本發(fā)明涉及的是生物醫(yī)藥及生物工程下游蛋白純化領(lǐng)域，具體涉及一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(recombinanthumangranulocytecolonystimulatingfactor，rhg-csf)的純化方法，本發(fā)明操作簡單、時間短，適合于工業(yè)化放大生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
：人粒細(xì)胞集落刺激因子(humangranulocytecolonystimulatingfactor，hg-csf)能夠特異地作用于粒系祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖并分化為成熟的中性粒細(xì)胞，是調(diào)節(jié)骨髓中粒系造血細(xì)胞的主要細(xì)胞因子之一。其對于由癌癥化療、急性白血病化療、骨髓增生異常綜合征及再生障礙性貧血等疾病引起的中性粒細(xì)胞缺乏癥和骨髓移植時的中性粒細(xì)胞增加等均有明顯的療效。hg-csf的來源是非常有限的，因此，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)均采用基因工程的方法獲得。目前國內(nèi)外制藥企業(yè)大多采用應(yīng)用廣泛的大腸桿菌系統(tǒng)來表達(dá)rhg-csf。由于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境不利于二硫鍵的形成，rhg-csf折疊錯誤，容易聚集，基本以無生物活性的包涵體形式存在于細(xì)胞中。包涵體經(jīng)過變性和復(fù)性才能獲得有活性的rhg-csf。目前，專利中對rhg-csf的復(fù)性方法報道眾多，研究極為清楚。無論采用哪種復(fù)性方法，不可否認(rèn)，復(fù)性后樣品中仍含有大量的宿主細(xì)胞蛋白以及產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，因此，復(fù)性后的純化工藝是決定產(chǎn)品質(zhì)量合格與否的重要步驟，而一個成功的純化工藝要同時兼顧產(chǎn)品純度、收率、工藝周期、生產(chǎn)成本、可操作性等多方面因素。us5849883、cn1167150、cn1206716、cn1814779等均報道采用多步層析方法搭配，用于純化大腸桿菌重組表達(dá)的rhg-csf。如us5849883、cn1206716、cn1814779均同時利用弱陽離子(如，cmsepharose)和弱陰離子(如，deaesepharose)交換層析。在生產(chǎn)工藝中，層析步驟多會大大增加工藝驗(yàn)證、清洗驗(yàn)證的工作量，同時增加處理樣品的時間，同時，多步驟處理工藝還會影響蛋白的回收率。因此，開發(fā)一步層析方法用于純化rhg-csf具有很好的應(yīng)用前景。而rhg-csf一步層析純化方法所用填料多涉及強(qiáng)陽離子交換層析(如，sp填料)和弱陽離子交換層析(如，cm填料)。cn1718739a報道了采用spsepharosehighperformance(sphp)直接對rhg-csf復(fù)性液純化的方法，在ph5.4的條件下，利用nacl濃度洗脫目的蛋白。但是包涵體復(fù)性液中除了目的蛋白外，還含有一定量的宿主蛋白、脂類和脫氧核糖核酸(dna)。sphp填料的粒徑很小，為30μm，一般用于精制純化，不適合用于含有較多雜質(zhì)、情況復(fù)雜的復(fù)性液。而且粒徑小使得生產(chǎn)上層析柱的壓力很大，流速變慢，增加工藝操作時間。cn1663962a報道的對復(fù)性后的rhg-csf采用spsepharosefastflow(spff)純化的方法：在ph4.0(10mmol/l乙酸-乙酸鈉)的條件下上樣，ph7.0(100mmol/l磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉)洗脫目的蛋白。但是spff對樣品離子強(qiáng)度有要求，一般不超過5ms/cm。其中，樣品復(fù)性液中含有較高濃度的尿素，使用中空纖維進(jìn)行濃縮、稀釋、濃縮等一系列操作，以獲得符合spff上樣要求的樣品。因此，該方法操作繁瑣，增加工藝放大的難度。cn104120109a提供了一種弱陽離子交換層析cmsepharosefastflow(cmff)純化rhg-csf的方法，條件與cn1718739a相似，在ph5.4的條件下上樣，利用nacl濃度洗脫目的蛋白。但是該純化方法的上樣、平衡、洗脫流速均為10cm/h。