本發(fā)明涉及一種分型方法和系統(tǒng)，尤其涉及一種六色熒光str分型方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：目前法醫(yī)str檢測均使用成熟的熒光標(biāo)記str復(fù)合擴增試劑盒，主要針對案件及dna數(shù)據(jù)庫建設(shè)兩方面的新需求來進(jìn)行研究。從案件角度來講，目前公安機關(guān)dna辦案的難點就是如何用盡量少的檢材獲得更多正確的遺傳信息，在一些特殊案件(如：強奸、輪奸案)及親權(quán)鑒定(如：父女、姐妹親緣關(guān)系鑒定)案件中還要進(jìn)行y-str、x-str等遺傳標(biāo)記；另一方面隨著我國dna數(shù)據(jù)庫規(guī)模的不斷擴大，為有助于更清楚地判別檢索出來的匹配數(shù)據(jù)，迫切需要引入更多的str基因座。在打拐專項行動中，由于str基因座突變現(xiàn)象的存在，常常需要檢驗更多的str基因座才能作出更加明確的判定。因此，在同一復(fù)合擴增體系中整合更多地str基因座是目前主流的發(fā)展方向。此外，提高dna檢測試劑的抗抑制能力和系統(tǒng)的靈敏度、簡化操作步驟、縮短檢測時間，提高檢測效率也是對該體系的重要要求。目前我國自主研發(fā)的試劑盒仍以五色熒光為主，通過近年來研究，由于擴增目標(biāo)片段長度限制，每種顏色所能容納的基因座個數(shù)是有限，熒光種類是決定試劑盒可檢測基因座數(shù)目的重要因素之一，五色熒光成為制約我們提高試劑盒檢測效能的一大瓶頸。雖然某些進(jìn)口試劑盒已可檢測六色熒光，但其價格昂貴，而且由于不同地域、民族基因座多態(tài)性差異巨大，進(jìn)口試劑盒在很大程度上并不能滿足針對中國人群的str分型要求。如何開發(fā)針對中國人群的六色熒光str分型方法和系統(tǒng)，滿足案件分析要求，提高檢測效率成為有待解決的技術(shù)問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種六色熒光str分型方法，通過采用特定str基因座組合以及針對這些基因座設(shè)計的特定引物以及熒光標(biāo)記，能夠?qū)χ袊巳簜€體正常檢材和微量降解檢材進(jìn)行準(zhǔn)確高效分型，從而為進(jìn)行個體識別或親權(quán)鑒定等提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明還提供了一種六色熒光str分型系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)可以實現(xiàn)對針對25個基因座的準(zhǔn)確分型。本發(fā)明還提供了一種復(fù)合檢測體系，所述檢測體系能準(zhǔn)確獲得25個str基因座的基因型。本發(fā)明還提供了一種檢測試劑盒，包括所述的復(fù)合檢測體系。本發(fā)明提供的一種六色熒光str分型方法，包括：1)獲得個體dna；2)獲得所述個體dna包括24個常染色體str基因座和1個性別決定基因座amelogenin在內(nèi)共25個基因座的基因型，所述24個常染色體str基因座為d5s818,d21s11,d7s820,csf1po,d2s1338,d3s1358,vwa,d8s1179,d16s539,pentae,tpox,th01,d19s433,d18s51,fga,d6s1043,d13s317,d12s391,pentad,d2s441,d1s1656,d22s1045,d10s1248和d11s4463，包括采用與所述25個基因座一一對應(yīng)的擴增引物對其進(jìn)行擴增以獲得擴增產(chǎn)物的步驟，所述各基因座對應(yīng)的擴增引物的熒光標(biāo)記為：amelogenin，d5s818,d21s11,d7s820,csf1po和d2s1338的擴增引物的熒光標(biāo)記為fam；d3s1358,vwa,d8s1179,d16s539和pentae的擴增引物的熒光標(biāo)記為hex；tpox,th01,d19s433,d18s51和fga的擴增引物的熒光標(biāo)記為tamra；d6s1043,d13s317,d12s39和pentad的擴增引物的熒光標(biāo)記為rox；d2s441,d1s1656,d22s1045,d10s1248和d11s4463的擴增引物的熒光標(biāo)記為syp；3)根據(jù)所述25個基因座的基因型獲得所述個體的str分型結(jié)果。在本發(fā)明的方案中，所述25個基因座是申請人通過對大量中國人群的生存環(huán)境、種族起源等進(jìn)行綜合分析獲得的。針對上述基因座的引物也是申請人通過大量實驗獲得的，這些特定基因座的組合實現(xiàn)對正常檢材和微量降解檢材(如：接觸性dna，脫落細(xì)胞，腐敗檢材等)的dna分型。進(jìn)一步的，在本申請的方案中，“獲得個體dna”指的是提取該個體的例如血液、組織等樣本中的dna，或者直接獲得含有所述個體dna的血卡?！八鰝€體的str分型結(jié)果”指的是能用于對該進(jìn)行個體識別或親權(quán)鑒定的str分型結(jié)果。