本發(fā)明涉及一種治療犬腹瀉的灌腸液及其制備方法，具體的，涉及一種磷酸化川牛膝多糖、其灌腸液及其制備方法，屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：犬細(xì)小病毒(canineparvovirus，cpv)是一種烈性傳染性病毒，以劇烈嘔吐、腹瀉、出血性腸炎及化膿性心肌炎為主要特征的犬細(xì)小病毒病(canineparvovirusinfection)的病原(顏文卿等，2006)。犬細(xì)小病毒在我國廣泛流行，犬細(xì)小病毒病的主要自然宿主是犬，對(duì)不同年齡、性別的犬均有易感性，尤其以幼犬的易感性為最高，其中又以斷奶前后的幼犬最為易感，另外狐、貂等犬科動(dòng)物也是本病的主要傳染源。犬的嘔吐物、唾液和糞便均帶毒，患病犬或隱性感染的帶毒犬與健康犬可接觸感染，或者經(jīng)污染的飼料、飲水、食具與墊料通過消化道感染。犬細(xì)小病毒病的潛伏期根據(jù)動(dòng)物機(jī)體的自身免疫力和病毒感染劑量的不同而不同，一般為7～14天，cpv侵入機(jī)體后的初始2天，機(jī)體不表現(xiàn)臨床癥狀，而5～7天后表現(xiàn)病毒血癥。臨床上，單純的cpv感染癥狀較輕，而cpv與細(xì)菌的混合感染，及其引發(fā)的繼發(fā)感染的臨床癥狀則明顯很多，共有3種臨床癥狀，即腸炎型、心肌炎型和慢性型。以腸炎綜合征和心肌炎綜合征為主，同一只患病動(dòng)物一般僅表現(xiàn)為一種典型癥狀，同時(shí)有兩種癥狀的患病動(dòng)物比較少見。腸炎型多發(fā)生于2～4月齡的幼齡犬，潛伏期1～2周，主要是3～6月齡的幼犬發(fā)病。心肌炎型又稱急性型，多見于缺乏母源抗體的4～6周齡的幼犬。常表現(xiàn)為突然發(fā)病、可視黏膜蒼白、衰弱，呼吸困難、心力衰竭，也可見輕度嘔吐和腹瀉。聽診時(shí)心跳有雜音、心率不齊、肌肉震顫。發(fā)病較急，病程一般不超過24小時(shí)，患病動(dòng)物表現(xiàn)急性心力衰竭，常因來不及診斷和治療就死亡，致死率為60％～100％。慢性型主見于成犬、家養(yǎng)犬或已注射cpv疫苗的寵物，患病寵物主要表現(xiàn)為精神抑郁、食欲銳減甚至廢絕，頻繁地嘔吐與腹瀉。犬細(xì)小病毒會(huì)感染腸道上皮細(xì)胞，導(dǎo)致大量腸粘膜破壞，脫落，腸道大面積的炎癥、出血。大多數(shù)病犬死于犬細(xì)小病毒引起的重劇腸炎。目前對(duì)犬細(xì)小病毒性腸炎的控制主要是通過全身用藥的方式，主要通過注射抗病毒制劑，例如病毒唑，病毒靈等西藥制劑，這些制劑在腸道中的濃度低，對(duì)腸道中存在的活病毒的直接殺滅作用較弱。因此，導(dǎo)致抗病毒作用較弱。目前臨床上沒有能夠直接殺滅犬細(xì)小病毒發(fā)揮在腸道局部抗病毒作用的灌腸液——磷酸化川牛膝多糖灌腸液。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提供一種能夠抗犬細(xì)小病毒作用的磷酸化川牛膝多糖、其灌腸液及其制作方法，制備的灌腸液能夠發(fā)揮顯著的抗犬細(xì)小病毒作用。本申請為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，采用如下的技術(shù)方案：一種磷酸化川牛膝多糖，分子量為171～182kd，磷酸根枝接量為8.27～9.76。磷酸化川牛膝多糖在制備治療犬腹瀉藥物中的應(yīng)用，將其制成注射液、灌腸液等劑型，作為治療犬腹瀉的藥物。一種磷酸化川牛膝多糖灌腸液，包含2％～6％質(zhì)量濃度的磷酸化川牛膝多糖。進(jìn)一步的，一種磷酸化川牛膝多糖灌腸液，還包括質(zhì)量濃度0.7～2.1％的氯化鈉，質(zhì)量濃度為0.1％～0.3％的酸堿度緩沖液。