本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術領域：
，具體涉及抗原肽t790m-4及其在制備治療非小細胞肺癌的藥物中的應用。
背景技術：
：肺癌是全球癌癥死亡的主因。而非小細胞肺癌又占肺癌病例的80％。雖然現(xiàn)今治療手段有了很大發(fā)展，但對肺癌病人的預測仍顯不足。但最近人們對此疾病在治療方法上取得了重要的進展。特別是表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(egfr-tkis)，如吉非替尼、埃羅替尼已經(jīng)被研發(fā)出來作為針對特定的非小細胞肺癌的新的治療方式，這些病人egfr基因的酪氨酸激酶區(qū)域發(fā)生了突變。采用egfr-tki藥物對egfr突變型非小細胞肺癌病人(如dele746-a750和l858r)實施的前期臨床研究，顯示出了較高的臨床反應率，約80％。然而，隨時間的推移，大多數(shù)病人對egfr-tkis產生了獲得性的耐藥性。對非小細胞肺癌的深入研究鑒定出了次級突變t790m出現(xiàn)在50％的egfr-tkis耐藥病患中。然而對于有這種突變的非小細胞肺癌病患來說，目前還沒有有效的治療方式。近幾年，由于多種腫瘤相關抗原的鑒定，腫瘤免疫學領域取得了引人注目的進展。尤其是多種腫瘤免疫療法的研發(fā)和臨床試驗，包括利用腫瘤相關蛋白或肽段的腫瘤疫苗。盡管早期臨床實驗中免疫療法顯示出了可行性以及低毒性，但是后期的隨機試驗，除少數(shù)以外，相比于現(xiàn)有的治療方式，均未能顯示出有益的治療效果。這些意想不到的結果可能歸因于，至少部分是由于疫苗抗原的類型。目前，大部分的疫苗抗原分離自未發(fā)生突變的自體抗原，由于中樞免疫耐受和/或外周免疫耐受機制的存在，它們不表現(xiàn)出高的免疫原性。相比之下，腫瘤特異的新抗原，由于含有突變的氨基酸序列，具有免疫原性，因為它們可被宿主免疫系統(tǒng)當做外來物而識別。特別是，來自驅動突變的疫苗抗原可能是免疫治療的一個理想靶點，因為它們很少會從腫瘤細胞丟失。雖然有一些研究報告指出靶向突變抗原的免疫治療具有可行性，但至今為止只有一小部分突變抗原被確認是免疫治療的潛在的靶點。非小細胞肺癌中，源自突變抗原的一些t細胞表位已經(jīng)被報道。但在我們的研究中，我們預測了來自egfrt790m耐藥突變體的hla-a*0201(a2)限制性抗原的t細胞表位，它們對人的t細胞有很強的免疫原性，預測出的t細胞表位可為預防和/或治療egfrt790m突變的非小細胞肺癌病人(egfr-tkis療法)提供一種新的、有希望的免疫治療方法。技術實現(xiàn)要素：解決的技術問題：本發(fā)明的目的是提供抗原肽t790m-4及其在制備治療非小細胞肺癌的藥物中的應用，該抗原肽具有激活t細胞靶向殺死非小細胞肺癌細胞的作用。技術方案：抗原肽t790m-4，其氨基酸序列如seqidno.1所示。進一步地，所述抗原肽t790m-4的氨基酸序列具有如seqidno.1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基得到的氨基酸序列。一種用于治療非小細胞肺癌的藥物，該藥物含有上述抗原肽t790m-4。上述抗原肽t790m-4在制備預防和/或治療egfrt790m突變的非小細胞肺癌的藥物中的應用。上述抗原肽t790m-4在制備用于誘導對具有egfrt790m突變的非小細胞肺癌的免疫的藥物中的應用。上述抗原肽t790m-4在制備用于誘導腫瘤反應性t細胞的藥物中的應用，所述腫瘤反應性t細胞是可以靶向抑制具有egfrt790m突變的非小細胞肺癌細胞生長的t細胞。