本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，具體而言，涉及一種與螺原體感染相關的非編碼rna的鑒定方法、非編碼rna及其應用。
背景技術：
：細菌非編碼rna(non-codingrna，ncrna)，一般指大小為50—500個堿基，并以rna形式發(fā)揮生物學功能的一類rna分子，廣泛存在于各種細菌中，其主要通過堿基配對識別靶標mrna，調(diào)控mrna的翻譯或穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達，部分ncrna通過與蛋白質(zhì)相互作用而影響蛋白功能，與細菌的新陳代謝、環(huán)境適應、致病機理、毒力乃至耐藥性密切相關，是細菌代謝、群體感應和適應環(huán)境變化及毒力基因表達等的重要調(diào)節(jié)因子?，F(xiàn)有研究表明，ncrna在細菌的rna加工與修飾、mrna翻譯與穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)降解、細菌的生長與繁殖、黏附與侵襲、感染與致病等方面發(fā)揮重要功能。當今是“生命組學”的大發(fā)現(xiàn)時代，整合了多種組學的生命組學“大成”研究模式已現(xiàn)端倪，前程未可限量，自然出版集團專門開辟了組學平臺(omicsgateway,http://www.nature.com/omics/index.html)；隨著各種生命科學新方法與新技術的迅速涌現(xiàn)、改進與革新，使得眾多模式和非模式細菌的全基因組測序得以快速完成，越來越多細菌ncrna被發(fā)現(xiàn)和鑒定，細菌非編碼rna作為rna組學研究的重要組成部分，已逐漸成為生命科學的熱點之一。雖然，近年來細菌ncrna研究得到了較大發(fā)展，在許多模式菌和部分非模式菌中，相當數(shù)量的ncrna已被鑒定，但是仍有許多問題有待解決。例如，細菌調(diào)控ncrna及其靶基因和靶蛋白的總數(shù)？ncrna如何通過與其作用靶標而發(fā)揮生物學功能等？毋庸置疑，隨著更多細菌ncrna及其靶標的識別與鑒定，ncrna與其靶標，連同其它調(diào)節(jié)因子(如轉(zhuǎn)錄因子)一起，構成的復雜生物調(diào)控網(wǎng)絡的系統(tǒng)生物學發(fā)展，一定會得到圓滿的答案。螺原體是無細胞壁、具有運動性、可在人工培養(yǎng)基中生長繁殖、基因組極小的一類原核微生物，屬于柔膜體綱(mollicutes)，蟲原體目(entomoplasmatales)，螺原體科(spiroplasmataceae)，螺原體屬(spiroplasma)。其作為水生經(jīng)濟甲殼動物(蝦蟹，可引起顫抖病等)、家畜(牛羊，引起腦病變等)、植物(農(nóng)作物，可引起柑橘僵化病和玉米矮縮病等)、昆蟲(蜜蜂，可引起爬蜂病等)和人(可引起變異型免疫缺陷病等)等的重大致病菌，定植于不同宿主體內(nèi)，在長期與宿主共存的過程中，相互構成復雜的網(wǎng)絡，通過不同精細調(diào)控細菌的基因表達，以適應不同的生存環(huán)境，并對不同宿主發(fā)揮毒性作用。水生甲殼動物新型病原微生物螺原體是本人博士后期間所在課題組在江蘇和國家自然基金等多個項目的資助下發(fā)現(xiàn)的一種對我國重要經(jīng)濟水生甲殼動物造成極大威脅的病原微生物，它不僅是中華絨螯蟹“顫抖病”的重大致病菌(2008年農(nóng)業(yè)部已將該病列為新修訂的《一二三類動物疫病病種名錄》)，也是引起克氏原螯蝦、南美白對蝦和羅氏沼蝦等的致病菌，給蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大損失，其引起蝦蟹的重大流行病發(fā)病率高于30％，死亡率近100％。蝦蟹作為我國重要的經(jīng)濟水產(chǎn)動物，是出口創(chuàng)匯的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。僅江蘇省每年的河蟹產(chǎn)值就超過100億元。據(jù)國家質(zhì)檢總局報道，每年我國甲殼類病害造成的直接經(jīng)濟損失約為70億元。因此開展對這類動物的致病微生物，尤其是新型病原微生物螺原體的基礎與應用研究不僅對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的研究和防治具有重大意義，而且對推動螺原體類微生物的基礎生物學研究也具有積極促進和推動作用。