本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及核酸純化，具體涉及一種采用磁性微球分離外周血中游離核酸的試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

早在1948年，mandel等就發(fā)現(xiàn)了外周血中有游離核酸，研究發(fā)現(xiàn)，游離核酸不僅可以應(yīng)用于胎兒性別、rhd血型、y染色體連鎖的遺傳疾病的診斷與預(yù)防，還可以應(yīng)用于檢測(cè)腫瘤、癌癥的發(fā)生以及骨髓移植后嵌合狀態(tài)的研究。1989年，stroun等研究表明，游離核酸中部分基因具有腫瘤組織基因的類似特征；幾年后，vasioukhin等于血漿游離核酸中發(fā)現(xiàn)了突變的n-ras，進(jìn)一步為兩者相關(guān)性提供了依據(jù)，至此，游離核酸開(kāi)始被用作一種預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生的新型生物標(biāo)記。近幾年，除腫瘤外的其他疾病也出現(xiàn)了游離核酸的報(bào)道，如急性(心腦血管疾病)或惡性疾病(系統(tǒng)性免疫疾病)、需機(jī)械通氣危重癥、中風(fēng)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、心肌梗塞、急性登革熱病等。lo等認(rèn)為在免疫學(xué)上，胚胎對(duì)于母體類似于腫瘤對(duì)于機(jī)體，可能在母體血漿中存在游離的胎兒dna，1997年，他們通過(guò)實(shí)時(shí)pcr從一孕男胎婦女血液游離dna擴(kuò)增出胎兒y染色體特異序列，首次證明孕婦外周血中存在胎兒游離dna，為非創(chuàng)傷產(chǎn)前診斷開(kāi)辟了一條新途徑。隨后在1998年，他們發(fā)現(xiàn)胎兒游離核酸在妊娠早期便存在于孕婦血液中，且濃度隨孕周的延長(zhǎng)而增加。同年，他們建立方法以檢測(cè)孕中期rhd陰性孕婦外周血中是否存在rhd基因，從而揭開(kāi)了利用母體血漿中游離胎兒dna進(jìn)行產(chǎn)前診斷研究的序幕。隨著研究的廣泛和深入，游離核酸還可用于三體綜合征、地中海貧血癥、連鎖遺傳性疾病和早產(chǎn)的產(chǎn)前診斷。

然而，外周血中游離核酸數(shù)量較少，另一方面，提取體系的復(fù)雜性使得提取純度和效率上困難度較大，應(yīng)用常用的苯酚-氯仿抽提法、硅膜離心柱吸附法及磁珠吸附法提取分離核酸時(shí)，顯現(xiàn)出諸多不足，苯酚-氯仿抽提法的主要原理是基于dna在不同溶劑中溶解度不同從而分離純化dna，其優(yōu)點(diǎn)在于提取dna產(chǎn)率較高，成本低，但缺點(diǎn)主要是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，提取dna純度低，且大量使用有毒溶劑，對(duì)環(huán)境及操作者危害大，還難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)操作。目前市面商品化核酸提取試劑盒大多是采用裂解法結(jié)合硅膜離心吸附柱，該方法簡(jiǎn)單快速，能有效的去除樣本中的各種pcr抑制物，獲得較純的dna，但是游離核酸提取效率低，且成本較高，同時(shí)需要高速離心，不適合臨床常規(guī)使用和高通量操作。