如此低的流速勢必大大增加工藝的操作時間，可能還會影響蛋白樣品的穩(wěn)定性。針對上述問題，開發(fā)一種能適應(yīng)于rhg-csf復(fù)性液復(fù)雜成分、污染物多、復(fù)性液離子強(qiáng)度高等特點(diǎn)，并能夠使得工藝流速大、操作時間短的純化工藝尤為重要。以此為目的，本發(fā)明提供了以混合模式填料的陽離子層析柱層析純化復(fù)性后rhg-csf，該方法對樣品的適用性強(qiáng)、載量大、收率高，并且操作更簡單、高效。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化方法，包括：將重組人粒細(xì)胞集落刺激因子復(fù)性液上樣至以混合模式填料的陽離子層析柱進(jìn)行純化。其中，所述陽離子交換層析柱的填料為混合模式的陽離子層析填料，選自但不限于captommc填料、hcx填料、bestarosediamondmmc填料和unimsp-30s填料中至少一種，優(yōu)選captommc填料和hcx填料。進(jìn)一步而言，該重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化方法先采用緩沖液進(jìn)行雜質(zhì)洗脫，再進(jìn)行洗脫收集樣品峰。所述雜質(zhì)洗脫所用緩沖液中緩沖劑選自乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、tris、甘氨酸、組氨酸中的一種或多種，所述樣品洗脫所用緩沖液中緩沖劑選自乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、tris、甘氨酸、組氨酸中的一種或多種。所述的雜質(zhì)洗脫緩沖液離子強(qiáng)度為5～20mmol/l，ph為7.2～7.8，在具體實(shí)施例中雜質(zhì)洗脫緩沖液離子強(qiáng)度可為7、9、11、13、15、17、19mmol/l，ph可選為7.2、7.4、7.6、7.8。所述的洗脫緩沖液離子強(qiáng)度為20～100mmol/l，ph為8.0～9.0其中。在具體實(shí)施例中洗脫緩沖液離子強(qiáng)度可為40、55、65、80、90mmol/l，ph可選為8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述方法還包括混合模式填料的陽離子層析柱在上樣前經(jīng)緩沖液平衡步驟，所述平衡緩沖液離子強(qiáng)度為5～50mmol/l，ph為3.0～6.5，具體實(shí)施例中ph可選為4.0、4.5、5.0、6.0。通常樣品洗脫存在多種方式，本發(fā)明所述樣品洗脫主要采用ph洗脫或鹽離子濃度洗脫方式，為了保證樣品洗脫的效果，優(yōu)選ph洗脫方式，其中所述ph洗脫方式為利用洗脫液的不同ph值對含蛋白質(zhì)原液進(jìn)行常規(guī)洗脫程序。進(jìn)一步而言，本發(fā)明所述雜質(zhì)洗脫緩沖液ph與所述洗脫緩沖液ph數(shù)值不相同。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述方法還包括將收集得到的純化樣品進(jìn)行緩沖液置換的步驟，所述緩沖液置換可采用透析、超濾、脫鹽柱層析方式中的一種或多種，所述超濾優(yōu)選自中空纖維超濾或膜包超濾，更優(yōu)選自膜包超濾。其中所述置換緩沖液為乙酸鈉緩沖液，呈酸性。若置換后的g-csf原液用于制劑生產(chǎn)，ph為2.0～5.0，優(yōu)選ph＝3.5～4.5，具體ph可選3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4。若g-csf原液用于后續(xù)的修飾反應(yīng)，制備長效g-csf，ph為3.0～8.0，優(yōu)選ph＝4.0～7.0，在具體實(shí)施例中ph＝4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。其中若采用膜包超濾進(jìn)行緩沖液置換，超濾條件為：①利用超濾系統(tǒng)對復(fù)合型陽離子填料純化后樣品進(jìn)行適當(dāng)濃縮；②在超濾系統(tǒng)內(nèi)保持樣品體積恒定，采用置換液進(jìn)行置換，使流加的置換液速度與透出液速度相同；③跨膜壓力(tmp)不大于50psi，更優(yōu)選為10-30psi；④共超濾置換樣品體積的3倍以上，考慮到合理的工藝用時，更優(yōu)選為5倍體積。所述膜包超濾膜孔徑為1kd～20kd，優(yōu)選3kd、5kd或10kd，更優(yōu)選為5kd。所述膜包超濾中膜包材料選自聚偏氟乙烯、改良纖維素、聚醚砜或改良聚醚砜中一種或多種。