進(jìn)一步的，一種磷酸化川牛膝多糖灌腸液，酸堿度緩沖溶液為包括2～4g/l碳酸氫鈉、0.31～0.62g/l硫酸鎂、0.48～0.48g/l氯化鉀、0.77～1.54g/l乳酸鈣及15～30g/l的葡萄糖的水溶液。進(jìn)一步的，一種磷酸化川牛膝多糖灌腸液，酸磷酸化川牛膝多糖灌腸液的ph值為7.0～7.5。一種磷酸化川牛膝多糖及其灌腸液的制備方法，包括以下步驟：步驟一，提取川牛膝多糖：步驟1.1、取川牛膝100g，碾碎，加入1.0～1.5l蒸餾水煮2～3h，過濾并收集濾液；步驟1.2、將步驟1.1中得到的濾液在60℃下，濃縮至100ml，得到川牛膝多糖提取液；步驟1.3、在步驟1.2中得到的川牛膝多糖提取液中加入川牛膝多糖提取液1/6～1/3體積的三氯甲烷、1/18～1/16體積的正丁醇，震蕩3～5min，在2000r/min條件下離心10～15min，重復(fù)3～5次，得到離心物；步驟1.4、將步驟1.3中的離心物中加入6～8倍的無水乙醇醇沉，于4℃下靜置12～24h，用丙酮、無水乙醇洗滌得到沉淀物，將沉淀物置于冷凍干燥機(jī)中，于-70℃條件下，冷凍干燥48h，得到川牛膝多糖。步驟二、制備磷酸化川牛膝多糖：步驟2.1、取步驟1.4得到的川牛膝多糖1g，加入5～8％體積百分含量的hno3溶液及100ml蒸餾水，加熱至70℃，然后分別加入0.8～1.2g的na2po3和1.44～2.16g的bacl2，70℃下靜置加熱6～8h，然后取出冷卻至室溫，過濾，濾液用無水碳酸鈉調(diào)節(jié)ph值至6-7；步驟2.2、在步驟2.1調(diào)節(jié)ph值后的濾液中，加入1.4～4.2g無水硫酸鈉，振蕩1～2min，在2000r/min離心，離心時(shí)間10～15min，得到離心物；步驟2.3、將步驟2.2得到的離心物在50℃下復(fù)溶，選用截留相對(duì)分子質(zhì)量為14000da的透析袋，將復(fù)溶后的離心物溶液裝入透析袋中，以蒸餾水為透析液透析48h，測定透析前后電導(dǎo)率的變化，當(dāng)電導(dǎo)率下降至160μs/cm時(shí)，停止透析，得到透析物；步驟2.4、將步驟2.3得到的透析物置于真空冷凍干燥機(jī)中，于-70℃條件下冷凍干燥48h，得磷酸化川牛膝多糖。一種磷酸化川牛膝多糖灌腸液的制備方法，按照上述方法制備磷酸化川牛膝多糖后，還包括以下的步驟：步驟三、制備磷酸化川牛膝多糖灌腸液：將2～6g步驟2.4制備成功的磷酸化川牛膝多糖，0.7～2.1g氯化鈉，0.1～0.3g酸堿度緩沖溶液，溶于水中，加水至總重為100g，得到磷酸化川牛膝多糖灌腸液；所述酸堿度緩沖溶液包括2～4g碳酸氫鈉，0.31～0.62g/l硫酸鎂，0.48～0.48g/l氯化鉀，0.77～1.54g/l乳酸鈣和15～30g/l的葡萄糖。本發(fā)明采用上述技術(shù)方案取得如下技術(shù)效果。本發(fā)明的磷酸化川牛膝多糖，在體外能夠顯著抑制犬細(xì)胞病毒感染細(xì)胞的能力，具有很好的抗病毒作用。本發(fā)明的磷酸化川牛膝多糖灌腸液，可以有效預(yù)防犬感染犬細(xì)小病毒，對(duì)幼犬感染犬細(xì)小病毒具有很好的治療作用，可有效的提高感染細(xì)小病毒犬的生存率。本發(fā)明的磷酸化川牛膝多糖灌腸液，天冷時(shí)可將溶液加溫至30～37℃后應(yīng)用，不影響其藥效，天冷用藥時(shí)，可以使用藥犬更為舒適。附圖說明圖1是本發(fā)明具體實(shí)施例1的川牛膝多糖和磷酸化川牛膝多糖的紅外光譜圖。其中a為川牛膝多糖的紅外光譜，b為磷酸化川牛膝多糖的紅外光譜。具體實(shí)施方式為了使本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明方案，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例1至4對(duì)一種磷酸化川牛膝多糖及其灌腸液的制備方法進(jìn)行了具體的描述。