近幾年磁珠法提取收到熱衷，主要原理是在磁性微球(或者說(shuō)磁珠，主要為鐵氧體)表面以共價(jià)鍵的形式偶聯(lián)-cooh，-nh2，-oh，-coh，-sh，-so3等活性基團(tuán)，制備成具有磁性的親和吸附劑，然后與生物樣品共同孵育后，目標(biāo)分子能夠迅速被磁珠捕獲，在磁場(chǎng)作用下從液相中沉降，經(jīng)洗滌可分離得到表面結(jié)合有目標(biāo)分子的磁性微球復(fù)合物，改變洗滌條件可以將目標(biāo)分子從磁性微球上洗脫下來(lái)，該方法操作簡(jiǎn)便、快速，獲得的核酸純度高，尤其適合游離核酸的提取。但目前的磁珠法從樣本中分離游離核酸的提取試劑盒操作復(fù)雜，需要先在56℃條件下用蛋白酶k和裂解緩沖液裂解樣本，然后冷卻至室溫，再加入無(wú)水乙醇混勻，室溫放置5分鐘后再加入磁珠懸浮液進(jìn)行混勻，經(jīng)過(guò)三次漂洗步驟后置于室溫晾干10-15分鐘。裂解及漂洗步驟的繁瑣性導(dǎo)致其自動(dòng)化操作程度低，儀器普適性差，同時(shí)也無(wú)法保證核酸提取的重復(fù)性。針對(duì)于血漿樣品中游離核酸提取同樣出現(xiàn)提取效率低，導(dǎo)致提取時(shí)需要更多的起始樣本量或者額外添加carrierrna或糖原才能滿足后續(xù)檢測(cè)的要求，這造成了成本的增加和臨床應(yīng)用的難度的增加。因此迫切需要開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單快速、穩(wěn)定高效、價(jià)格便宜及普適性好的磁珠法游離核酸提取的方法及試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種采用磁性微球分離外周血中游離核酸的試劑盒及方法，用以解決現(xiàn)有技術(shù)中游離核酸提取效率低、步驟復(fù)雜、重復(fù)性差、成本較高，且臨床使用難度大、自動(dòng)化及高通量操作程度低的問(wèn)題，通過(guò)開(kāi)發(fā)非特異捕獲探針、借助oligo(dt)25與poly-a的特異性結(jié)合，并優(yōu)化裂解緩沖液、結(jié)合緩沖液及漂洗緩沖液等組成，實(shí)現(xiàn)了快速、高效、充分提取外周血中的游離核酸，且成本低、重復(fù)性好，適合臨床常規(guī)使用，易于自動(dòng)化及高通量操作。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種采用磁性微球分離外周血中游離核酸的試劑盒，包括裂解緩沖液、蛋白酶k、漂洗緩沖液和洗脫緩沖液，關(guān)鍵在于，還包括偶聯(lián)oligo(dt)25的磁性微球和含有poly-a的非特異捕獲探針，非特異捕獲探針的序列為l(k)2-d(k)5-l(k)2-d(k)5-l(k)2-dt5da15。

優(yōu)選的，所述裂解緩沖液為組成中包括濃度為0.4-0.8m的氯化芐、8-15mm的乙二胺四乙酸二鈉、3-8mm的二硫蘇糖醇、0.1-0.5mm的氫氧化鈉和0.1-2wt.％的十二烷基硫酸鋰的水溶液。

優(yōu)選的，所述結(jié)合緩沖液為組成中包括濃度為3-6m的氯化芐、0.5-1m的鹽酸胍、0.5-1.5m的乙酸和體積比5-13％的乙酸鉀的水溶液。

優(yōu)選的，所述漂洗緩沖液為組成中包括濃度為5-15mm的三羥甲基氨基甲烷、0.1-0.3m的氯化芐和0.1-2的乙二胺四乙酸二鈉的水溶液。

優(yōu)選的，所述洗脫緩沖液為濃度5-15mm的三羥甲基氨基甲烷的水溶液。

本發(fā)明還提供一種采用磁性微球分離外周血中游離核酸的方法，所述方法包括以下步驟：

①將50-300μl外周血的樣本加入至無(wú)核酸酶的離心管中，加入400-600μl裂解緩沖液和10-25μl蛋白酶k，混勻反應(yīng)5-20min，得裂解樣本；

②向裂解樣本中加入80-150μl結(jié)合緩沖液和20-50μl包含偶聯(lián)oligo(dt)25的磁性微球及帶有poly-a的非特異捕獲探針的核酸結(jié)合試劑，混勻后室溫靜置15-30min，將離心管于磁力架上磁吸附1-3min，吸棄上清，得磁珠-核酸復(fù)合物，其中非特異捕獲探針的序列為l(k)2-d(k)5-l(k)2-d(k)5-l(k)2-dt5da15；

③向磁珠-核酸復(fù)合物中加入700-1000μl漂洗緩沖液，混勻后磁吸附1-3min，吸棄上清，得純化的磁珠-核酸復(fù)合物，向純化的磁珠-核酸復(fù)合物中加入50-100μl洗脫緩沖液，晃動(dòng)下室溫孵育3-8min，得純化的游離核酸。

優(yōu)選的，所述裂解緩沖液為組成中包括濃度為0.4-0.8m的氯化芐、8-15mm的乙二胺四乙酸二鈉、3-8mm的二硫蘇糖醇、0.1-0.5mm的氫氧化鈉和0.1-2wt.％的十二烷基硫酸鋰的水溶液。