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述擴增引物為序列表中seqidno.1至seqidno.50的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個具體實施方式中，其中2)還包括在獲得擴增產(chǎn)物后，使用遺傳分析儀分析該擴增產(chǎn)物，以獲得所述25個基因座的基因型的步驟。在本發(fā)明的方案中，所述遺傳分析儀可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的遺傳分析儀，例如abi3130或abi3500型遺傳分析儀，通過id-x軟件或其他genemapper軟件等分析該pcr擴增產(chǎn)物中所述25個基因座的基因型。本發(fā)明提供的一種六色熒光str分型系統(tǒng)，包括dna獲取體系，復(fù)合檢測體系、推斷體系；所述dna獲取體系用于獲得個體dna；所述復(fù)合檢測體系用于獲得所述個體dna包括24個常染色體str基因座和1個性別決定基因座amelogenin在內(nèi)共25個基因座的基因型，所述24個常染色體str基因座為d1s1656,d2s1338,d2s441,d3s1358,d5s818,d6s1043,d7s820,d8s1179,d10s1248,d12s391,d13s317,d16s539,d18s51,d19s433,d21s11,d22s1045,csf1po,fga,pentad,pentae,th01,tpox,vwa和d11s4463，包括采用與所述25個基因座一一對應(yīng)的擴增引物對其進(jìn)行擴增以獲得擴增產(chǎn)物的步驟；所述各基因座對應(yīng)的擴增引物的熒光標(biāo)記為：amelogenin，d5s818,d21s11,d7s820,csf1po和d2s1338的擴增引物的熒光標(biāo)記為fam；d3s1358,vwa,d8s1179,d16s539和pentae的擴增引物的熒光標(biāo)記為hex；tpox,th01,d19s433,d18s51和fga的擴增引物的熒光標(biāo)記為tamra；d6s1043,d13s317,d12s39和pentad的擴增引物的熒光標(biāo)記為rox；d2s441,d1s1656,d22s1045,d10s1248和d11s4463的擴增引物的熒光標(biāo)記為syp；所述推斷體系用于根據(jù)所述個體的str分型結(jié)果對該進(jìn)行個體識別或親權(quán)鑒定。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述擴增引物為序列表中seqidno.1至seqidno.50的核苷酸序列。更進(jìn)一步的，所述復(fù)合檢測體系還用于在獲得擴增產(chǎn)物后，使用遺傳分析儀分析該擴增產(chǎn)物，以獲得所述25個基因座的基因型。更進(jìn)一步的，所述遺傳分析儀利用針對各基因座的等位基因的分型標(biāo)準(zhǔn)物來確定dna中各基因座的基因型。等位基因的分型標(biāo)準(zhǔn)物的制備可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)手段制備。本發(fā)明提供的一種復(fù)合檢測體系，所述體系包括個體dna，25個基因座，以及擴增引物，所述復(fù)合檢測體系用于獲得所述個體dna包括24個常染色體str基因座和1個性別決定基因座amelogenin在內(nèi)共25個基因座的基因型，所述24個常染色體str基因座為d1s1656,d2s1338,d2s441,d3s1358,d5s818,d6s1043,d7s820,d8s1179,d10s1248,d12s391,d13s317,d16s539,d18s51,d19s433,d21s11,d22s1045,csf1po,fga,pentad,pentae,th01,tpox,vwa和d11s4463，包括采用與所述25個基因座一一對應(yīng)的擴增引物對其進(jìn)行擴增以獲得擴增產(chǎn)物的步驟，所述擴增引物為序列表中seqidno.1至seqidno.50的核苷酸序列。進(jìn)一步的，所述體系中各基因座對應(yīng)的擴增引物的熒光標(biāo)記為：amelogenin，d5s818,d21s11,d7s820,csf1po和d2s1338的擴增引物的熒光標(biāo)記為fam；d3s1358,vwa,d8s1179,d16s539和pentae的擴增引物的熒光標(biāo)記為hex；tpox,th01,d19s433,d18s51和fga的擴增引物的熒光標(biāo)記為tamra；d6s1043,d13s317,d12s39和pentad的擴增引物的熒光標(biāo)記為rox；d2s441,d1s1656,d22s1045,d10s1248和d11s4463的擴增引物的熒光標(biāo)記為syp。在本發(fā)明的方案中，所述dna聚合酶可以是faststartdna聚合酶、taqdna聚合酶、hotstartdna聚合酶中的一種或多種。本發(fā)明還提供了一種檢測試劑盒，包括所述的復(fù)合檢測體系。在本發(fā)明的方案中，本發(fā)明利用所述復(fù)合檢測體系進(jìn)行25個基因座的分型的方法，包括：1)將獲取的dna作為模板；2)使用所述擴增引物對作為模板的dna進(jìn)行多重pcr擴增反應(yīng)以得到擴增產(chǎn)物；3)將所述擴增產(chǎn)物利用遺傳分析儀進(jìn)行分析，以獲得25個基因座的基因型。