實(shí)施例1一種磷酸化川牛膝多糖及其灌腸液的制備方法，具體步驟如下。步驟一，提取川牛膝多糖。步驟1.1、取川牛膝100g，研磨碾碎，加入1.0l蒸餾水煮2h，過濾并收集濾液。步驟1.2、將步驟1.1中得到的濾液放入燒杯中，置于60℃水浴鍋中，濃縮至100ml，得到川牛膝多糖提取液。步驟1.3、在步驟1.2中得到的川牛膝多糖提取液中加入川牛膝多糖提取液1/6體積的三氯甲烷及1/18體積的正丁醇，震蕩3min，在2000r/min條件下離心10min，如此重復(fù)3次，得到離心物。步驟1.4、將步驟1.3中的離心物中，加入6倍的無水乙醇醇沉，于4℃靜置12小時(shí)。所得沉淀，先用丙酮洗滌一遍，再用無水乙醇洗滌一遍，連續(xù)反復(fù)洗滌2次。然后將沉淀物置于冷凍干燥機(jī)中，于-70℃條件下，冷凍干燥48h，得到川牛膝多糖。通過硫酸苯酚法檢測其多糖含量為96.6％。步驟二、制備磷酸化川牛膝多糖步驟2.1、取步驟1.4得到的川牛膝多糖1g，加入5％體積濃度的的hno3及100ml蒸餾水，水浴加熱至70℃，然后分別加入0.8g的na2po3和1.44g的bacl2，繼續(xù)在水浴鍋中，70℃下靜置加熱8h，然后取出冷卻至室溫，過濾，將濾液用無水碳酸鈉調(diào)節(jié)ph值6。步驟2.2、在步驟2.1調(diào)節(jié)ph值后的濾液中，加入1.4g無水硫酸鈉，振蕩1min，在2000r/min離心，離心時(shí)間10min，得到離心物。步驟2.3、將步驟2.2中獲得的離心物干燥后，溶于50℃水浴中復(fù)溶，選用截留相對(duì)分子質(zhì)量為14000da的透析袋，將復(fù)溶后的離心物溶液裝入透析袋中，以蒸餾水為透析液透析48小時(shí)，測定透析袋中溶液前后電導(dǎo)率的變化，當(dāng)電導(dǎo)率下降至160μs/cm時(shí)，停止透析。步驟2.4、將步驟2.3的透析后的透析袋中的溶液置于真空冷凍干燥機(jī)中于于-70℃條件下，冷凍干燥48h，得到磷酸化川牛膝多糖。參見圖1，圖中a為川牛膝多糖的紅外光譜圖，b為磷酸化川牛膝多糖的紅外光譜圖，經(jīng)紅外光譜檢測，磷酸化川牛膝多糖與川牛膝多糖的紅外光譜圖有很多特征性改變，與川牛膝多糖的紅外光譜圖相比，磷酸化川牛膝多糖紅外光譜顯示兩個(gè)特征吸收峰，在1000至800cm-1的區(qū)域，顯示有一個(gè)對(duì)稱的c-o-p伸縮振動(dòng)峰，對(duì)應(yīng)c-o-po3集團(tuán)。另外在1300到1200cm-1區(qū)域，出現(xiàn)一個(gè)不對(duì)稱的p＝o伸縮振動(dòng)，表明磷酸化川牛膝多糖合成成功。經(jīng)檢測獲得的磷酸化川牛膝多糖分子量為171kd，磷酸根枝接量為8.27.步驟三、制備磷酸化川牛膝多糖灌腸液將2g步驟2.4制備成功的磷酸化川牛膝多糖，0.7g氯化鈉，0.1g酸堿度緩沖溶液，溶于水中，加水至總重為100g，得到磷酸化川牛膝多糖灌腸液。灌腸液的ph值為7.0～7.5。酸堿度緩沖溶液中，每100ml中含有碳酸氫鈉0.2～0.4g，硫酸鎂0.031～0.062g，氯化鉀0.048～0.048g，乳酸鈣0.077～0.154g，葡萄糖1.5～3.0g。此緩沖液可以調(diào)節(jié)緩沖灌腸液的ph值，吸收后有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)電解質(zhì)平衡。實(shí)施例2一種磷酸化川牛膝多糖及其灌腸液的制備方法，具體步驟如下。步驟一，提取川牛膝多糖。步驟1.1、取川牛膝100g，研磨碾碎，加入1.5l蒸餾水煮3h，過濾并收集濾液。步驟1.2、將步驟1.1中得到的濾液放入燒杯中，置于60℃水浴鍋中，濃縮至100ml，得到川牛膝多糖提取液。