優(yōu)選的，所述結(jié)合緩沖液為組成中包括濃度為3-6m的氯化芐、0.5-1m的鹽酸胍、0.5-1.5m的乙酸和體積比5-13％的乙酸鉀的水溶液。

優(yōu)選的，所述漂洗緩沖液為組成中包括濃度為5-15mm的三羥甲基氨基甲烷、0.1-0.3m的氯化芐和0.1-2的乙二胺四乙酸二鈉的水溶液。

優(yōu)選的，所述洗脫緩沖液為濃度5-15mm的三羥甲基氨基甲烷的水溶液。

上述技術(shù)方案中，采用磁性微球分離外周血中游離核酸的試劑盒和方法，是基于含有poly-a的非特異性捕獲探針與樣本中的游離核酸特異性結(jié)合，偶聯(lián)oligo(dt)25的磁性微球借助oligo(dt)25與poly-a特異性結(jié)合形成復(fù)合體，再通過(guò)磁性實(shí)現(xiàn)游離核酸的分離提取。其中所述的外周血樣本可以是血清或血漿樣本，所述的非特異捕獲探針的序列為l(k)2-d(k)5-l(k)2-d(k)5-l(k)2-dt5da15，該序列是經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出來(lái)的核酸序列，具有高度的序列兼并性，能高效捕獲游離核酸中的核酸；所述的磁性微球可以是四氧化三鐵(fe3o4)納米顆粒或內(nèi)核層由磁性四氧化三鐵(fe3o4)顆粒構(gòu)成的納米顆粒，表面偶聯(lián)oligo(dt)25。本發(fā)明的方法只需一次漂洗，洗脫時(shí)無(wú)需額外分離磁珠即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用，大大簡(jiǎn)化了步驟，同時(shí)也避免了高溫孵育，避免了多次漂洗和洗脫后磁珠分離對(duì)高通量自動(dòng)化操作帶來(lái)的不便。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

①本發(fā)明偶聯(lián)oligo(dt)25的磁性微球和含有polya的非特異性捕獲探針能高效、完全捕獲外周血樣本中的游離核酸，保證了提取效率，少量樣本即可獲得足夠量的游離核酸；所純化的游離核酸樣本完整、純凈無(wú)污染。②所有操作步驟均在室溫下進(jìn)行，易操作；無(wú)需酚、氯仿等有毒溶劑抽提，對(duì)環(huán)境及操作者安全、綠色、友好；無(wú)需離心、沉淀等耗時(shí)步驟，大大縮短了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，本方法只需一次漂洗，洗脫時(shí)無(wú)需額外分離磁珠即可將純化的游離核酸用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，大大簡(jiǎn)化了步驟，提高了實(shí)驗(yàn)效率，且重復(fù)性好，更利于高通量自動(dòng)化操作。③優(yōu)選的技術(shù)方案中，對(duì)裂解緩沖液、結(jié)合緩沖液、漂洗緩沖液和洗脫緩沖液的組成進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了快速裂解，高效穩(wěn)定結(jié)合、高效漂洗和洗脫，大大提高了提取及分離效率。

附圖說(shuō)明

圖1實(shí)施例1中提取游離核酸后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建后的caliper峰圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍，實(shí)施例中涉及的試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，可從商業(yè)途徑獲得，所涉及的操作，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)操作，濃度中的“m”表示“mol/l”，“mm”表示“mmol/l”，wt.％為質(zhì)量百分比。

實(shí)驗(yàn)試劑的配制：

(1)按照0.4-0.8m的氯化芐、8-15mm的乙二胺四乙酸二鈉、3-8mm的二硫蘇糖醇、0.1-0.5mm的氫氧化鈉和0.1-2wt.％的十二烷基硫酸鋰的濃度計(jì)算各試劑用量，稱取或量取后加去離子水定容并混合均勻，得裂解緩沖液，示例性的或優(yōu)選的，各組分及濃度如下：氯化芐0.5m、乙二胺四乙酸二鈉10mm、二硫蘇糖醇5mm、氫氧化鈉0.2mm、十二烷基硫酸鋰1wt.％。其中，氯化芐可以協(xié)助破壞細(xì)胞；乙二胺四乙酸二鈉可以螯合二價(jià)金屬離子，從而抑制核酸酶對(duì)核酸的降解；二硫蘇糖醇作為巰基化dna的還原劑和去保護(hù)劑，可以進(jìn)一步增加核酸的穩(wěn)定性；氫氧化鈉主要起堿裂解樣本，從而釋放核酸的作用；十二烷基硫酸鋰協(xié)助氫氧化鈉進(jìn)行裂解，同時(shí)提供核酸結(jié)合的條件，在上述濃度下，裂解快速、徹底，有效保證了后續(xù)所得游離核酸dna的提取效率高，純度高。

