本發(fā)明屬于分子生物學領域，尤其涉及一種檢測遠志藥材中化合物sibiricosea5與sibiricosea6含量高低的pcr引物及方法。

背景技術：

遠志(polygalatenuifoliawilld.)始載于《神農本草經》，列為上品，且為常用中藥。性溫，味苦、辛，具有安神益智、祛痰消腫等功效。經現代研究發(fā)現，遠志藥材的主要有效成分包括皂苷類、糖酯類、口山酮類及生物堿類等，具有抑菌、抗炎、提高認知、改善記憶能力、抗老年癡呆、抗抑郁、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用。

中藥材藥效的強弱與藥材質量的優(yōu)劣密切相關，而藥材質量的優(yōu)劣與藥材中所含主要化學成分含量的高低緊密相關。研究表明，糖酯類化合物sibiricosea5與sibiricosea6具有較強的抗癡呆及抗抑郁活性。目前對化合物sibiricosea5與sibiricosea6的定性及定量分析，主要集中于提取分離、hplc(uplc)含量測定、指紋圖譜、一測多評或代謝組學等方法，但這些方法存在著諸多不足：提取分離具有極大的盲目性，耗時長，同時還不可避免的涉及到大量的重復性工作；hplc(uplc)含量測定、指紋圖譜、一測多評或代謝組學等方法，所用儀器比較昂貴，對實驗操作人員的技術要求較高，難以普遍推廣應用。中藥材中次生代謝物的累積程度及含量變化又受生長年限的影響，中藥材尤其是根莖類中藥材，生長年限較長，一般以2-3年生為主，測定中藥材中所含化合物的含量需要較長時間。

化合物含量是多基因控制的復雜性狀，不同遠志樣品間化合物含量差異較大。sibiricosea5與sibiricosea6具有相同的母核結構，其含量可能受同一類型或同一個基因控制。故本發(fā)明篩選出與sibiricosea5與sibiricosea6含量相關的特異性dna分子條帶，目的是針對該特異性條帶設計出可檢測sibiricosea5與sibiricosea6含量高低的特異性pcr引物，并希望得到實際應用。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可檢測遠志藥材中sibiricosea5與sibiricosea6含量高低的pcr引物；以及利用該pcr引物檢測遠志藥材中sibiricosea5與sibiricosea6含量高低的方法。該方法具有方便快捷、準確性好的優(yōu)點，可在遠志藥材的良種選育中應用，可大大縮短育種時間，提高育種效率。

本發(fā)明提供的一種檢測遠志藥材中sibiricosea5與sibiricosea6含量的pcr引物，該特異性pcr引物如下所示：

上游引物：5’-agatggtgagcgtgatt-3’(seqidno.1)；

下游引物：5’-caagccctctttcaata-3’(seqidno.2)。

本發(fā)明提供的一種檢測遠志藥材中sibiricosea5與sibiricosea6含量的方法，包括如下步驟：

(1)提取遠志樣品的基因組dna；

具體為采用ctab法提取基因組dna；由于各個發(fā)育時期的個體、各個組織器官甚至細胞的dna保持一致，不受環(huán)境的影響且遺傳穩(wěn)定，故可選取任意生長時期、任意組織部位的遠志樣品提取dna。

(2)以所述基因組dna為模板，利用所述的pcr引物進行pcr擴增；

其中，采用特異性引物進行pcr擴增時，pcr擴增反應體系優(yōu)選為25μl，包括：3μl模板dna，10μm上下游引物各1μl，12.5μl2×easytaqpcrsupermix，用滅菌超純水補足反應體積；

pcr擴增程序優(yōu)選為：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)；72℃5min，10℃10min。

(3)通過pcr擴增產物檢測化合物sibiricosea5與sibiricosea6的含量；

利用1.0％-2.0％瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測pcr擴增產物，在紫外線下觀察瓊脂糖凝膠，能擴增出長度為629bp條帶的遠志樣品，其所含化合物sibiricosea5與sibiricosea6的含量較低。