在本發(fā)明的方案中，所述25個基因座信息如表1所示：表1本發(fā)明提供的擴增引物序列如下。所述擴增引物及其相對應(yīng)的基因座如下表2所示，pcru代表上游引物，pcrl代表下游引物；表2本發(fā)明方案具有以下的優(yōu)點：1、本發(fā)明的6色熒光str分型方法和分型系統(tǒng)采用特定的str基因座組合以及引物序列，使得最終獲得的分型圖譜上各位點之間排布均勻，圖譜完整清晰；重復(fù)檢測結(jié)果無明顯差異；stutter峰面積比不超過10％，峰高比不超過15％，完全能夠滿足法醫(yī)str檢驗的要求。2、使用本發(fā)明的6色熒光str分型方法和分型系統(tǒng)能同時檢測特定的25個str位點，具有高的個體識別或親權(quán)鑒定能力。突破了5色熒光對復(fù)合擴增基因座數(shù)量的限制，使對dna檢測的使用更加高效，圖譜質(zhì)量更高，結(jié)果易于分析。3、本發(fā)明的方案可利用常規(guī)的遺傳分析儀，根據(jù)所要擴增的基因的分子量和熒光顏色的不同，獲得直觀的檢測結(jié)果，并且該結(jié)果與現(xiàn)有檢測系統(tǒng)相比，準(zhǔn)確性為100％。4、本發(fā)明的方案檢測靈敏度達(dá)到0.125ng，系統(tǒng)重復(fù)性好，分型準(zhǔn)確，并且可以適應(yīng)最新毛細(xì)管電泳檢測平臺的要求，具有的累計匹配概率(pm)為3.5434×10-28，累計個體識別力(tdp)為0.999999999999999999999999969863，累計非父排除概率(cep)為0.99999999375。附圖說明圖1顯示了使用本發(fā)明系統(tǒng)獲得的一個樣本的分型結(jié)果圖。圖2顯示了本發(fā)明方法和系統(tǒng)的靈敏度檢測結(jié)果。圖3顯示了本發(fā)明方法和系統(tǒng)的種屬特異性檢測結(jié)果。圖4顯示了本發(fā)明方法和系統(tǒng)的重復(fù)性檢測結(jié)果。具體實施方式以下實施例中使用的180份無關(guān)人員血卡(男性90份,女性90份)，由公安部物證鑒定中心提供。以下實施例中使用的方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用試劑耗材和儀器如下表3所示：表3tris-hcl美國sigma-aldrich公司edta美國sigma-aldrich公司mgcl2美國sigma-aldrich公司kcl美國sigma-aldrich公司dntp美國amresco公司nacl國藥集團化學(xué)試劑有限公司無水乙醇國藥集團化學(xué)試劑有限公司熱啟動taq酶瑞士roche公司typer500內(nèi)標(biāo)公安部物證鑒定中心去離子甲酰胺美國appliedbiosystems公司毛細(xì)管電泳緩沖液appliedbiosystems公司abi3500xl型遺傳分析儀appliedbiosystemsproflexpcr擴增儀appliedbiosystems實施例1、對本發(fā)明的對進(jìn)行str分型的方法和系統(tǒng)準(zhǔn)確性的驗證在本實施例中，所述為180份人血卡，已知其個體來源，但在本申請實施例1的實施過程中設(shè)定其個體來源未知，采用本申請方法和系統(tǒng)對其進(jìn)行str分型，包括：1)利用本發(fā)明的系統(tǒng)中的dna獲取體系獲得所述個體dna即所述180份人血卡，2)利用本發(fā)明的系統(tǒng)中的復(fù)合檢測體系獲得所述個體dna25個str基因座的基因型，并根據(jù)該基因型獲得該個體的str分型結(jié)果，3)利用本發(fā)明的系統(tǒng)中所述推斷體系，根據(jù)所述個體的str分型結(jié)果對該進(jìn)行個體識別或親權(quán)鑒定。本實施例中，所述復(fù)合檢測體系用于獲得所述個體dna包括24個常染色體str基因座和1個性別決定基因座amelogenin在內(nèi)共25個基因座的基因型，所述24個常染色體str基因座為d1s1656,d2s1338,d2s441,d3s1358,d5s818,d6s1043,d7s820,d8s1179,d10s1248,d12s391,d13s317,d16s539,d18s51,d19s433,d21s11,d22s1045,csf1po,fga,pentad,pentae,th01,tpox,vwa和d11s4463，包括采用與所述25個基因座一一對應(yīng)的擴增引物對其進(jìn)行擴增以獲得擴增產(chǎn)物的步驟，所述擴增引物為序列表中seqidno.1至seqidno.50的核苷酸序列；所述各基因座對應(yīng)的擴增引物的熒光標(biāo)記為：amelogenin，d5s818,d21s11,d7s820,csf1po和d2s1338的擴增引物的熒光標(biāo)記為fam；d3s1358,vwa,d8s1179,d16s539和pentae的擴增引物的熒光標(biāo)記為hex；tpox,th01,d19s433,d18s51和fga的擴增引物的熒光標(biāo)記為tamra；d6s1043,d13s317,d12s39和pentad的擴增引物的熒光標(biāo)記為rox；d2s441,d1s1656,d22s1045,d10s1248和d11s4463的擴增引物的熒光標(biāo)記為syp，在本發(fā)明方案中使用常規(guī)染色手段對上述擴增引物進(jìn)行染色。