(2)按照3-6m的氯化芐、0.5-1m的鹽酸胍、0.5-1.5m的乙酸和5-13wt.％的乙酸鉀的濃度計(jì)算各試劑用量，稱取或量取后加去離子水定容并混合均勻，得結(jié)合緩沖液，示例性的或優(yōu)選的，各組分及濃度如下：氯化芐0.5m、鹽酸胍1m、乙酸1m、乙酸鉀104.1mg。乙酸和乙酸鉀提供緩沖液體系和一定鹽離子濃度，鹽酸胍和氯化芐提供結(jié)合條件，使非特異探針與核酸的復(fù)合體能更好與磁珠進(jìn)行穩(wěn)定高效結(jié)合，保證提取效率。

(3)按照5-15mm的三羥甲基氨基甲烷、0.1-0.3m的氯化芐和0.1-2的乙二胺四乙酸二鈉的濃度計(jì)算各試劑用量，稱取或量取后加去離子水定容并混合均勻，得漂洗緩沖液，示例性的或優(yōu)選的，各組分及濃度如下：三羥甲基氨基甲烷(ph7.5)10mm、氯化芐0.15m、乙二胺四乙酸二鈉1mm，以該組成比例制成的漂洗緩沖液，漂洗效率高，只需一次漂洗即可去除雜質(zhì)，保證了提取游離核酸的純凈。

實(shí)施例1采用磁性微球分離血漿樣本中的游離核酸

①將200μl血漿樣本加入至無(wú)核酸酶的離心管中，然后向離心管中加入450μl裂解緩沖液混合均勻，再加入20μl蛋白酶k，用移液器吹吸或上下顛倒至充分混勻至均勻，并保持10min，得裂解樣本；

②向裂解樣本中加入100μl結(jié)合緩沖液和30μl核酸結(jié)合試劑，核酸結(jié)合試劑為包含偶聯(lián)oligo(dt)25的磁性微球和帶有poly-a的非特異捕獲探針的水溶液，其中偶聯(lián)oligo(dt)25的磁性微球濃度為0.1-5mg/ml，磁性微球上偶聯(lián)oligo(dt)25的量為50-200nmol/g，帶有poly-a的非特異捕獲探針濃度為0.5-5nmol/ml，用移液器吹吸或上下顛倒方式混合均勻，室溫下靜置20min，將離心管置于磁力架上磁吸附1.5min，此時(shí)，磁性微球富集在磁鐵部位，與上清分離，吸棄上清，得磁珠-核酸復(fù)合物，其中，偶聯(lián)oligo(dt)25的磁性微球可購(gòu)買獲得，亦可實(shí)驗(yàn)室制備，本實(shí)施例中選用內(nèi)核層由磁性四氧化三鐵(fe3o4)顆粒構(gòu)成的納米顆粒為磁性微球，非特異捕獲探針的序列為l(k)2-d(k)5-l(k)2-d(k)5-l(k)2-dt5da15，帶有poly-a的非特異捕獲探針為委托生物技術(shù)公司制備；

③將含有磁珠-核酸復(fù)合物的離心管從磁力架上取下，向磁珠-核酸復(fù)合物中加入900μl漂洗緩沖液，用移液器吹吸或渦旋振蕩的方式將體系混勻，再將離心管置于磁力架上，磁吸附1.5min，吸棄上清，得純化的磁珠-核酸復(fù)合物，最后向純化的磁珠-核酸復(fù)合物中加入60μl洗脫緩沖液，用移液器吹吸混勻，室溫孵育5min，期間輕輕晃動(dòng)使核酸充分洗脫，此時(shí)體系中共存磁珠及核酸，但兩者呈分離狀態(tài)，得到純化的游離核酸，該體系可直接用于應(yīng)用游離核酸的下游實(shí)驗(yàn)，其中的磁珠對(duì)核酸檢測(cè)無(wú)影響。

