本發(fā)明屬于有機制藥生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

甲氨蝶呤（4-氨基-10-甲基葉酸，mtx）是葉酸類似物，甲氨蝶呤于1988年開始用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（ra）。而甲氨蝶呤與阿達木單抗等生物制劑聯(lián)合用藥，可以更有效地緩解ra患者的疾病癥狀，減緩關(guān)節(jié)損傷的進展（x線顯示），并且可以改善身體功能。與傳統(tǒng)藥物相比，阿達木單抗等生物制劑的療效強且持久，且耐受性良好。

阿侖膦酸鈉（簡稱：aln）1995年在美國以fosamax的名稱上市，用于治療骨質(zhì)疏松癥和變形性骨炎，1997年5月fda再次批準(zhǔn)其預(yù)防骨質(zhì)疏松和預(yù)防骨折的擴大適應(yīng)癥，成為第一個被fda批準(zhǔn)用于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的非激素類藥物，阿侖膦酸鈉對骨的增重作用類似于雌激素，優(yōu)于降鈣素，能顯著增加骨密度，降低骨折發(fā)生率，口服有效，作用持久，具有良好的耐受性和較高的安全性。

中國專利文獻cn104371009a提供了一種gnrh多肽-甲氨蝶呤偶聯(lián)物的制備方法，在gnrh多肽或其類似物含有d-lys單元中的氨基的情況下，通過使甲氨蝶呤活性酯與gnrh多肽或其類似物的d-lys上的氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)制備。該發(fā)明提供一種含有甲氨蝶呤的藥物組合物，增加藥物的靶向性，但是，這些現(xiàn)有技術(shù)存在原料成本高，工藝制作復(fù)雜，操作要求繁瑣等問題，因而無法大規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種便于工業(yè)化生產(chǎn)的甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯(lián)物的制備方法。

本發(fā)明包括以下步驟：

1）將甲氨蝶呤與氯化亞砜混合加熱，進行第一次回流反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，蒸出過量的氯化亞砜，得甲氨蝶呤的酰氯化產(chǎn)物；

2）在二氯甲烷存在下，將所述甲氨蝶呤的酰氯化產(chǎn)物與阿侖膦酸鈉混和加熱，進行第二次回流反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，蒸出二氯甲烷，即得納米級甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯(lián)物。

通過以上步驟1），甲氨蝶呤分子上的羧基被氯化亞砜取代為酰氯，進而與步驟2）中阿侖膦酸鈉分子上的氨基形成目標(biāo)分子酰胺。

通過本發(fā)明以上方法，制得的甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯(lián)物為納米級，這種偶聯(lián)物可以獲得一種新型骨科靶向藥物，使得藥物能夠向骨科病炤部位富集，從而達到更好的治療效果。

進一步地，本發(fā)明所述甲氨蝶呤與氯化亞砜的投料摩爾比為1∶2～4。過量的氯化亞砜有利于將甲氨蝶呤上的羧基酰化地更徹底。

所述甲氨蝶呤與阿侖膦酸鈉的投料摩爾比為1∶1。該投料比節(jié)約原料，可控制甲氨蝶呤與阿侖膦酸鈉按1∶1的比例耦合。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的反應(yīng)式。

圖2為甲氨蝶呤、阿倫磷酸鈉和制成的偶聯(lián)物的紅外表征對比圖譜。

圖3為甲氨蝶呤、阿倫磷酸鈉和制成的偶聯(lián)物的uv-vis對比圖譜。

圖4為甲氨蝶呤的核磁共振氫譜。

圖5為阿倫磷酸鈉的核磁共振氫譜。

圖6為甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯(lián)物的核磁共振氫譜。

圖7為通過trap染色，純水（0毫摩爾每升甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽的耦合物）對于破骨細胞分化的抑制作用的效果圖。

圖8為通過trap染色，0.2毫摩爾每升甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽的耦合物對于破骨細胞分化的抑制作用的效果圖。

圖9為通過trap染色，0.4毫摩爾每升甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽的耦合物對于破骨細胞分化的抑制作用的效果圖。

圖10為通過trap染色，0.8毫摩爾每升甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽的耦合物對于破骨細胞分化的抑制作用的效果圖。

圖11為甲氨蝶呤-阿侖膦酸鹽偶聯(lián)物在二型膠原誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型中，通過影像學(xué)microct的方法展示對腳部關(guān)節(jié)的骨質(zhì)破壞及骨質(zhì)溶解的治療作用效果圖。

圖12為甲氨蝶呤-阿侖膦酸鹽偶聯(lián)物在二型膠原誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型中，通過組織學(xué)trap染色的方法展示對腳部關(guān)節(jié)的骨質(zhì)破壞及骨質(zhì)溶解的治療作用效果圖。

具體實施方式

一、制備工藝：

例1：

取甲氨蝶呤3.41g與氯化亞砜1.785g于圓底燒瓶中，加熱至70℃進行回流反應(yīng)4小時。反應(yīng)結(jié)束后，改回流裝置為減壓蒸餾裝置，蒸出過量的氯化亞砜，取得3.52g甲氨蝶呤的酰氯化產(chǎn)物。