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述方法還包含在上樣前對復(fù)性液進(jìn)行ph調(diào)節(jié)、過濾步驟。所述蛋白復(fù)性液進(jìn)行ph調(diào)節(jié)后值為2.0～6.0，優(yōu)選自3.5～4.5，譬如ph＝3.6、3.8、4.0、4.2、4.4，所用ph調(diào)節(jié)劑包括但不限于乙酸、檸檬酸、磷酸中的一種或多種。所述過濾可采用中空纖維過濾、膜包過濾或死端過濾方式中的一種或多種，優(yōu)選死端過濾。其中中空纖維超濾使用的中空纖維管內(nèi)徑包括但不限于0.5mm，0.75mm，1mm和1.75mm，更優(yōu)選為1mm；如若采用gehealthcare公司的中空纖維柱進(jìn)行超濾緩沖液置換，剪切速率應(yīng)控制在16000sec-1以下，更優(yōu)選為約8000sec-1。若采用所述死端過濾去除沉淀物，濾膜孔徑為0.22μm，所述死端過濾中濾膜材料為聚偏氟乙烯或是聚四氟乙烯。具體而言，本發(fā)明提供了一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化方法，包括：a)上樣前對重組人粒細(xì)胞集落刺激因子復(fù)性液進(jìn)行ph調(diào)節(jié)，過濾；b)混合模式填料的陽離子層析柱在上樣前經(jīng)緩沖液平衡；c)上樣至混合模式填料的陽離子層析柱進(jìn)行層析純化，先采用緩沖液進(jìn)行雜質(zhì)洗脫，再進(jìn)行洗脫收集樣品峰。d)將收集得到的純化樣品進(jìn)行緩沖液置換；其中，b)和c)中所述緩沖液中緩沖劑選自乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、tris、甘氨酸、組氨酸中的一種或多種，所述平衡緩沖液離子強(qiáng)度為5-50mmol/l，ph3.0～6.5，所述雜質(zhì)洗脫緩沖液離子強(qiáng)度為5～20mmol/l，ph為7.0～8.0，所述洗脫緩沖液離子強(qiáng)度為20～100mmol/l，ph為8.0～9.0。所述陽離子交換層析柱的填料為混合模式的陽離子層析填料，選自但不限于captommc填料、hcx填料、bestarosediamondmmc填料和unimsp-30s填料中至少一種，優(yōu)選captommc填料和hcx填料。其中所述a)步驟過濾可采用中空纖維過濾、膜包過濾或死端過濾方式中的一種或多種，優(yōu)選死端過濾，所述死端過濾中濾膜材料為聚偏氟乙烯或是聚四氟乙烯，其中孔徑為0.22μm。其中所述a)步驟所用ph調(diào)節(jié)劑包括但不限于乙酸、鹽酸和磷酸、乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽中一種或多種。其中所述置換緩沖液為乙酸鈉緩沖液，呈酸性。若置換后的g-csf原液用于制劑生產(chǎn)，ph為2.0～5.0，優(yōu)選ph＝3.5～4.5，具體ph可選3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4。若g-csf原液用于后續(xù)的修飾反應(yīng)，制備長效g-csf，ph為3.0～8.0，優(yōu)選ph＝4.0～7.0，在具體實(shí)施例中ph＝4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。本發(fā)明還提供一種制備聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的方法，包括依據(jù)上述所述重組人粒細(xì)胞集落刺激因子純化方法，以及將所獲得重組人粒細(xì)胞集落刺激因子進(jìn)行聚乙二醇修飾步驟，其所述聚乙二醇化重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的結(jié)構(gòu)如式ⅰ所示其中m選自50-2500的整數(shù)，優(yōu)選自400-500的整數(shù)，g為met-g-csf。本發(fā)明的有益效果是：(1)復(fù)性液調(diào)節(jié)ph至酸性，使得大量大腸桿菌細(xì)胞蛋白沉淀，該步驟簡單有效，容易實(shí)現(xiàn)雜蛋白與目的蛋白的分離，為后續(xù)的層析純化工藝減輕壓力。(2)復(fù)合配基的陽離子交換填料高載量、高流速處理大體積樣品、對復(fù)性液的復(fù)雜緩沖體系適用性強(qiáng)，大大縮短工藝時間，并且工藝放大的可行性好，成功放大至生產(chǎn)規(guī)模。