1、模板：180份人血卡。2、利用所述復(fù)合檢測體系對上述模板進(jìn)行25個基因座的分型，包括：使用所述擴增引物進(jìn)行多重pcr擴增，以獲得擴增產(chǎn)物；將擴增產(chǎn)物利用遺傳分析儀確定25個基因座的基因型。具體過程如下：2.1、引物池配置擴增引物池的配置，其中所述25個基因座一一對應(yīng)的25對擴增引物如上所述；本發(fā)明提供的各種引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成好的引物用1×te緩沖液稀釋到100μm，將25個基因座的上下游引物等比混合，得到濃度為50μm的引物。從25管pcr引物中分別取不同體積加入到一個新的離心管中，作為25重pcr引物池，在該引物池中，各str位點的引物的終濃度為0.1-0.3μm。2.2、多重pcr反應(yīng)本實施例使用proflexpcr擴增儀進(jìn)行多重pcr反應(yīng)。(1)配置pcr反應(yīng)混合物(pcrmix)(10μl體系)，如下表4所示。表4(2)擴增程序?qū)cr反應(yīng)混合物置于pcr儀上，調(diào)整循環(huán)程序如下表5進(jìn)行擴增，得到擴增產(chǎn)物：表52.3、pcr產(chǎn)物分型待分型樣品的準(zhǔn)備：1.電泳上樣混合物的準(zhǔn)備，按下面比例準(zhǔn)備由內(nèi)標(biāo)和去離子甲酰胺組成上樣混合物：10μltyper500內(nèi)標(biāo)+1000μl去離子甲酰胺，混合均勻。2.每管加入10μl上樣混合物、1μl擴增產(chǎn)物，混勻。3.95℃變性3分鐘，立即放在冰上冷卻3分鐘，之后電泳。利用abi3500xl型遺傳分析儀上進(jìn)行檢測。應(yīng)用abi3500xldatecollectionsoftware3.1收集數(shù)據(jù)，genemapperidxv1.4軟件對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，獲得所述25個基因座的基因型。2.4、結(jié)果分析使用本發(fā)明系統(tǒng)對180份dna樣品進(jìn)行分型的一個代表性分型結(jié)果如圖1所示，為了驗證分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，從180份dna樣品中隨機抽取100份dna樣品，對25個基因座進(jìn)行測序(北京邁奧德恩生物科技有限公司測序)，采用本實施例的復(fù)合檢測體系獲得的所述個體的所有分型結(jié)果與測序結(jié)果均一致，一致性達(dá)到100％，此結(jié)果證明本發(fā)明復(fù)合檢測體系分型結(jié)果準(zhǔn)確。3、根據(jù)未知來源個體dna的25個基因座的基因型對其進(jìn)行個體識別由本實施例方法獲得的上述180份樣品的個體來源結(jié)果，與其已知的個體來源結(jié)果一致，說明本發(fā)明方法可以對未知來源個體進(jìn)行個體識別。4、根據(jù)180份dna樣品所述25個基因座的基因型，獲得個體的str分型結(jié)果，并進(jìn)行親權(quán)鑒定。由本實施例方法獲得的上述180個個體的親權(quán)鑒定結(jié)果，與其已知的個體親權(quán)鑒定結(jié)果一致，說明本發(fā)明方法可以進(jìn)行的親權(quán)鑒定。實施例2本發(fā)明復(fù)合擴增體系靈敏度、種屬特異性、系統(tǒng)重復(fù)性、分型結(jié)果準(zhǔn)確性驗證一、靈敏度檢測當(dāng)9947標(biāo)準(zhǔn)dna模板量≥0.125ng，25個基因座的全部等位基因均可正確分型，見圖2。模板量<0.125ng，出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象。即本發(fā)明的系統(tǒng)能對低至0.125ng的dna進(jìn)行檢測。二、種屬特異性檢測復(fù)合擴增體系檢測動物(豬、狗、羊、兔和大腸桿菌)血液樣本，在分型區(qū)均未產(chǎn)生特異性峰型，見圖3。可以看出本發(fā)明的方法和系統(tǒng)具有良好的種屬特異性。三、系統(tǒng)重復(fù)性檢測采用2個批次的試劑對100份樣本(靜脈血，來自公安部物證鑒定中心)進(jìn)行檢測，結(jié)果穩(wěn)定、圖譜完整清晰；重復(fù)檢測結(jié)果無明顯差異；stutter峰面積比不超過10％，峰高比不超過15％。使用本發(fā)明所述體系分型與使用pluspcramplificationkit試劑盒分型在共有基因座上分型結(jié)果完全相同，說明本發(fā)明的方法和系統(tǒng)具有良好的系統(tǒng)重復(fù)性。進(jìn)一步的，將本發(fā)明pcr體系中pcr引物+反應(yīng)混合物和typer500內(nèi)標(biāo)反復(fù)凍融5、10、15、20次獲得的檢測結(jié)果之間沒有明顯變化，各基因座間擴增平衡性好，參見圖4(反復(fù)凍融20次結(jié)果)，可以看出本發(fā)明的方法和系統(tǒng)具有良好的系統(tǒng)重復(fù)性。