本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及抗原肽t790m-1及其在制備治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肺癌是全球癌癥死亡的主因。而非小細(xì)胞肺癌又占肺癌病例的80％。雖然現(xiàn)今治療手段有了很大發(fā)展，但對(duì)肺癌病人的預(yù)測(cè)仍顯不足。但最近人們對(duì)此疾病在治療方法上取得了重要的進(jìn)展。特別是表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(egfr-tkis)，如吉非替尼、埃羅替尼已經(jīng)被研發(fā)出來作為針對(duì)特定的非小細(xì)胞肺癌的新的治療方式，這些病人egfr基因的酪氨酸激酶區(qū)域發(fā)生了突變。采用egfr-tki藥物對(duì)egfr突變型非小細(xì)胞肺癌病人(如dele746-a750和l858r)實(shí)施的前期臨床研究，顯示出了較高的臨床反應(yīng)率，約80％。然而，隨時(shí)間的推移，大多數(shù)病人對(duì)egfr-tkis產(chǎn)生了獲得性的耐藥性。對(duì)非小細(xì)胞肺癌的深入研究鑒定出了次級(jí)突變t790m出現(xiàn)在50％的egfr-tkis耐藥病患中。然而對(duì)于有這種突變的非小細(xì)胞肺癌病患來說，目前還沒有有效的治療方式。近幾年，由于多種腫瘤相關(guān)抗原的鑒定，腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域取得了引人注目的進(jìn)展。尤其是多種腫瘤免疫療法的研發(fā)和臨床試驗(yàn)，包括利用腫瘤相關(guān)蛋白或肽段的腫瘤疫苗。盡管早期臨床實(shí)驗(yàn)中免疫療法顯示出了可行性以及低毒性，但是后期的隨機(jī)試驗(yàn)，除少數(shù)以外，相比于現(xiàn)有的治療方式，均未能顯示出有益的治療效果。這些意想不到的結(jié)果可能歸因于，至少部分是由于疫苗抗原的類型。目前，大部分的疫苗抗原分離自未發(fā)生突變的自體抗原，由于中樞免疫耐受和/或外周免疫耐受機(jī)制的存在，它們不表現(xiàn)出高的免疫原性。相比之下，腫瘤特異的新抗原，由于含有突變的氨基酸序列，具有免疫原性，因?yàn)樗鼈兛杀凰拗髅庖呦到y(tǒng)當(dāng)做外來物而識(shí)別。特別是，來自驅(qū)動(dòng)突變的疫苗抗原可能是免疫治療的一個(gè)理想靶點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兒苌贂?huì)從腫瘤細(xì)胞丟失。雖然有一些研究報(bào)告指出靶向突變抗原的免疫治療具有可行性，但至今為止只有一小部分突變抗原被確認(rèn)是免疫治療的潛在的靶點(diǎn)。非小細(xì)胞肺癌中，源自突變抗原的一些t細(xì)胞表位已經(jīng)被報(bào)道。但在我們的研究中，我們預(yù)測(cè)了來自egfrt790m耐藥突變體的hla-a*0201(a2)限制性抗原的t細(xì)胞表位，它們對(duì)人的t細(xì)胞有很強(qiáng)的免疫原性，預(yù)測(cè)出的t細(xì)胞表位可為預(yù)防和/或治療egfrt790m突變的非小細(xì)胞肺癌病人(egfr-tkis療法)提供一種新的、有希望的免疫治療方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：解決的技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是提供抗原肽t790m-1及其在制備治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用，該抗原肽具有激活t細(xì)胞靶向殺死非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的作用。技術(shù)方案：抗原肽t790m-1，其氨基酸序列如seqidno.1所示。進(jìn)一步地，所述抗原肽t790m-1的氨基酸序列具有如seqidno.1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基得到的氨基酸序列。一種用于治療非小細(xì)胞肺癌的藥物，該藥物含有上述抗原肽t790m-1。上述抗原肽t790m-1在制備預(yù)防和/或治療egfrt790m突變的非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用。上述抗原肽t790m-1在制備用于誘導(dǎo)對(duì)具有egfrt790m突變的非小細(xì)胞肺癌的免疫的藥物中的應(yīng)用。上述抗原肽t790m-1在制備用于誘導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性t細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用，所述腫瘤反應(yīng)性t細(xì)胞是可以靶向抑制具有egfrt790m突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的t細(xì)胞。