(3)本發(fā)明涉及的純化方法，僅包含一步層析，工藝步驟少，純化周期短，易于控制，提高了工藝操作的穩(wěn)定性。(4)本工藝可獲得高純度、高活性的rhg-csf蛋白原液。經(jīng)檢測，其sds-page純度達(dá)到99％以上，rp-hplc純度達(dá)到98％以上，比活性不低于8.0×107iu/mg。這些均高于《中華人民共和國藥典2015版》第三部“重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液”項(xiàng)下原液檢定的要求。術(shù)語解釋：附圖說明圖1：rhg-csf原液的sds-page純度檢測圖譜，其中泳道m(xù)：分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白mark12，泳道1：rhg-csf原液。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步闡述，應(yīng)當(dāng)理解，所描述的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1制備rhg-csf復(fù)性液工藝所用菌株為pbv220/g-csf質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌dh5α菌株。發(fā)酵后，收集菌體，利用高壓勻質(zhì)機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，獲得粗包涵體，再對粗包涵體進(jìn)行洗滌，獲得初步純化的包涵體。取初步純化的包涵體30g，按照固液比1:20(m/v)的比例用變性液(20mmol/ltris-hcl,5mmol/ledta,8mol/lurea,10mmol/ldtt,ph8.2)進(jìn)行變性溶解，室溫攪拌15～18小時，獲得變性蛋白液600ml。之后，將該蛋白液進(jìn)行10μm和0.45μm兩級過濾澄清，再利用5kd中空纖維柱進(jìn)行緩沖液置換，以去除還原劑dtt，置換過程控制跨膜壓(tmp)為10-18psi，置換緩沖液為20mmol/ltris-hcl,5mmol/ledta,8mol/lurea,ph8.2。獲得置換后的變性蛋白液600ml。將置換后變性蛋白液緩慢加入約15l復(fù)性緩沖液(20mmol/ltris-hcl,ph8.2)中，使得蛋白終濃度為0.3g/l，同時加入gssg至終濃度為0.5mmol/l，攪拌30min混勻后，2～25℃靜置復(fù)性16～18小時。實(shí)施例2rhg-csf的captommc純化將復(fù)性后的rhg-csf溶液用0.5mol/l鹽酸調(diào)節(jié)ph至4.0，靜置10分鐘。使用孔徑為0.22μm的濾芯進(jìn)行過濾。平衡：以平衡緩沖液(20mmol/l檸檬酸/磷酸氫二鈉，ph4.0)平衡層析柱，流速300cm/小時，直到ph穩(wěn)定在4.0；上樣：將過濾后復(fù)性液樣品上樣，流速300cm/小時；再平衡：上樣結(jié)束后，用平衡緩沖液(20mmol/l檸檬酸/磷酸氫二鈉，ph4.0)再次平衡層析柱，流速300cm/小時；洗雜：以10mmol/l檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖液(ph7.5)洗脫雜質(zhì)，流速180cm/小時；洗脫：以50mmol/l檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖液(ph8.0)洗脫目的蛋白，流速300cm/小時，收集目標(biāo)蛋白峰。實(shí)施例3層析填料的篩選制備rhg-csf復(fù)性液的過程如實(shí)施例1。為獲得適合rhg-csf復(fù)性液純化的層析填料，本研究比較了三種帶有弱陽離子配基的填料純化復(fù)性液的能力，純化過程參照實(shí)施例2，結(jié)果如表1所示。cmff獲得的樣品hplc純度低于混合模式的captommc和hcx，且流速慢，收率低。相比而言，captommc和hcx更能滿足rhg-csf的藥典標(biāo)準(zhǔn)，并適合大規(guī)模工業(yè)化放大。表1：三種填料對rhg-csf復(fù)性液的純化效果比較實(shí)施例4captommc雜質(zhì)和樣品洗脫緩沖液ph的篩選本實(shí)施例研究了captommc純化rhg-csf復(fù)性液雜質(zhì)洗脫和樣品洗脫緩沖液ph的可選取范圍。制備rhg-csf復(fù)性液的過程如實(shí)施例1。本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果如表2所示。