有關研究報告顯示，細菌ncrna在參與細菌生長時相的調(diào)節(jié)中具有重要作用。螺原體由于其體積小(能濾過220nm孔徑濾膜)、具獨特的細胞骨架成分和螺旋結構以及類似蛇形的運動方式而被認為是一類非常特殊的微生物，近年來成為研究超微形態(tài)、大分子結構和功能以及無鞭毛微生物運動的理想模式微生物。然而，有關螺原體的分子生物學方面的研究卻較為滯后，到目前為止還沒有螺原體的全基因組公布，螺原體一些很有趣的生物學特點和現(xiàn)象還有待于分子生物學方面的深入探討和研究。如在體外培養(yǎng)不同生長時相(growthphase，對數(shù)期、平臺期、衰亡期)中螺原體形態(tài)變化很大。所以利用螺原體的這些表觀特征探討ncrna在這類特殊細菌生長不同階段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控差異具有重要意義。此外，也有研究報告顯示，細菌ncrna在細菌感染等方面同樣發(fā)揮重要的調(diào)控功能。我們前期的研究顯示，分離的水生動物螺原體不僅能感染中華絨螯蟹、克氏原螯蝦和南美白對蝦等水生甲殼類動物，而且與非凡螺原體spiroplasmamirum一樣還能人工感染乳鼠并引起白內(nèi)障病癥，這種廣泛的感染特性是其他螺原體沒有的，針對這一特點，我們可以探討ncrna在螺原體感染中發(fā)揮的重要功能。目前，關于柔膜體綱螺原體非編碼rna(ncrna)篩選、鑒定和調(diào)控機制的研究，至今在國內(nèi)外未見報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種與螺原體感染相關的非編碼rna的鑒定方法。該鑒定方法能夠鑒定出與螺原體感染相關的非編碼rna。本發(fā)明的另一目的在于提供一種與螺原體感染相關的非編碼rna，其由上述鑒定方法所鑒定得到。本發(fā)明的另一目的在于提供上述非編碼rna作為標志物在檢測螺原體感染中的應用。本發(fā)明的另一目的在于提供針對上述非編碼rna的探針在檢測螺原體感染中的應用。本發(fā)明的另一目的在于提供針對上述非編碼rna的探針在制備螺原體感染檢測試劑盒中的應用。本發(fā)明的另一目的在于提供上述非編碼rna在作為分子標記在選育或培育抗螺原體感染蝦蟹品種中的應用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種螺原體感染檢測試劑盒，該試劑盒基于上述的非編碼rna，可對螺原體感染進行檢測。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：一種與螺原體感染相關的非編碼rna的鑒定方法，其包括：步驟(1)：在基因組水平上，采用生物信息學方法對螺原體的基因組進行分析預測，得到與螺原體感染相關的第一候選非編碼rna庫；步驟(2)：在轉(zhuǎn)錄組水平上，提取螺原體的總rna，通過對非編碼rna轉(zhuǎn)錄組測序分析，得到與螺原體感染相關的第二候選非編碼rna庫；步驟(3)：取上述第一候選非編碼rna庫和上述第二候選非編碼rna庫的并集，作為第三候選非編碼rna庫；步驟(4)：根據(jù)上述第三候選非編碼rna庫，利用數(shù)字基因表達譜技術對螺原體體內(nèi)感染的入侵期和發(fā)病期的非編碼rna進行表達差異分析，得到具有表達差異的第四候選非編碼rna庫；步驟(5)：根據(jù)上述第三候選非編碼rna庫，利用數(shù)字基因表達譜技術對螺原體體外培養(yǎng)階段的對數(shù)期和平臺期的的非編碼rna進行表達差異分析，得到具有表達差異的第五候選非編碼rna庫；步驟(6)：取上述第四候選非編碼rna庫和上述第五候選非編碼rna庫的交集，得到第六候選非編碼rna庫；步驟(7)：根據(jù)上述第三候選非編碼rna庫，利用多款細菌非編碼rna的靶基因預測軟件，對螺原體非編碼rna進行靶基因分析和生物學功能注釋，得到螺原體非編碼rna的靶基因庫；步驟(8)：根據(jù)上述第三候選非編碼rna庫，利用多個毒力因子數(shù)據(jù)庫，對螺原體非編碼rna的靶基因進行毒力因子分析，得到螺原體非編碼rna靶基因為毒力因子的毒力基因庫；步驟(9)：將上述第六候選非編碼rna庫、上述螺原體非編碼rna的靶基因庫和上述螺原體非編碼rna靶基因為毒力因子的毒力基因庫，進行聯(lián)合分析，得到以毒力基因為靶基因的非編碼rna即為與螺原體感染相關的非編碼rna。