本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種葉酸代謝相關(guān)基因的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

葉酸又稱(chēng)蝶酰谷氨酸，由喋啶核、對(duì)氨苯甲酸及谷氨酸3個(gè)部分組成。人和哺乳動(dòng)物都只能通過(guò)腸道吸收外源的葉酸而不能自身合成葉酸。葉酸主要被小腸上段吸收，在十二指腸和空腸上皮黏膜細(xì)胞內(nèi)含葉酸還原酶，在該酶的作用下葉酸甲基化生成二氫葉酸，再甲基化后生成四氫葉酸。甲基四氫葉酸為一碳單位的載體，參與組成dna和rna的嘌呤和嘧啶等重要物質(zhì)的生物合成。葉酸代謝還具有很高的個(gè)體差異，而且受到生物體內(nèi)多種因素的影響，尤其是受葉酸代謝過(guò)程中重要的酶如亞甲基四氫葉酸還原酶(mthfr)和甲硫氨酸合成酶多態(tài)性的影響。葉酸在細(xì)胞內(nèi)需要代謝轉(zhuǎn)化才能發(fā)揮其生物學(xué)作用，亞甲基四氫葉酸還原酶是葉酸代謝通路中的關(guān)鍵酶，mthfr基因核苷酸多態(tài)(677c→t和1298a→c)使其編碼的酶功能活性降低，從而影響葉酸的生物轉(zhuǎn)化和功能。

葉酸是指具有相關(guān)生物活性的一類(lèi)通效維生素，有蝶啶、對(duì)氨基苯甲酸和一個(gè)或多個(gè)谷氨酸結(jié)合而成，即由α-氨基-4-羥基蝶啶與對(duì)氨基苯甲酸相連接，在以-nh-co-鍵與谷氨酸鏈接組成，其不同的輔酶形成可以作為一碳單位的供體或載體而發(fā)揮作用，主要參與以下幾類(lèi)反應(yīng)：①蛋氨酸合成；②嘌呤和嘧啶的合成；③絲氨酸和甘氨酸的相互轉(zhuǎn)化和組氨酸的降解。大量研究表明，葉酸攝入絕對(duì)或相對(duì)的缺乏，是引起高同型半胱氨酸血癥的直接原因。高同型半胱氨酸血癥可能導(dǎo)致新生兒神經(jīng)管缺陷(ntds)、唐氏綜合征(ds)、先天性心臟病(chd)、唇腭裂；孕婦妊娠高血壓、早產(chǎn)、自發(fā)性流產(chǎn)。

目前了解到涉及葉酸代謝能力的關(guān)鍵基因包括亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶(mtrr),這兩種酶的基因出現(xiàn)位點(diǎn)變異導(dǎo)致酶活性降低，會(huì)顯著影響機(jī)體的葉酸代謝能力,目前，葉酸代謝相關(guān)基因的檢測(cè)方法普遍存在檢測(cè)精確度差、速度慢的缺陷，需要進(jìn)行有效的改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)精確度差、速度慢的缺陷，而提供一種葉酸代謝相關(guān)基因的檢測(cè)方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題提供的技術(shù)方案是：本發(fā)明公開(kāi)了一種葉酸代謝相關(guān)基因的檢測(cè)方法，具體步驟如下：

(1)、對(duì)檢測(cè)者的口腔黏膜細(xì)胞提取dna；

(2)、分別用seqno1和seqno2擴(kuò)增mthfr基因c677t，用seqno3和seqno4擴(kuò)增mthfr基因a1298c，用seqno5和seqno6擴(kuò)增mtrr基因a66g，以口腔黏膜細(xì)胞提取dna為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，取25ul體系，其包括:

模板：2ul、seqno1:1ul、seqno2：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；

模板：2ul、seqno3:1ul、seqno4：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；

模板：2ul、seqno5:1ul、seqno6：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；

(3)、將上述3對(duì)引物進(jìn)行普通pcr擴(kuò)增產(chǎn)物1％的瓊脂糖凝膠電泳；

(4)、將1％的瓊脂糖凝膠電泳條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶；

(5)、測(cè)序反應(yīng)：

測(cè)序反應(yīng)5ul體系：引物1ul，膠回收產(chǎn)物為模板和水共3ul，bigdye1ul，測(cè)序反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，接著進(jìn)入循環(huán)，95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存；

