaga960

agacggcacaacgccaggatgccctcaacaactcgatgagcatgtaccgctgccacacgg1020

ttctcaactgctcgaggacgtgccccaagggcttgaacccggctctggccattgccgaaa1080

tcaagaagagcatggctttcacgtag1106

<210>2

<211>307

<212>prt

<213>多主棒孢菌(corynesporacassiicola)

<400>2

metalacysthrargalaphealaargleualathrthrargthrala

151015

valargproalaalavalphethrargglyphealaservalthrasp

202530

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354045

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100105110

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115120125

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130135140

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180185190

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195200205

glugluarglyslysleuaspglyleutyrglucysileleucysala

210215220

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225230235240

leuglyproalavalleuleuglnsertyrargtrpilealaaspser

245250255

argaspglulysthralaglnargglnaspalaleuasnasnsermet

260265270

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275280285

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290295300

alaphethr

305

<210>3

<211>1106

<212>dna

<213>多主棒孢菌(corynesporacassiicola)

<400>3