以50ml二氯甲烷作為溶劑，將3.52g甲氨蝶呤的酰氯化產(chǎn)物與甲氨蝶呤等摩爾量的阿侖膦酸鈉2.44g混合，加熱至70℃進行回流反應(yīng)4小時。反應(yīng)結(jié)束后，再次改回流裝置為減壓蒸餾裝置，蒸出二氯甲烷，即得5.09g目標(biāo)產(chǎn)物。

圖5為甲氨蝶呤的核磁共振氫譜。圖6為阿倫磷酸鈉的核磁共振氫譜。圖7為甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯(lián)物的核磁共振氫譜。

可以看出在樣品在2.89和1.87ppm出現(xiàn)信號，證明阿倫磷酸鈉修飾了甲氨蝶呤。

例2：

取甲氨蝶呤0.682g與氯化亞砜0.357g于圓底燒瓶中，加熱至70℃進行回流反應(yīng)4小時。反應(yīng)結(jié)束后，改回流裝置為減壓蒸餾裝置，蒸出過量的氯化亞砜，取得0.697g甲氨蝶呤的酰氯化產(chǎn)物。

以20ml二氯甲烷作為溶劑，將0.697g甲氨蝶呤的酰氯化產(chǎn)物與甲氨蝶呤等摩爾量的阿侖膦酸鈉0.488g混合，加熱至70℃進行回流反應(yīng)4小時。反應(yīng)結(jié)束后，再次改回流裝置為減壓蒸餾裝置，蒸出二氯甲烷，即得0.988g目標(biāo)產(chǎn)物。

以上兩例的反應(yīng)過程如圖1所示。

二、產(chǎn)物驗證：

1、圖2為例1方法所得樣品與甲氨蝶呤和阿倫磷酸鈉純樣對比的紅外表征圖譜。其中曲線a為甲氨蝶呤（mtx）的紅外表征圖譜；曲線b（aln）為阿倫磷酸鈉的紅外表征圖譜；曲線c為例1制得的目標(biāo)產(chǎn)物的紅外表征圖譜。

由圖2的曲線c可以發(fā)現(xiàn)：在1569和1724cm^-1處發(fā)現(xiàn)酰胺-nh彎曲，從而推斷出：例1所得的目標(biāo)產(chǎn)物中甲氨蝶呤確實連接上了阿倫磷酸鈉，例1得到了甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯(lián)物。

2、圖3為例2方法所得樣品與甲氨蝶呤和阿倫磷酸鈉純樣對比的uv-vis表征結(jié)果，其中曲線a為甲氨蝶呤（mtx）的uv-vis表征圖；曲線b（aln）為阿倫磷酸鈉的uv-vis表征圖；曲線c為例1制得的目標(biāo)產(chǎn)物的uv-vis表征圖。

由圖3可見：阿倫磷酸鈉純樣沒有出現(xiàn)信號，而實施方案2所得樣品出現(xiàn)了甲氨蝶呤的特征峰，可以推斷出甲氨蝶呤確實偶聯(lián)上了阿倫磷酸鈉。

3、由圖4的甲氨蝶呤的核磁共振氫譜可見：化學(xué)位移7～9ppm左右的峰為芳環(huán)的特征峰，為原料甲氨蝶呤獨有。

4、由圖5的阿倫磷酸鈉的核磁共振氫譜可見：化學(xué)位移4.9ppm左右是磷酸的氫的出峰位置，為原料阿侖膦酸鈉獨有。

5、由圖6的以上兩例制成的目標(biāo)產(chǎn)物——甲氨蝶呤與阿倫磷酸鈉偶聯(lián)物的核磁共振氫譜可見：目標(biāo)產(chǎn)物在4.9ppm、7.8ppm和8.4ppm出現(xiàn)信號，證明阿倫磷酸鈉修飾了甲氨蝶呤。

6、在體外，將甲氨蝶呤、阿侖膦酸鹽和本發(fā)明制成的目標(biāo)產(chǎn)物分別對骨髓來源巨噬細胞向破骨細胞分化進行抑制試驗，通過trap染色，試驗驗證了甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽的耦合物相比甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽單獨使用時的抑制結(jié)果。

本發(fā)明制成的目標(biāo)產(chǎn)物對骨髓來源巨噬細胞向破骨細胞分化進行抑制試驗結(jié)果如圖7至10所示，由圖7至10可以看出：本發(fā)明制成的耦合物對于破骨細胞分化的抑制作用更加明顯，且濃度更低，達到了良好的低劑量藥物抑制破骨細胞分化的效益。

7、通過影像學(xué)microct和組織學(xué)trap染色的方法，將本發(fā)明制成的目標(biāo)產(chǎn)物作用于大鼠的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型中進行試驗。

結(jié)果見圖11、12，圖11和圖12顯示了是在大鼠的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型中，甲氨蝶呤和阿侖膦酸鹽的兩者的耦合的藥效應(yīng)當(dāng)是強于單獨使用兩者其中之一，并且耦合物在使用時，可以降低藥物的使用劑量。