所述瓊脂糖凝膠濃度優(yōu)選為1.5％。

與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果：

(1)利用本發(fā)明的引物可準確高效地檢測遠志藥材中sibiricosea5與sibiricosea6含量的高低，進而對遠志藥材品質進行初步鑒定；

(2)利用本發(fā)明的引物可對遠志種子或者在苗期對遠志藥材的幼嫩葉片進行檢測，大大提高了化合物sibiricosea5與sibiricosea6含量較高的遠志優(yōu)良品種的篩選效率，加快了遠志藥材育種的進程，縮短了育種周期。

附圖說明

圖1為特異性引物分別擴增7份遠志樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中1-7分別為7個遠志藥材樣品，5-7號遠志藥材pcr擴增產物長度為629bp；m為dl2000dnamarker，由上至下依次為2000bp，1000bp，750bp，500bp。

具體實施方式

以下實施例用于說明本方法，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，以下實施例均按照常規(guī)實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(newyork：goldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的操作技術規(guī)程，或按照制造廠商所建議的實驗條件；所用試劑均為市售商品。

本發(fā)明所提供的特異性鑒別引物(上游引物：5’-agatggtgagcgtgatt-3’；下游引物：5’-caagccctctttcaata-3’)，其設計的具體方法為：首先對遠志藥材中化合物sibiricosea5與sibiricosea6進行含量測定，結合issr(inter-simplesequencerepeat)分子標記技術，利用spss16.0軟件篩選出與化合物sibiricosea5及sibiricosea6含量相關的特異性條帶，對特異性條帶進行膠回收、克隆測序，并利用primerpremier5.0軟件針對目標序列設計出特異性pcr引物。

實施例1遠志藥材中sibiricosea5與sibiricosea6含量高低的檢測方法

1.樣品來源

本實施例中采用的遠志藥材為山西省不同產地收集到的7批遠志藥材的干燥根，遠志樣品具體信息見表1。

表1遠志樣品信息表

2.基因組dna的提取

將上述樣品，每個樣品取約60mg，用液氮研磨成粉末，利用ctab法提取dna。試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司，型號為：ctab植物基因組dna快速提取試劑盒(貨號：dn14)，50次。具體實驗方法參照試劑盒說明書。

3.pcr擴增

以步驟2所得到的每一個遠志藥材基因組dna作為pcr擴增的dna模板，以5’-agatggtgagcgtgatt-3’為上游引物，5’-caagccctctttcaata-3’為下游引物進行常規(guī)pcr擴增。pcr擴增反應體系為25μl，包括：3μl模板dna，10μm上下游引物各1μl，12.5μl2×easytaqpcrsupermix，用滅菌超純水補足反應體積。pcr擴增程序為：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)；72℃5min；10℃10min，獲得每一個遠志藥材的pcr擴增產物。

4.遠志藥材中sibiricosea5與sibiricosea6含量高低的檢測

將每一種遠志藥材的擴增片段上樣于濃度為1.5％的瓊脂糖凝膠的樣品孔中，進行瓊脂糖凝膠電泳；電壓為138v，電泳時間為30min，以dl2000dnamarker作為dna分子大小的標準，并將電泳結果在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，得到如圖1所示的瓊脂糖凝膠電泳圖。

由圖1可見，2號、7號遠志藥材沒有擴增出任何條帶，這2個遠志樣品中化合物sibiricosea5與sibiricosea6含量較高，均高于1.900mg/g，可作為遠志藥材的優(yōu)良品種進行選育；除2號、7號以外的5個遠志樣品均擴增出一條長度為629bp的條帶，這5個遠志樣品中化合物sibiricosea5與sibiricosea6含量較低，sibiricosea5含量均低于1.650mg/g，sibiricosea6含量均低于1.400mg/g。

實施例2pcr產物與遠志藥材中sibiricosea5與sibiricosea6含量的相關性研究

1.與遠志藥材中sibiricosea5與sibiricosea6含量相關的基因序列的檢測

取實施例1步驟3得到的5份(1號、3號、4號、5號、6號)遠志藥材的pcr擴增片段，送交生工生物工程(上海)股份有限公司和上海桑尼生物科技有限公司分別進行二次雙向測序，以dnaman等生物信息學軟件分析，結果顯示，5份遠志藥材的dna序列均完全相同，pcr片段長度為629bp，dna序列如seqidno.3所示。