有益效果：本發(fā)明的抗原肽t790m-4具有激活t細胞靶向殺死非小細胞肺癌細胞的作用，為預防和/或治療egfrt790m突變的非小細胞肺癌病人(egfr-tkis療法)提供一種新的、有希望的免疫治療方法。附圖說明圖1為實施例2中成熟dc誘導的ctl細胞對h1975-a2和h1975的細胞毒活性柱狀統(tǒng)計圖；圖2為實施例2中ctl殺傷實驗的裸鼠體重柱狀統(tǒng)計圖；圖3為實施例2中ctl殺傷實驗的裸鼠肺組織病理切片-h&e染色結果。具體實施方式下面通過具體實施方式對發(fā)明作進一步詳細說明。但本領域技術人員將會理解下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例1抗原肽t790m-4預測與合成近期的基序法分析顯示，syfpeithi超基序法是有效的hla-a2結合肽預測系統(tǒng)。因此用來預測來自egfr-t790m的9-mer的hla-a2結合肽。采用syfpeithi對egf-t790m的hla-a*02:01限制性ctl表位進行遠程預測，得到分值較高(14分)的十肽(cltstvqlim)。采用化學合成的方法制備上述抗原肽，即本領域熟知的已經(jīng)非常成熟的固相肽合成方法，既可以采用boc方法也可以采用fmoc方法。具體做法就是將被保護的氨基酸逐個偶聯(lián)到惰性固相載體上去，然后利用強酸將肽鏈從載體上裂解下來，同時去除側鏈保護。制備得到氨基酸序列為cltstvqlim的肽。實施例21.外周血單核細胞分離實驗無菌條件下取hla-a*02:01陽性正常健康供者空腹靜脈血20ml，用淋巴細胞分離液分離單核細胞，配制細胞懸液，以終質量濃度為2×109/l置于培養(yǎng)瓶內，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱孵育2h后，洗去非黏附細胞；收集黏附細胞(單核細胞)備用。2.成熟dc誘導及抗原負載上述單核細胞按終質量濃度加入人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rhgm—csf)1000mg/l、重組人白細胞介素-4(rhil-4)500mg/l，隔天加首次1/2濃度的細胞因子，培養(yǎng)至第5天加入(a組)抗原肽，(b組)只加培養(yǎng)基作為對照組，于37℃、5％co2條件下培養(yǎng)2天，更換培養(yǎng)液，加入腫瘤壞死因子(tnf)-α(10mg/l)，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細胞及上清備用。3.dc表面標志檢測收集不同抗原誘導的dc細胞以1500r/min離心10min，提取細胞沉淀并以磷酸鹽緩沖液(pbs)洗3次，室溫下孵育30min，再使用pbs洗1次后加入fitc-鼠抗人cd80、cd83、cd86、cdla、人類白細胞抗原dr位點(hla-dr)，以同種型熒光染色的ig作為對照，使用流式細胞儀分析細胞表面分子的表達，見表一。表一抗原肽負載dc細胞表面分子標志的分析％，n＝3，)組別cd1acd80cd83hla-drcd86a37.2±1.160.4±3.353.2±2.472.5±2.270.4±2.9b26.1±1.850.5±3.341.0±1.563.5±4.270.0±1.54.成熟dc誘導的ctl細胞外周血來自同一獻血者。將4ml自體抗凝血加入t淋巴細胞分離液的離心管，分層離心，吸取單核細胞。將2×108/l的單核細胞與負載抗原的dc共培養(yǎng)5d，再去除貼壁細胞備用。5.mtt顯色法測定ctl的殺傷活性(1)將成熟dc誘導的ctl細胞作為效應細胞，人非小細胞肺癌細胞h1975(hla-a2-t790m+)、h1975-a2(h1975transfectedwithhla-a2，hla-a2+t790m+)作為靶細胞。