四、各類案件檢材分型準(zhǔn)確性各類常見檢材如存放15年的血痕樣本、骨骼及唾液斑等樣本，經(jīng)本發(fā)明系統(tǒng)的25個str基因座復(fù)合擴增體系檢測均能得到準(zhǔn)確分型結(jié)果，峰型尖銳，擴增平衡性良好，且與dnatyper19tm、pluspcramplificationkit試劑盒在共有基因座上的分型結(jié)果完全相同。表724個str基因座在中國漢族人群中的遺傳學(xué)參數(shù)(n＝209)利用以上表格中的數(shù)據(jù)，根據(jù)以下公式獲得申請的累計匹配概率、累積個體識別率以及累計非父排除概率。pm(累計匹配概率)＝∑pi2pi群體中第i個表現(xiàn)型的頻率。tdp(累積個體識別率)＝1-(1-dp1)(1-dp2)(1-dp3)…(1-dpk),其中dpk為第k個基因座的dp值。cpe(累計非父排除概率)＝1-(1-pe1)(1-pe2)(1-pe3)…(1-pek),其中pek為第k個基因座的pe值。本發(fā)明的24個str基因座在中國漢族人群中具有的累計匹配概率(pm)為3.5434×10-28，累計個體識別力(tdp)為0.999999999999999999999999969863，累計非父排除概率(cep)為0.99999999375。序列表<110>公安部物證鑒定中心<120>一種六色熒光str分型方法和系統(tǒng)<130>168727gf<160>50<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>1cctgggctctgtaagaagt19<210>2<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>2ttaaactgggaagctg16<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>3ggtgattttcctctttggt19<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>4gattccaatcatagccaca19<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>5tatgtgagtcaattccccaa20<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>6gtattagtcaatgttctccag21<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>7gtcatagtttagaacgaactaacg24<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>8tgaggtatcaaaaactcagagg22<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>9ggaggtaaaggtgtcttaaag21<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>10ttcctgtgtcagaccctgtt20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>11ccagtggatttggaaacaga20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>12acctagcatggtacctgcag20<210>13<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>13ctgcagtccaatctggg17<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>14tgaaatcaacagaggcttgc20<210>15<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>15gtggatgataagaataatcagta23<210>16<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>16gatgataaatacataggatggat23<210>17<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>17ttgcaacttatatgtatttttgtatttc28<210>18<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>18ccaaattgtgttcatgagtatagtt25<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>19gatcccaagctcttcctctt20<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>20acgtttgtgtgtgcatctgt20<210>21<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>21taccaacatgaaagggtaccaa22<210>22<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>22ttattaattgagaaaactccttacaat27