一種與螺原體感染相關的非編碼rna，其通過上述非編碼rna的鑒定方法所鑒定得到。進一步地，上述與螺原體感染相關的非編碼rna包括seqidno:1-2中的至少一種。上述與螺原體感染相關的非編碼rna作為標志物在檢測螺原體感染中的應用。針對上述與螺原體感染相關的非編碼rna的探針在檢測螺原體感染中的應用。針對上述與螺原體感染相關的非編碼rna的探針在制備螺原體感染檢測試劑盒中的應用。所與螺原體感染相關的非編碼rna在作為分子標記在選育或培育抗螺原體感染蝦蟹品種中的應用。一種螺原體感染檢測試劑盒，其包括探針，該探針與上述與螺原體感染相關的非編碼rna互補。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明提供的與螺原體感染相關的非編碼rna鑒定方法，利用水生螺原體微生物資源，在已完成的全基因組測序與功能注釋以及重要功能基因研究的基礎上，采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(rna-seq)和數(shù)字基因表達譜技術(rna-seq)，結合生物信息學方法，從整個基因組和轉(zhuǎn)錄組水平，對該病原菌的ncrna進行系統(tǒng)和全面的篩查與鑒定，并分析該病原菌ncrna在不同宿主體內(nèi)、不同感染時期和體外培養(yǎng)不同階段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控差異。確定螺原體特定ncrna的生物學功能，為進一步探討該病原微生物的致病分子機理奠定基礎，同時豐富了螺原體類微生物基礎研究的內(nèi)容。采用該鑒定方法所鑒定出的ncrna與螺原體感染密切相關，其具有廣闊的應用前景，可作為生物標志物和分子標記在檢測不同宿主的螺原體感染中、在選育或培育抗螺原體感染的蝦蟹品種中等領域進行應用，同時還為不同宿主的防治提供實驗依據(jù)。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關的附圖。圖1為本發(fā)明實施提供的利用4款細菌非編碼rna靶基因預測軟件intarna、rnaup、rnaplex和starpicker進行聯(lián)合分析和功能注釋的非編碼rna靶基因分析結果。圖2為本發(fā)明提供的與螺原體感染的ncrna鑒定方法中的簡明技術路線圖。具體實施方式為使本發(fā)明實施的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。以下本發(fā)明實施例提供的一種與螺原體感染相關的非編碼rna的鑒定方法、非編碼rna及其應用進行具體說明。目前，關于細菌ncrna篩選和鑒定的方法，可以分成2大類：一類是基于生物信息學的計算機預測方法；另一類是基于實驗室的檢測分析方法?，F(xiàn)階段主要包括rna標記和染色、功能性遺傳篩選、蛋白質(zhì)共純化、基因芯片檢測、鳥槍克隆法、生物信息學搜尋、基因組selex和轉(zhuǎn)錄組測序等方面。具體來說，rna標記和染色是最早用于尋找ncrna的方法，但其不能區(qū)分ncrna和rrna、trna保守ncrna；功能性遺傳篩選能直接鑒定ncrna功能，但可能無法發(fā)現(xiàn)只在特定壓力條件下發(fā)生調(diào)控或轉(zhuǎn)錄活化抑制的ncrna；蛋白質(zhì)共純化能夠指示出所篩選的ncrna與蛋白質(zhì)的相互作用和活性形式，但是要求ncrna與蛋白質(zhì)牢固結合，共純化蛋白要有高度特異性抗體；鳥槍克隆法，也稱為rna組學，能夠檢測特定條件下所有的ncrna，而不需預先知道ncrna的特征，但費用昂貴，工作量繁重；基因芯片技術可用于研究ncrna的表達和尋找新的ncrna轉(zhuǎn)錄本，但費用昂貴，通常ncrnas檢測結果與northern雜交信號不一致；生物信息學方法可以預測新的ncrnas，能夠迅速得到許多可能的ncrnas候選基因列表，但其需要預先知道ncrnas的特征和對許多候選位點進行驗證；基因組selex具有靶分子范圍廣，篩選出的配體親和力和特異性高等特點，對細菌基因組序列無要求，能夠發(fā)現(xiàn)與特異蛋白質(zhì)結合的ncrna，可直接鑒定它們相互作用；轉(zhuǎn)錄組直接測序可得到特定條件下所有rna轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，能從整體水平研究基因結構和功能，采用此技術對細菌ncrna的高通量、高效率的篩選和鑒定，現(xiàn)已逐漸成為細菌非編碼rna研究的主要手段。