采用上述提取的純化的游離核酸進(jìn)行借助pcr試劑盒并按照常規(guī)程序進(jìn)行擴(kuò)增及文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)構(gòu)建的caliper峰圖見(jiàn)圖1，圖中縱坐標(biāo)表示熒光值，橫坐標(biāo)表示片段大小(單位為bp)，結(jié)果可知本實(shí)施例中提取游離核酸的濃度為609.40nmol/l，dna提取效率高，因?yàn)閞na易降解，且所提取的游離核酸在建庫(kù)過(guò)程中無(wú)反轉(zhuǎn)錄步驟，單鏈rna對(duì)建庫(kù)無(wú)明顯影響，可知上述提取的游離核酸為dan，無(wú)rna污染。

相比于普通試劑盒或方法需要1-10ml樣本，本方法只需200μl樣本即可提取足量游離核酸dna，且可直接用于下游實(shí)驗(yàn)，大大減小了樣本量；配方優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了快速裂解，高效漂洗和洗脫，整個(gè)提取分離過(guò)程僅需40min左右，步驟簡(jiǎn)化，相比目前的2-6h，提取效率大大提高，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間；均在室溫下進(jìn)行，且無(wú)需酚、氯仿等有毒溶劑抽提，對(duì)環(huán)境及操作者安全友好。

實(shí)施例2采用磁性微球分離血清樣本中的游離核酸

①將150μl血清樣本加入至無(wú)核酸酶的離心管中，然后向離心管中加入400μl裂解緩沖液混合均勻，再加入15μl蛋白酶k，用移液器吹吸或上下顛倒至充分混勻至均勻，并保持6min，得裂解樣本；

②向裂解樣本中加入100μl結(jié)合緩沖液和35μl核酸結(jié)合試劑，核酸結(jié)合試劑為包含偶聯(lián)oligo(dt)25的磁性微球和帶有poly-a的非特異捕獲探針的水溶液，用移液器吹吸或上下顛倒方式混合均勻，室溫下靜置15min，將離心管置于磁力架上磁吸附1min，此時(shí)，磁性微球富集在磁鐵部位，與上清分離，吸棄上清，得磁珠-核酸復(fù)合物，其中非特異捕獲探針的序列為l(k)2-d(k)5-l(k)2-d(k)5-l(k)2-dt5da15；

③將含有磁珠-核酸復(fù)合物的離心管從磁力架上取下，向磁珠-核酸復(fù)合物中加入700μl漂洗緩沖液，用移液器吹吸或渦旋振蕩的方式將體系混勻，再將離心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸棄上清，得純化的磁珠-核酸復(fù)合物，最后向純化的磁珠-核酸復(fù)合物中加入70μl洗脫緩沖液，用移液器吹吸混勻，室溫孵育5min，期間輕輕晃動(dòng)使核酸充分洗脫，得到含有磁性微球的純化的游離核酸，可直接用于下一步檢測(cè)。

采用上述提取的純化的游離核酸進(jìn)行借助pcr試劑盒并按照常規(guī)程序進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實(shí)施例中提取游離核酸的濃度為589.82nmol/l，提取效率高。

實(shí)施例3采用磁性微球分離血漿樣本中的游離核酸

①將100μl血漿樣本加入至無(wú)核酸酶的離心管中，然后向離心管中加入400μl裂解緩沖液混合均勻，再加入15μl蛋白酶k，用移液器吹吸或上下顛倒至充分混勻至均勻，并保持10min，得裂解樣本；

②向裂解樣本中加入80μl結(jié)合緩沖液和20μl核酸結(jié)合試劑，核酸結(jié)合試劑為包含偶聯(lián)oligo(dt)25的磁性微球和帶有poly-a的非特異捕獲探針的水溶液，用移液器吹吸或上下顛倒方式混合均勻，室溫下靜置15min，將離心管置于磁力架上磁吸附1min，吸棄上清，得磁珠-核酸復(fù)合物，其中非特異捕獲探針的序列為l(k)2-d(k)5-l(k)2-d(k)5-l(k)2-dt5da15；

③將含有磁珠-核酸復(fù)合物的離心管從磁力架上取下，向磁珠-核酸復(fù)合物中加入700μl漂洗緩沖液，用移液器吹吸或渦旋振蕩的方式將體系混勻，再將離心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸棄上清，得純化的磁珠-核酸復(fù)合物，最后向純化的磁珠-核酸復(fù)合物中加入60μl洗脫緩沖液，用移液器吹吸混勻，室溫孵育5min，期間輕輕晃動(dòng)使核酸充分洗脫，得到純化的游離核酸。

采用上述提取的純化的游離核酸進(jìn)行借助pcr試劑盒并按照常規(guī)程序進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實(shí)施例中提取游離核酸的濃度為616.40nmol/l，提取效率高。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。