有益效果：本發(fā)明的抗原肽t790m-1具有激活t細(xì)胞靶向殺死非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的作用，為預(yù)防和/或治療egfrt790m突變的非小細(xì)胞肺癌病人(egfr-tkis療法)提供一種新的、有希望的免疫治療方法。附圖說明圖1為實(shí)施例2中成熟dc誘導(dǎo)的ctl細(xì)胞對(duì)h1975-a2和h1975的細(xì)胞毒活性柱狀統(tǒng)計(jì)圖；圖2為實(shí)施例2中ctl殺傷實(shí)驗(yàn)的裸鼠體重柱狀統(tǒng)計(jì)圖；圖3為實(shí)施例2中ctl殺傷實(shí)驗(yàn)的裸鼠肺組織病理切片-h&e染色結(jié)果。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施方式對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1抗原肽t790m-1預(yù)測(cè)與合成近期的基序法分析顯示，syfpeithi超基序法是有效的hla-a2結(jié)合肽預(yù)測(cè)系統(tǒng)。因此用來預(yù)測(cè)來自egfr-t790m的9-mer的hla-a2結(jié)合肽。采用syfpeithi對(duì)egf-t790m的hla-a*02:01限制性ctl表位進(jìn)行遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)，得到分值較高(21分)的九肽(stvqlimql)。采用化學(xué)合成的方法制備上述抗原肽，即本領(lǐng)域熟知的已經(jīng)非常成熟的固相肽合成方法，既可以采用boc方法也可以采用fmoc方法。具體做法就是將被保護(hù)的氨基酸逐個(gè)偶聯(lián)到惰性固相載體上去，然后利用強(qiáng)酸將肽鏈從載體上裂解下來，同時(shí)去除側(cè)鏈保護(hù)。制備得到氨基酸序列為stvqlimql的肽。實(shí)施例21.外周血單核細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)無菌條件下取hla-a*02:01陽性正常健康供者空腹靜脈血20ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離單核細(xì)胞，配制細(xì)胞懸液，以終質(zhì)量濃度為2×109/l置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱孵育2h后，洗去非黏附細(xì)胞；收集黏附細(xì)胞(單核細(xì)胞)備用。2.成熟dc誘導(dǎo)及抗原負(fù)載上述單核細(xì)胞按終質(zhì)量濃度加入人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhgm—csf)1000mg/l、重組人白細(xì)胞介素-4(rhil-4)500mg/l，隔天加首次1/2濃度的細(xì)胞因子，培養(yǎng)至第5天加入(a組)抗原肽，(b組)只加培養(yǎng)基作為對(duì)照組，于37℃、5％co2條件下培養(yǎng)2天，更換培養(yǎng)液，加入腫瘤壞死因子(tnf)-α(10mg/l)，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞及上清備用。3.dc表面標(biāo)志檢測(cè)收集不同抗原誘導(dǎo)的dc細(xì)胞以1500r/min離心10min，提取細(xì)胞沉淀并以磷酸鹽緩沖液(pbs)洗3次，室溫下孵育30min，再使用pbs洗1次后加入fitc-鼠抗人cd80、cd83、cd86、cdla、人類白細(xì)胞抗原dr位點(diǎn)(hla-dr)，以同種型熒光染色的ig作為對(duì)照，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面分子的表達(dá)，見表一。表一抗原肽負(fù)載dc細(xì)胞表面分子標(biāo)志的分析％，n＝3，)組別cd1acd80cd83hla-drcd86a37.1±3.460.2±4.252.5±4.574.2±4.871.2±3.9b25.1±3.250.2±3.838.4±3.664.5±4.470.2±4.14.成熟dc誘導(dǎo)的ctl細(xì)胞外周血來自同一獻(xiàn)血者。將4ml自體抗凝血加入t淋巴細(xì)胞分離液的離心管，分層離心，吸取單核細(xì)胞。將2×108/l的單核細(xì)胞與負(fù)載抗原的dc共培養(yǎng)5d，再去除貼壁細(xì)胞備用。5.mtt顯色法測(cè)定ctl的殺傷活性(1)將成熟dc誘導(dǎo)的ctl細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞h1975(hla-a2-t790m+)、h1975-a2(h1975transfectedwithhla-a2，hla-a2+t790m+)作為靶細(xì)胞。調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞的效靶比為3:1、10:l。(2)使用96孔培養(yǎng)板(預(yù)先紫外照射20min)。