但是，目前，對于螺原體ncrna篩選、鑒定和調(diào)控機制的研究，國內(nèi)外均未見報道。螺原體作為柔膜菌綱(mollicutes)中的一類細菌，體積很小，可以濾過220nm孔徑濾膜，是目前世界上已發(fā)現(xiàn)的原核生物中基因組極小卻具有自我復制能力的一類微生物。其中，它的基因組所編碼基因為1242個，編碼區(qū)在整個基因組中占很大比例，而非編碼區(qū)僅占約11％，這可揭示，螺原體ncrna在其生存、代謝和致病的表達調(diào)節(jié)中可能起著十分重要的調(diào)控作用。本研究從基因組和轉(zhuǎn)錄組兩個層次上，通過比較基因組和轉(zhuǎn)錄組手段，結合生物信息學分析方法，系統(tǒng)地研究了螺原體的與感染相關的ncrna?；诖?，一方面，本發(fā)明提供一種與螺原體感染相關的非編碼rna的鑒定方法，其包括：一種與螺原體感染相關的非編碼rna的鑒定方法，其包括：步驟(1)：在基因組水平上，采用生物信息學方法對螺原體的基因組進行分析預測，得到與螺原體感染相關的第一候選非編碼rna庫；步驟(2)：在轉(zhuǎn)錄組水平上，提取螺原體的總rna，通過對非編碼rna轉(zhuǎn)錄組測序分析，得到與螺原體感染相關的第二候選非編碼rna庫；步驟(3)：取上述第一候選非編碼rna庫和上述第二候選非編碼rna庫的并集，作為第三候選非編碼rna庫；步驟(4)：根據(jù)上述第三候選非編碼rna庫，利用數(shù)字基因表達譜技術對螺原體體內(nèi)感染的入侵期和發(fā)病期的非編碼rna進行表達差異分析，得到具有表達差異的第四候選非編碼rna庫；步驟(5)：根據(jù)上述第三候選非編碼rna庫，利用數(shù)字基因表達譜技術對螺原體體外培養(yǎng)階段的對數(shù)期和平臺期的的非編碼rna進行表達差異分析，得到具有表達差異的第五候選非編碼rna庫；步驟(6)：取上述第四候選非編碼rna庫和上述第五候選非編碼rna庫的交集，得到第六候選非編碼rna庫；步驟(7)：根據(jù)上述第三候選非編碼rna庫，利用多款細菌非編碼rna的靶基因預測軟件，對螺原體非編碼rna進行靶基因分析和生物學功能注釋，得到螺原體非編碼rna的靶基因庫；步驟(8)：根據(jù)上述第三候選非編碼rna庫，利用多個毒力因子數(shù)據(jù)庫，對螺原體非編碼rna的靶基因進行毒力因子分析，得到螺原體非編碼rna靶基因為毒力因子的毒力基因庫；步驟(9)：將上述第六候選非編碼rna庫、上述螺原體非編碼rna的靶基因庫和上述螺原體非編碼rna靶基因為毒力因子的毒力基因庫，進行聯(lián)合分析，得到以毒力基因為靶基因的非編碼rna即為與螺原體感染相關的非編碼rna。本發(fā)明的提供的與螺原體感染相關的非編碼rna的鑒定方法，利用水生螺原體微生物資源，在已完成的全基因組測序與功能注釋以及重要功能基因研究的基礎上，采用數(shù)字基因表達譜技術結合生物信息學方法，從整個基因組和轉(zhuǎn)錄組水平，對該病原菌的ncrna進行系統(tǒng)和全面的篩查與鑒定，并分析該病原菌ncrna在不同宿主體內(nèi)、不同感染時期和體外培養(yǎng)不同階段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控差異。確定螺原體特定ncrna的生物學功能，為進一步探討該病原微生物的致病分子機理奠定基礎，同時豐富了螺原體類微生物基礎研究的內(nèi)容。采用該鑒定方法所鑒定出的ncrna與螺原體感染密切相關，其具有廣闊的應用前景。進一步地，在本發(fā)明的一些實施方案中，在上述步驟(4)中，螺原體體內(nèi)感染的宿主為水產(chǎn)重要的經(jīng)濟甲殼動物中華絨螯蟹。需要說明的是，螺原體感染宿主的類型可根據(jù)情況進行選擇，例如可以是蝦等水生經(jīng)濟甲殼動物。另一方面，本發(fā)明提供了一種與螺原體感染相關的非編碼rna，其通過上述非編碼rna的鑒定方法所鑒定得到。進一步地，上述與螺原體感染相關的非編碼rna包括seqidno:1-2中的至少一種。另一方面，本發(fā)明提供了上述與螺原體感染相關的非編碼rna作為標志物在檢測螺原體感染中的應用。