調整效應細胞，靶細胞的效靶比為3:1、10:l。(2)使用96孔培養(yǎng)板(預先紫外照射20min)。實驗組每孔加入效應細胞及靶細液各100μl混勻，共加三個復孔；同時設效應細胞及靶細胞對照，均設三復孔，各取100μl，在所有對照孔中各加入rpmi-1640(含10％胎牛血清)培養(yǎng)液100μl，37℃，5％co2條件下共育24h。(3)24h后，吸棄上清液100μl，加入mtt儲液(5mg/ml，溶于0.02m，ph7.4，0.05％葡萄糖的pbs中)20μl，37℃，5％co2條件下，再共育2～4h。(4)仔細吸棄上清液后加入二甲基亞砜150μl，放置20min。(5)在酶標測定od490nm值。殺傷細胞活性以殺傷細胞毒活性百分數(shù)表示，按以下公式計算：結果如表二所示：表二成熟dc誘導的ctl細胞對h1975-a2和h1975的細胞毒活性(％，n＝3，)以上結果顯示成熟dc誘導的ctl細胞對h1975-a2的細胞毒活性高于h1975，表明本發(fā)明中成熟誘導的ctl細胞以一種hla-a2限制性的方式來識別帶有egfrt790m突變的非小細胞肺癌細胞。由圖1細胞毒活性柱狀統(tǒng)計圖更能直觀的比較各組的差距。6.ctl殺傷實驗：(1)非小細胞肺癌裸鼠模型的建立：常規(guī)培養(yǎng)鼠源非小細胞肺癌細胞(h1975-a2)，于對數(shù)生長期使用生理鹽水制成1×107/ml的細胞懸液，并將細胞尾靜脈移植于5～8周的雌性balb/c裸鼠，間隔3天再移植一次，連續(xù)2-3周，1-2月后造?；境晒?。以眼眶取血的方式獲得裸鼠靜脈血，分離單核細胞，按照“外周血單核細胞分離實驗”和“dc表面標志檢測”的方法誘導ctls。(2)實驗分組：隨機分成5組(體重狀態(tài)均一)，每組5只：(a組)空白對照組：不做任何處理的對照組；(b組)模型對照組：移植鼠源非小細胞肺癌細胞(h1975-a2)，后期注射生理鹽水做陰性對照；(c組)ctl組，移植鼠源非小細胞肺癌細胞(h1975-a2)，后期注射負載抗原肽的dc誘導的ctls，每天會輸1×106個細胞，連續(xù)處理一周；(d組)純藥物組：移植鼠源非小細胞肺癌細胞(h1975-a2)，后期注射吉非替尼藥物，每天注射一次50mg/kg，連續(xù)處理一周；(e組)藥物+ctl組，移植鼠源非小細胞肺癌細胞(h1975-a2)，后期每次注射吉非替尼50mg/kg和負載抗原肽的dc誘導的ctls1×106，連續(xù)處理一周。(3)檢測指標：藥物和ctl處理2周后，觀察裸鼠體重變化以及裸鼠肺部病理變化情況。如表三數(shù)據(jù)可知，以空白組做正常裸鼠對照組，模型對照組和吉非替尼治療組的裸鼠體重明顯減輕；而ctl治療組與ctl+吉非替尼治療組裸鼠體重相對下降較少。由圖2體重柱狀統(tǒng)計圖更能直觀的比較各組的差距。由圖3所示，模型對照組和吉非替尼治療組的裸鼠的病理結果可知，肺組織病變較為明顯，有明顯的病灶，并且在組織中侵潤大量的腫瘤細胞；ctl治療組與ctl+吉非替尼治療組裸鼠病灶明顯較輕，并且組織中的腫瘤細胞數(shù)目明顯降低。表三模型裸兩周后體重比較sequencelisting<110>江蘇邁健生物科技發(fā)展股份有限公司<120>抗原肽t790m-4及其在制備治療非小細胞肺癌的藥物中的應用<130>20170629<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>10<212>prt<213>人工序列<400>1cysleuthrserthrvalglnleuilemet1510當前第1頁12