步驟1.3、在步驟1.2中得到的川牛膝多糖提取液中加入川牛膝多糖提取液1/3體積的三氯甲烷及1/17體積的正丁醇，震蕩4min，在2000r/min條件下離心12min，如此重復(fù)4次，得到離心物。步驟1.4、將步驟1.3中的離心物中，加入10倍的無水乙醇醇沉，于4℃靜置24小時(shí)。所得沉淀，先用丙酮洗滌一遍，再用無水乙醇洗滌一遍，連續(xù)反復(fù)洗滌3次。然后將沉淀物置于冷凍干燥機(jī)中，于-70℃條件下，冷凍干燥48h，得到川牛膝多糖。通過硫酸苯酚法檢測其多糖含量為96.6％。步驟二、制備磷酸化川牛膝多糖步驟2.1、取步驟1.4得到的川牛膝多糖1g，加入8％體積濃度的hno3及100ml蒸餾水，水浴加熱至70℃，然后分別加入1.2g的na2po3和2.16g的bacl2，繼續(xù)在水浴鍋中，70℃下靜置加熱7h，然后取出冷卻至室溫，過濾，將濾液用無水碳酸鈉調(diào)節(jié)ph值7。步驟2.2、在步驟2.1調(diào)節(jié)ph值后的濾液中，加入4.2g無水硫酸鈉，振蕩2min，在2000r/min離心，離心時(shí)間12min，得到離心物。步驟2.3、將步驟2.2中獲得的離心物干燥后，溶于50℃水浴中復(fù)溶，選用截留相對(duì)分子質(zhì)量為14000da的透析袋，將復(fù)溶后的離心物溶液裝入透析袋中，以蒸餾水為透析液透析72小時(shí)，測定透析袋中溶液前后電導(dǎo)率的變化，當(dāng)電導(dǎo)率下降至160μs/cm時(shí)，停止透析。步驟2.4、將步驟2.3的透析后的透析袋中的溶液置于真空冷凍干燥機(jī)中于于-70℃條件下，冷凍干燥48h，得到磷酸化川牛膝多糖。所得磷酸化川牛膝多糖的分子量為179kd，磷酸根枝接量為9.21。步驟三、制備磷酸化川牛膝多糖灌腸液將6g步驟2.4制備成功的磷酸化川牛膝多糖，2.1g氯化鈉，0.3g酸堿度緩沖溶液，溶于水中，加水至總重為100g，得到磷酸化川牛膝多糖灌腸液。灌腸液的ph值為7.5。酸堿度緩沖溶液中，每100ml中含有碳酸氫鈉0.2～0.4g，硫酸鎂0.031～0.062g，氯化鉀0.048～0.048g，乳酸鈣0.077～0.154g，葡萄糖1.5～3.0g，調(diào)節(jié)灌腸液的ph值，吸收后調(diào)節(jié)體內(nèi)電解質(zhì)平衡。此緩沖液可以調(diào)節(jié)緩沖灌腸液的ph值，吸收后有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)電解質(zhì)平衡。實(shí)施例3一種磷酸化川牛膝多糖及其灌腸液的制備方法，具體步驟如下。步驟一，提取川牛膝多糖。步驟1.1、取川牛膝100g，研磨碾碎，加入1.2l蒸餾水煮2h，過濾并收集濾液。步驟1.2、將步驟1.1中得到的濾液放入燒杯中，置于60℃水浴鍋中，濃縮至100ml，得到川牛膝多糖提取液。步驟1.3、在步驟1.2中得到的川牛膝多糖提取液中加入川牛膝多糖提取液1/4體積的三氯甲烷及1/16體積的正丁醇，震蕩5min，在2000r/min條件下離心15min，如此重復(fù)5次，得到離心物。步驟1.4、將步驟1.3中的離心物中，加入8倍的無水乙醇醇沉，于4℃靜置48小時(shí)。所得沉淀，先用丙酮洗滌一遍，再用無水乙醇洗滌一遍，連續(xù)反復(fù)洗滌2次。然后將沉淀物置于冷凍干燥機(jī)中，于-70℃條件下，冷凍干燥48h，得到川牛膝多糖。通過硫酸苯酚法檢測其多糖含量為96.6％。步驟二、制備磷酸化川牛膝多糖步驟2.1、取步驟1.4得到的川牛膝多糖1g，加入6％體積濃度的hno3及100ml蒸餾水，水浴加熱至70℃，然后分別加入1.0g的na2po3和1.8g的bacl2，繼續(xù)在水浴鍋中，70℃下靜置加熱6h，然后取出冷卻至室溫，過濾，將濾液用無水碳酸鈉調(diào)節(jié)ph值6.5。