容易理解，由于采用本發(fā)明提供的鑒定方法所鑒定出的ncrna與螺原體感染密切相關，因此，所鑒定出的與螺原體感染相關的非編碼rna可以作為標志物在檢測螺原體感染中進行應用。例如通過檢測待測樣品是否含有所鑒定出的ncrna，即可判斷待測樣品是否受到螺原體感染。另一方面，本發(fā)明提供了針對上述與螺原體感染相關的非編碼rna的探針在檢測螺原體感染中的應用。容易理解，由于采用本發(fā)明提供的鑒定方法所鑒定出的ncrna與螺原體感染密切相關，因此，針對所鑒定出的與螺原體感染相關的非編碼rna的探針可以在檢測螺原體感染中進行應用。例如通過northernblot的方法或real-timeqrt-pcr方法，采用針對所鑒定出的與螺原體感染相關的非編碼rna的探針可以檢測出待測樣品中是否含有所鑒定出的ncrna，即可判斷待測樣品是否受到螺原體感染。另一方面，本發(fā)明提供了針對上述與螺原體感染相關的非編碼rna的探針在制備螺原體感染檢測試劑盒中的應用。另一方面，本發(fā)明提供了上述與螺原體感染相關的非編碼rna在作為標志物在選育或培育抗螺原體感染蝦蟹品種中的應用。另一方面，本發(fā)明提供了一種螺原體感染檢測試劑盒，其包括探針，該探針與上述與螺原體感染相關的非編碼rna互補。進一步地，在本發(fā)明的一些實施方案中，該探針與seqidno:1或seqidno:2互補。以下結合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述。實施例本實施例提供的與螺原體感染相關的非編碼rna的鑒定方法，其包括如下步驟：其中，本實施例提供的與螺原體感染相關的非編碼rna的鑒定方法的技術路線可參考圖2。1.1在基因組水平上，采用生物信息學方法對中華絨螯蟹螺原體(spiroplasmaeriocheirissp.nov.)的基因組進行分析預測，得到與螺原體感染相關的第一候選非編碼rna庫。首先，螺原體非編碼rna的生物信息學預測，是基于轉(zhuǎn)錄單元法、比較基因組學方法和機器學習法3種分析思路的整合；然后，通過對現(xiàn)有細菌非編碼rna的一系列預測軟件，利用現(xiàn)有生物學數(shù)據(jù)庫中的部分微生物基因組信息進行軟件篩選和可靠性評估；隨后，獲得以組合模式預測效果較好的2款預測軟件srnapredict3和portrait；最后，通過利用這2款軟件先分別對螺原體基因組信息和基因組模擬的轉(zhuǎn)錄組信息進行預測，并對預測結果取交集，從而獲得螺原體非編碼rna，這兩款軟件的聯(lián)合使用，保證了螺原體非編碼rna生物信息學預測的敏感性、特異性和陽性檢出率。螺原體預測得到的第一候選非編碼rna共42個，具體結果如下表1所示：表11.2在轉(zhuǎn)錄組水平上，提取中華絨螯蟹螺原體(spiroplasmaeriocheirissp.nov.；購自中華絨螯蟹螺原體菌株由中國典型培養(yǎng)物保藏中心，cctccm207170)的總rna，通過對非編碼rna轉(zhuǎn)錄組測序分析，得到與螺原體感染相關的第二候選非編碼rna庫。首先，利用細菌總rna提取試劑盒(rneasyminikit，qiagen)，按照說明書步驟提取河蟹體內(nèi)不同感染時期(入侵初期和發(fā)病期)和體外培養(yǎng)不同階段(對數(shù)期和非對數(shù)期)的螺原體的總rna(盡量保留細菌非編碼rna)，等量混合構建總rna池，根據(jù)細菌ncrna大小一般在50nt—500nt間和螺原體5srna量少的特點，通過page電泳對總rna分段回收(50nt—150nt和130nt-500nt)。然后，再利用定向反轉(zhuǎn)錄試劑和illumina公司的smallrnasampleprepkit試劑盒，構建單鏈特異測序文庫；隨后，采用solexa測序儀進行ncrna的深度測序；最后，通過配套的生物信息學分析平臺(illuminagenomestudio)以及相關生物軟件maq(短序列裝配和基因組定位)和soap(短序列裝配和質(zhì)量控制)等，從整個轉(zhuǎn)錄組水平上，高通量和高效率對水生螺原體ncrna進行篩查和鑒定。