<210>23<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>23ctagcacccagaaccgt17<210>24<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>24ttgtcagcgtttatttg17<210>25<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>25ttccgagtgcaggtca16<210>26<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>26gctgccctagtcagc15<210>27<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>27ctgggcaacagaataagat19<210>28<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>28aggtttttaaggaacaggtgg21<210>29<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>29cttgagcccagaaggt16<210>30<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>30tctaccagcaacaacacaaata22<210>31<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>31cataggttttgaactc16<210>32<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>32ttgtctgtaattgccag17<210>33<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>33aaggatgggtggatcaat18<210>34<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>34tgtatgagccacttccca18<210>35<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>35cagaagtctgggatgtgg18<210>36<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>36cccaaaaagacagacag17<210>37<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>37acaggatcaatggatgcat19<210>38<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>38tggcttttagacctggact19<210>39<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>39aaggtcgaagctgaagt17<210>40<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>40tagaattctttaatctggaca21<210>41<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>41tgtggctcatctatgaaaact21<210>42<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>42gaagtggctgtggtgttatg20<210>43<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>43gtgttgctcaagggtca17<210>44<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>44aaatagaatcactagggaac20<210>45<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>45ttccccgatgatagtagt18<210>46<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>46gcgaatgtatgattggcaat20<210>47<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>47aatgaattgaacaaatgagtg21<210>48<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>48gcaactctggttgtattgtct21<210>49<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>49atcctattggaggccatca19<210>50<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>50gattgacctgtctgtccg18當(dāng)前第1頁12