雜質(zhì)洗脫緩沖液可選取的ph為7.2-7.8。雜質(zhì)洗脫ph在7.0和8.0時，出現(xiàn)未能洗脫雜質(zhì)或目的蛋白在此步洗脫的問題，影響最終洗脫樣品的純度或收率。同樣，樣品洗脫緩沖液可選取的ph為8.0-9.0。ph低于8.0時(實(shí)驗(yàn)例3)，樣品未能洗脫。表2：雜質(zhì)和樣品洗脫緩沖液ph對rhg-csf復(fù)性液純化的影響實(shí)施例5rhg-csf緩沖液的超濾置換選用5kd膜包進(jìn)行緩沖液置換。平衡：以平衡緩沖液(20mmol/l醋酸鈉，ph4.0)平衡膜包；恒體積置換：captommc柱層析洗脫收集液加入膜包系統(tǒng)。向膜包中連續(xù)流加置換緩沖液(20mmol/l醋酸鈉，ph4.0)，控制流加速度與透出端流速相同，保持樣品體積恒定，期間控制跨膜壓為18-22psi，整個過程共連續(xù)補(bǔ)加5倍置換緩沖液(20mmol/l醋酸鈉，ph4.0)。實(shí)施例6樣品檢測：rhg-csf原液用sds-page、rp-hplc方法進(jìn)行純度分析。1)sds-page聚丙烯酰胺凝膠：4-12％bis-trisgel,lifetechnologies；樣品緩沖液：ldssamplebuffer(4×),lifetechnologi；電泳緩沖液：mopssdsrunningbuffer(20×),lifetechnologies；染色液：gelcodetmbluesafeproteinstain,thermoscientific；脫色液：純化水，自制。重組人粒細(xì)胞刺激因子原液上樣后，150v恒壓電泳使溴酚藍(lán)遷移至膠底處。采用考馬斯亮藍(lán)快速染色法進(jìn)行染色，純化水脫色，凝膠成像儀進(jìn)行純度分析，檢測結(jié)果如說明書附圖1所示。從分析結(jié)果可知，最終獲得的rhg-csf原液的sds-page純度為99.2％。2)rp-hplc色譜柱：shiseidocapcellpakc18sg3005μm150mm×4.6mm；a相：三氟乙酸－水溶液(取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻)；b相：三氟乙酸－乙腈溶液(取1.0ml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻)；表3：室溫條件下，按下表進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長280nm時間(min)a(％)b(％)01000153070253070261000采用rp-hplc法進(jìn)行rhg-csf原液純度檢測，分析檢測結(jié)果，最終獲得的rhg-csf原液的純度為99.21％。3)sec-hplc色譜柱：親水硅膠分子篩柱(tsk-gelg3000swxl7.8×300mm，5μm,250a)；流動相：50mm碳酸氫銨，ph＝7.0；波長：215nm；柱溫：25℃；流速：0.5ml/min；采用sec-hplc法進(jìn)行rhg-csf原液純度檢測，分析檢測結(jié)果，rhg-csf原液的純度為99.32％。4)活性測定以重組人粒細(xì)胞集落刺激因子活性測定國家標(biāo)準(zhǔn)品為活性標(biāo)準(zhǔn)品。取標(biāo)準(zhǔn)品和本發(fā)明獲得的rhg-csf原液，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至1.0ng/ml，再進(jìn)行2倍梯度稀釋。取培養(yǎng)的nfs-60細(xì)胞株，用rpm1640培養(yǎng)液洗滌3遍，在第三遍離心前取細(xì)胞懸液用于細(xì)胞計數(shù)。計數(shù)后，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸，配制成2.0×105細(xì)胞/ml。在每孔50μl標(biāo)準(zhǔn)品/rhg-csf原液中加入50μl細(xì)胞懸液，37℃，5％co2條件下培養(yǎng)40-48小時。然后，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，37℃，5％co2條件下培養(yǎng)約5小時，每孔再加入100μl裂解液，混勻后利用酶標(biāo)儀比色，測定波長/參比波長為570nm/630nm。計算獲得rhg-csf原液的比活性。采用nfs-60細(xì)胞/mtt比色法測定rhg-csf原液的生物學(xué)活性，計算獲得比活性為9.0×107iu/mg。當(dāng)前第1頁12