螺原體轉(zhuǎn)錄組測序分析得到的第二候選非編碼rna共21個，具體結果如下表2所示：表2非編碼rna序列起始點序列終止點序列長度sr01373571373977407sr0237818137826282sr0338827038836798sr04443595443776182sr05517368517963596sr0652795452801865sr07664315664453139sr08693385693648264sr09705233705021213sr10725930726079150sr11763810764058249sr1278426378418678sr131085824108573293sr141131402113130994sr1512111381211007132sr1612299891230268280sr171271355127126888sr1812914511291322130sr191309337130924989sr2013110181310799220sr2113349281334847821.3取上述第一候選非編碼rna庫和上述第二候選非編碼rna庫的并集作為第三候選非編碼rna庫。通過合并后總共獲得55個螺原體非編碼rna，具體結果如下表3所示：表31.4在轉(zhuǎn)錄組水平上，根據(jù)第三候選非編碼rna庫，利用數(shù)字基因表達譜技術對螺原體體內(nèi)感染的入侵期和發(fā)病期的非編碼rna進行表達差異分析，得到具有表達差異的第四候選非編碼rna庫。首先，對螺原體進行動物回感實驗，采取動物體內(nèi)感染入侵期和發(fā)病期的螺原體樣品；然后，提取總rna，并經(jīng)dnase消化和rrna/trna消化后，盡量剔除核糖體rna；隨后，對總rna隨機打斷，利用gnomegen生物公司的定向反轉(zhuǎn)錄試劑盒，分別在rna的3’和5’端加上包含illumina測序引物的接頭，合成雙鏈cdna，構建定向測序文庫；最后，利用illumina公司的hiseq2000測序儀進行雙向測序，對所測得的冗長序列進行一系列的原始過濾，除去mrna、rrna、trna、snrna、snorna、重復序列和其他ncrnas序列，從而獲得螺原體非編碼rna(ncrna)基因序列及表達量，結合生物信息學分析，從而得到螺原體體內(nèi)感染的入侵期(earlystage)和發(fā)病期(morbiditystage)的ncrna表達差異情況。體內(nèi)感染的入侵期和發(fā)病期的螺原體數(shù)字基因表達譜技術分析得到的第四候選非編碼rna，具體結果如下表4所示：表4需要說明的是，本步驟中，螺原體體內(nèi)感染的宿主為中華絨螯蟹。1.5在轉(zhuǎn)錄組水平上，根據(jù)第三候選非編碼rna庫，利用數(shù)字基因表達譜技術對螺原體體外培養(yǎng)階段的對數(shù)期和非對數(shù)期(包括平臺期和衰亡期)的的非編碼rna進行表達差異分析，得到具有表達差異的第五候選非編碼rna庫。首先，對螺原體進行體外細菌培養(yǎng)，獲取體外培養(yǎng)階段的對數(shù)期(dui)和非對數(shù)期(feidui)的螺原體樣品；隨后，進行數(shù)字基因表達譜技術分析，具體的操作方法與1.4相同。體外培養(yǎng)階段的對數(shù)期和平臺期螺原體數(shù)字基因表達譜技術分析得到的第五候選非編碼rna，具體結果如下表5所示：表51.6取上述第四候選非編碼rna庫和上述第五候選非編碼rna庫的交集作為第六候選非編碼rna庫。具體結果如下表6所示：表6非編碼rna序列起始點序列終止點序列長度sr01373571373977407sr05517368517963596sr08693385693648264sr11763810764058249sr191309337130924989sr211334928133484782s16607582607777195s07272449272564115s042026062027911851.7根據(jù)第三候選非編碼rna庫，利用4款細菌非編碼rna靶基因預測軟件intarna、rnaup、rnaplex和starpicker進行聯(lián)合分析和功能注釋，并對4款軟件分析結果取交集，共得到可靠性高的螺原體非編碼rna的靶基因，共423個。具體結果如圖1顯示。1.8根據(jù)423個螺原體非編碼rna的靶基因，利用2個毒力因子數(shù)據(jù)庫mvirdb和vfdb，分別對上述靶基因進行毒力因子分析，結果取交集，這423個靶基因中有30個為毒力基因，30毒力基因?qū)姆蔷幋arna為14個。