實(shí)驗(yàn)組每孔加入效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)液各100μl混勻，共加三個(gè)復(fù)孔；同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞對(duì)照，均設(shè)三復(fù)孔，各取100μl，在所有對(duì)照孔中各加入rpmi-1640(含10％胎牛血清)培養(yǎng)液100μl，37℃，5％co2條件下共育24h。(3)24h后，吸棄上清液100μl，加入mtt儲(chǔ)液(5mg/ml，溶于0.02m，ph7.4，0.05％葡萄糖的pbs中)20μl，37℃，5％co2條件下，再共育2～4h。(4)仔細(xì)吸棄上清液后加入二甲基亞砜150μl，放置20min。(5)在酶標(biāo)測(cè)定od490nm值。殺傷細(xì)胞活性以殺傷細(xì)胞毒活性百分?jǐn)?shù)表示，按以下公式計(jì)算：結(jié)果如表二所示：表二成熟dc誘導(dǎo)的ctl細(xì)胞對(duì)h1975-a2和h1975的細(xì)胞毒活性(％，n＝3，)以上結(jié)果顯示成熟dc誘導(dǎo)的ctl細(xì)胞對(duì)h1975-a2的細(xì)胞毒活性高于h1975，表明本發(fā)明中成熟誘導(dǎo)的ctl細(xì)胞以一種hla-a2限制性的方式來識(shí)別帶有egfrt790m突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。由圖1細(xì)胞毒活性柱狀統(tǒng)計(jì)圖更能直觀的比較各組的差距。6.ctl殺傷實(shí)驗(yàn)：(1)非小細(xì)胞肺癌裸鼠模型的建立：常規(guī)培養(yǎng)鼠源非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(h1975-a2)，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期使用生理鹽水制成1×107/ml的細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞尾靜脈移植于5～8周的雌性balb/c裸鼠，間隔3天再移植一次，連續(xù)2-3周，1-2月后造?；境晒?。以眼眶取血的方式獲得裸鼠靜脈血，分離單核細(xì)胞，按照“外周血單核細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)”和“dc表面標(biāo)志檢測(cè)”的方法誘導(dǎo)ctls。(2)實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)分成5組(體重狀態(tài)均一)，每組5只：(a組)空白對(duì)照組：不做任何處理的對(duì)照組；(b組)模型對(duì)照組：移植鼠源非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(h1975-a2)，后期注射生理鹽水做陰性對(duì)照；(c組)ctl組，移植鼠源非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(h1975-a2)，后期注射負(fù)載抗原肽的dc誘導(dǎo)的ctls，每天會(huì)輸1×106個(gè)細(xì)胞，連續(xù)處理一周；(d組)純藥物組：移植鼠源非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(h1975-a2)，后期注射吉非替尼藥物，每天注射一次50mg/kg，連續(xù)處理一周；(e組)藥物+ctl組，移植鼠源非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(h1975-a2)，后期每次注射吉非替尼50mg/kg和負(fù)載抗原肽的dc誘導(dǎo)的ctls1×106，連續(xù)處理一周。(3)檢測(cè)指標(biāo)：藥物和ctl處理2周后，觀察裸鼠體重變化以及裸鼠肺部病理變化情況。如表三數(shù)據(jù)可知，以空白組做正常裸鼠對(duì)照組，模型對(duì)照組和吉非替尼治療組的裸鼠體重明顯減輕；而ctl治療組與ctl+吉非替尼治療組裸鼠體重相對(duì)下降較少。由圖2體重柱狀統(tǒng)計(jì)圖更能直觀的比較各組的差距。由圖3所示，模型對(duì)照組和吉非替尼治療組的裸鼠的病理結(jié)果可知，肺組織病變較為明顯，有明顯的病灶，并且在組織中侵潤(rùn)大量的腫瘤細(xì)胞；ctl治療組與ctl+吉非替尼治療組裸鼠病灶明顯較輕，并且組織中的腫瘤細(xì)胞數(shù)目明顯降低。表三模型裸兩周后體重比較sequencelisting<110>江蘇邁健生物科技發(fā)展股份有限公司<120>抗原肽t790m-1及其在制備治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用<130>20170629<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>9<212>prt<213>人工序列<400>1serthrvalglnleuilemetglnleu15當(dāng)前第1頁12