2.遠志藥材中sibiricosea5與sibiricosea6含量的測定

(1)取實施例1步驟1中的7份遠志藥材的干燥根，用木棒敲打或用手揉搓，抽去木心，得到遠志筒，粉碎，過藥典三號篩，備用。

(2)對照品溶液的配制：稱取sibiricosea5與sibiricosea6對照品適量，精密稱定，甲醇定容，配制成質量濃度分別為0.247、0.153mg/ml的對照品貯備液。

(3)供試品溶液的配制：取已過藥典三號篩的遠志藥材粉末約0.2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70％甲醇20ml，稱定重量，超聲處理30min(功率500w，頻率40khz)，放至室溫，再次稱定重量，用70％甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

(4)利用watersacquityuplch-classuplc色譜儀對遠志樣品的對照品及供試品溶液進行分析，根據對照品溶液構建的線性方程計算遠志供試品溶液中化合物sibiricosea5與sibiricosea6的含量。

(5)色譜條件：色譜柱為phenomenexkinetexc18(100×2.10mm，2.6μm)；流動相為乙腈(a)-0.1％甲酸溶液(b)梯度洗脫，洗脫梯度如下：0-3min，5-10％a；3-6min，10-12％a；6-16min，12-22％a；16-17min，22％a；17-22min，22-27％a；22-25min，27-32％a；25-27min，32-35％a；27-30min，35％a；30-36min，35-40％a；36-37min，40-100％a；37-39min，100-5％a。檢測波長：320nm；進樣量：2μl；采集時間：39min；柱溫：40℃；流速：0.4ml/min；理論塔板數均不低于6000。

(6)精密吸取sibiricosea5與sibiricosea6對照品溶液適量，用甲醇逐級稀釋1、2、4、8、16和32倍，搖勻。按(5)項下色譜條件進樣分析，進樣量為2μl，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(y)，質量濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線，得到線性回歸方程?；衔飐ibiricosea5的線性回歸方程為y＝1.0×10⁷x+54664(r²＝0.9995)；化合物sibiricosea6的線性回歸方程為y＝1.0×10⁷x+22829(r²＝0.9997)。

(7)樣品含量測定：按(5)項下色譜條件分別測定7批遠志樣品中化合物sibiricosea5與sibiricosea6的含量，結果見表2。由表2可見，實施例1所篩選出sibiricosea5與sibiricosea6含量較低的遠志藥材，即除2號、7號以外的5個遠志樣品均擴增出一條長度為629bp的條帶，這5個遠志樣品中化合物sibiricosea5與sibiricosea6含量較低，sibiricosea5含量均低于1.650mg/g，sibiricosea6含量均低于1.400mg/g。

表27批遠志樣品中化合物sibiricosea5與sibiricosea6的質量分數(mg/g)

sequencelisting

<110>山西大學

<120>檢測遠志中sibiricosea5與sibiricosea6含量的方法

<130>.

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>polygalatenuifoliawilld.

<400>1

agatggtgagcgtgatt17

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>polygalatenuifoliawilld.

<400>2

caagccctctttcaata17

<210>3

<211>629

<212>dna

<213>polygalatenuifoliawilld.

<400>3

caagccctctttcaatatgcaatctggcaatggaggcaacttgtaaagtgcaatgtcaag60

aagcaccttcacccctttgacagattcaggaagcaaatactctgaccagcttgagaagcc120

aatcctctcaaggcttgaattggtaattgattcagtcaaagcagtgacagtattagttgc180

caccatagaatcaaccagctcaggatacatttcagccatcttaaaaccaaccattccacc240

ataactaaaaccaaccaagatgcatttctcaactccgatcttcttcaatcctctcgctac300

acactcagcttgaaaagcaggtgatctctcaagcttgtctgtgcttgagctcccaaagaa360

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