(6)、測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化，變性，上3730測(cè)序儀測(cè)序；

(7)、將測(cè)序結(jié)果用chromas軟件分析3個(gè)snp基因型即可。

作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，采用口腔拭子dna提取試劑盒對(duì)檢測(cè)者的口腔黏膜細(xì)胞提取dna；

作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，提取的dna濃度不低于10ng/ul，260/280＝1.8；

作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，所述的提供葉酸代謝能力基因檢測(cè)的特異性擴(kuò)增的引物seqno1、seqno2、seqno3、seqno4、seqno5和seqno6，其堿基序列如下所示：

seqno1：cctctcctgactgtcatccc

seqno2：gccttcacaaagcggaagaa

seqno3：gtgggacgagttccctaacg

seqno4：cactccagcatcactcactttg

seqno5：gccttgaagtgatgaggagg

seqno6：ccactgtaacggctctaacc。

作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，其反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，接著進(jìn)入循環(huán)，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供一種檢測(cè)葉酸代謝能力基因的方法，包括如下步驟：獲取受檢者核酸，所述核酸包含dna片段，所述的dna片段使用口腔拭子刮取口腔黏膜細(xì)胞，用天跟口空拭子提取試劑盒提取dna；檢測(cè)一下葉酸代謝能力基因的的snp位點(diǎn)的基因型，mthfr基因c677t、mthfr基因a1298c和mtrr基因a66g，其中包括3對(duì)引物擴(kuò)增包含所述snp位點(diǎn)的dna片段，確定所述snp位點(diǎn)的堿基類(lèi)型。受檢者可以是人或者其他哺乳動(dòng)物。亞甲基四氫葉酸還原酶的c667t位點(diǎn)和a1298c位點(diǎn)催化產(chǎn)生5-甲基四氫葉酸，參與甲基傳遞及核苷酸合成通路，mthfr酶活性降低，同型半胱氨酸在體內(nèi)積累。甲硫氨酸合成酶(mtrr)的a66g位點(diǎn)將失活的甲硫氨酸合成酶還原成活性狀態(tài)，維持甲基傳遞通路繼續(xù)進(jìn)行，mtrr酶的活性降低，易致同型半胱氨酸血癥、神經(jīng)管缺陷等疾病。上述snp位點(diǎn)根據(jù)hgvs命名法標(biāo)注該位點(diǎn)在參考cdna上的位置來(lái)表示的，是為簡(jiǎn)便指代某個(gè)特定snp位點(diǎn)，一個(gè)snp位點(diǎn)還可以有其它表示方式，如以下會(huì)出現(xiàn)的以“rs”開(kāi)頭的snp位點(diǎn)表示方式，rs1801133與mthfr基因c677t表示同一個(gè)位點(diǎn)，該方式是genbanksnp數(shù)據(jù)庫(kù)的命名方法，以“rs”加7位阿拉伯?dāng)?shù)字來(lái)表示一個(gè)snp。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)如snp數(shù)據(jù)庫(kù)中確定并獲得特定snp位點(diǎn)基因序列上的位置信息的同時(shí)，也能獲得其前后序列、分布頻率等。本發(fā)明利用3個(gè)snp位點(diǎn)，確定了3個(gè)位點(diǎn)的3對(duì)引物，用pcr擴(kuò)增sanger測(cè)序獲得3個(gè)位點(diǎn)的基因型。該方法是一種成本低，速度快、高準(zhǔn)確度的葉酸代謝相關(guān)基因分型的方法。

經(jīng)過(guò)反復(fù)的實(shí)驗(yàn)與推敲，本發(fā)明選出了3對(duì)特異性很好的引物，第一對(duì)用于檢測(cè)mthfr基因c677t基因型，第二對(duì)用于檢測(cè)mthfr基因a1298c基因型，第三對(duì)引物用于檢測(cè)mtrr基因a66g基因型。并且建立了穩(wěn)定的反應(yīng)體系，摸索出理想的反應(yīng)條件，應(yīng)用敏感度較高的丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)作為結(jié)果檢出手段，因此得出可靠地實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1的對(duì)3對(duì)引物進(jìn)行普通pcr擴(kuò)增產(chǎn)物1％的瓊脂糖凝膠電泳圖。