具體結果主要包括：為毒力基因的靶基因，scrab0151、scrab0165、scrab0175、scrab0193、scrab0244、scrab0264、scrab0266、scrab0316、scrab0405、scrab0413、scrab0453、scrab0614、scrab0659、scrab0698、scrab0704、scrab0767、scrab0869、scrab0946、scrab1010、scrab1011、scrab1013、scrab1018、scrab1019、scrab1061、scrab1063、scrab1088、scrab1117、scrab1145、scrab1164、scrab1210；這些靶基因?qū)姆蔷幋arna，s02、s03、s12、s15、s20、s26、sr01、sr03、sr04、sr05、sr10、sr12、sr16、sr18。1.9將第六候選非編碼rna庫和為毒力基因的靶基因?qū)姆蔷幋arna進行取交集，即為上述與螺原體感染相關的非編碼rna。最后，得到與螺原體感染相關的非編碼rna，包括：sr01和sr05。sr01的堿基序列如seqidno.1所示，sr05的堿基序列如seqidno.2所示。綜上，通過本實施例提供的鑒定方法所鑒定得到的與螺原體感染的非編碼rna能夠準確、可靠地反應螺原體的感染能力，與螺原體感染密切相關，其具有廣闊的應用前景，可作為生物標志物在檢測不同宿主的螺原體感染中、在選育或培育抗螺原體感染的蝦蟹品種中等領域進行應用，同時還為不同宿主的防治提供實驗依據(jù)。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>鹽城工學院<120>一種與螺原體感染相關的非編碼rna的鑒定方法、非編碼rna及其應用<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>407<212>rna<213>中華絨螯蟹螺原體（spiroplasmaeriocheirsp.nov.）<400>1auaggagcagaauuguuauuuagcaagggggcgacuaugaaaaauaccgaggaaugugaa60guugaacuaaccggaauuauugaaaauaauagccaacaguuacuuccacaauacauuaga120gacauugcaauugcuaaagaaugauuagaggaauuaauugcccgugagagcgugaccaac180gaagacuuauuggcaauaaacaaauuauuaacugacuuacuaacaaaaaucagaauugac240caacaaugccaacaucaaaaaaucacagcaacaccacuagaaguugauguugaacaaaug300acugugacuugggaucuuuuuugugaaggcuguucaauucguaaagaaaaaacuaguaau360uuagauuuaucaguacccuuaucagaguuagcaaaagcaaucccguu407<210>2<211>596<212>rna<213>中華絨螯蟹螺原體（spiroplasmaeriocheirsp.nov.）<400>2uuaggaagagauuuauaaaacgaacagcaagucuuuucucagauacauuauugauuaaaa60aauaauuaugauaggaaaggaggugggauccucauauggguaccccaucaauugauaaau120auaaacugcaaaaaacuauuuacgaaugcgaaaauuauuuaaucaaggaaagagguaucu180guauugaaauauuauauuuauaaaaguauuaacgaugcaugcuauagugcauuaaaauaa240caaacuuauucauauauaacauuuauaaauuuaccuucgaaaauacauauaaauuaauau300accccauuaaaauaacuuaucauaagaaauauauuauaacaaauaacaggugcuguuaaa360aaauaaucauaaguuuuauauuuuaguuuuaaauauaauuuauaaaaauuuauucuuauc420uccauuuuaauaugucgcuauuuacucauucucgucuacauugaauuuguuuaacucuua480uauaauauuuaauuuuuuagcacaucuguuauucucaaaacccuuaugcuuaauaauaaa540uugaacuuuauaaaaaauauccucucacuuauuuaaauuuaaguucaaaaaaacau596當前第1頁12