附圖標(biāo)記為：m:marker2000；1:mthfr基因c677t；2:mthfr基因a1298c；3:mtrr基因a66g。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。

本發(fā)明公開(kāi)了一種葉酸代謝相關(guān)基因的檢測(cè)方法，具體步驟如下：

(1)、對(duì)檢測(cè)者的口腔黏膜細(xì)胞提取dna；

(2)、分別用seqno1和seqno2擴(kuò)增mthfr基因c677t，用seqno3和seqno4擴(kuò)增mthfr基因a1298c，用seqno5和seqno6擴(kuò)增mtrr基因a66g，以口腔黏膜細(xì)胞提取dna為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，取25ul體系，其包括:

模板：2ul、seqno1:1ul、seqno2：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；

模板：2ul、seqno3:1ul、seqno4：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；

模板：2ul、seqno5:1ul、seqno6：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；

(3)、將上述3對(duì)引物進(jìn)行普通pcr擴(kuò)增產(chǎn)物1％的瓊脂糖凝膠電泳；

(4)、將1％的瓊脂糖凝膠電泳條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶；

(5)、測(cè)序反應(yīng)：

測(cè)序反應(yīng)5ul體系：引物1ul，膠回收產(chǎn)物為模板和水共3ul，bigdye1ul，測(cè)序反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，接著進(jìn)入循環(huán)，95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存；

(6)、測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化，變性，上3730測(cè)序儀測(cè)序；

(7)、將測(cè)序結(jié)果用chromas軟件分析3個(gè)snp基因型即可。

分析如下：表1

表2

作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，采用口腔拭子dna提取試劑盒對(duì)檢測(cè)者的口腔黏膜細(xì)胞提取dna；

作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，提取的dna濃度不低于10ng/ul，260/280＝1.8；

作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，所述的提供葉酸代謝能力基因檢測(cè)的特異性擴(kuò)增的引物seqno1、seqno2、seqno3、seqno4、seqno5和seqno6，其堿基序列如下所示：

seqno1：cctctcctgactgtcatccc

seqno2：gccttcacaaagcggaagaa

seqno3：gtgggacgagttccctaacg

seqno4：cactccagcatcactcactttg

seqno5：gccttgaagtgatgaggagg

seqno6：ccactgtaacggctctaacc。

作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，其反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，接著進(jìn)入循環(huán)，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存。

實(shí)施例1

將孕婦唐某進(jìn)行葉酸代謝相關(guān)基因檢測(cè)

(1)、用口腔拭子dna提取試劑盒對(duì)唐某的口腔黏膜細(xì)胞提取dna，確保dna濃度25ng/ul，260/280＝1.91；

(2)、分別用seqno1和seqno2擴(kuò)增mthfr基因c677t；用seqno3和seqno4擴(kuò)增mthfr基因a1298c；用seqno5和seqno6擴(kuò)增mtrr基因a66g。以口腔黏膜細(xì)胞提取dna為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，取25ul體系，其包括:

模板：2ul、seqno1:1ul、seqno2：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；

模板：2ul、seqno3:1ul、seqno4：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；

模板：2ul、seqno5:1ul、seqno6：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；

其反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，接著進(jìn)入循環(huán)，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存；

(3)、將上述3對(duì)引物進(jìn)行普通pcr擴(kuò)增產(chǎn)物1％的瓊脂糖凝膠電泳；

(4)、將1％的瓊脂糖凝膠電泳條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收mthfr基因c677t目的條帶168bp、mthfr基因a1298c目的條帶226bp和mtrr基因a66g目的條帶159bp；

(5)、測(cè)序反應(yīng)

測(cè)序反應(yīng)5ul體系：引物1ul，膠回收產(chǎn)物為模板和水共3ul，bigdye1ul。

測(cè)序反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，接著進(jìn)入循環(huán)，95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25個(gè)循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存。

(6)、測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化，變性，上3730測(cè)序儀測(cè)序。

(7)、將測(cè)序結(jié)果用chromas軟件分析3個(gè)snp基因型。

檢測(cè)結(jié)果如表3

結(jié)果分析

上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。