步驟2.2、在步驟2.1調(diào)節(jié)ph值后的濾液中，加入2.8g無水硫酸鈉，振蕩1min，在2000r/min離心，離心時(shí)間15min，得到離心物。步驟2.3、將步驟2.2中獲得的離心物干燥后，溶于50℃水浴中復(fù)溶，選用截留相對(duì)分子質(zhì)量為14000da的透析袋，將復(fù)溶后的離心物溶液裝入透析袋中，以蒸餾水為透析液透析60小時(shí)，測定透析袋中溶液前后電導(dǎo)率的變化，當(dāng)電導(dǎo)率下降至160μs/cm時(shí)，停止透析。步驟2.4、將步驟2.3的透析后的透析袋中的溶液置于真空冷凍干燥機(jī)中于于-70℃條件下，冷凍干燥48h，得到磷酸化川牛膝多糖。所獲得磷酸化川牛膝多糖的分子量為182kd，磷酸根枝接量為9.76。步驟三、制備磷酸化川牛膝多糖灌腸液將4g步驟2.4制備成功的磷酸化川牛膝多糖，1.4g氯化鈉，0.2g酸堿度緩沖溶液，溶于水中，加水至總重為100g，得到磷酸化川牛膝多糖灌腸液。灌腸液的ph值為7.0。酸堿度緩沖溶液中，每100ml中含有碳酸氫鈉0.2～0.4g，硫酸鎂0.031～0.062g，氯化鉀0.048～0.048g，乳酸鈣0.077～0.154g，葡萄糖1.5～3.0g，調(diào)節(jié)灌腸液的ph值，吸收后調(diào)節(jié)體內(nèi)電解質(zhì)平衡。此緩沖液可以調(diào)節(jié)緩沖灌腸液的ph值，吸收后有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)電解質(zhì)平衡。實(shí)施例4一種磷酸化川牛膝多糖及其灌腸液的制備方法，具體步驟如下。步驟一，提取川牛膝多糖。步驟1.1、取川牛膝100g，研磨碾碎，加入1.2l蒸餾水煮2h，過濾并收集濾液。步驟1.2、將步驟1.1中得到的濾液放入燒杯中，置于60℃水浴鍋中，濃縮至100ml，得到川牛膝多糖提取液。步驟1.3、在步驟1.2中得到的川牛膝多糖提取液中加入川牛膝多糖提取液1/4體積的三氯甲烷及1/16體積的正丁醇，震蕩5min，在2000r/min條件下離心15min，如此重復(fù)5次，得到離心物。步驟1.4、將步驟1.3中的離心物中，加入6倍的無水乙醇醇沉，于4℃靜置24小時(shí)。所得沉淀，先用丙酮洗滌一遍，再用無水乙醇洗滌一遍，連續(xù)反復(fù)洗滌3次。然后將沉淀物置于冷凍干燥機(jī)中，于-70℃條件下，冷凍干燥48h，得到川牛膝多糖。通過硫酸苯酚法檢測其多糖含量為96.6％。步驟二、制備磷酸化川牛膝多糖步驟2.1、取步驟1.4得到的川牛膝多糖1g，加入5％體積濃度的的hno3及100ml蒸餾水，水浴加熱至70℃，然后分別加入0.8g的na2po3和1.44g的bacl2，繼續(xù)在水浴鍋中，70℃下靜置加熱6h，然后取出冷卻至室溫，過濾，將濾液用無水碳酸鈉調(diào)節(jié)ph值6。步驟2.2、在步驟2.1調(diào)節(jié)ph值后的濾液中，加入1.4g無水硫酸鈉，振蕩1min，在2000r/min離心，離心時(shí)間15min，得到離心物。步驟2.3、將步驟2.2中獲得的離心物干燥后，溶于50℃水浴中復(fù)溶，選用截留相對(duì)分子質(zhì)量為14000da的透析袋，將復(fù)溶后的離心物溶液裝入透析袋中，以蒸餾水為透析液透析48小時(shí)，測定透析袋中溶液前后電導(dǎo)率的變化，當(dāng)電導(dǎo)率下降至160μs/cm時(shí)，停止透析。步驟2.4、將步驟2.3的透析后的透析袋中的溶液置于真空冷凍干燥機(jī)中于于-70℃條件下，冷凍干燥24h，得到磷酸化川牛膝多糖。步驟三、制備磷酸化川牛膝多糖灌腸液將2g步驟2.4制備成功的磷酸化川牛膝多糖，0.7g氯化鈉，0.1g酸堿度緩沖溶液，溶于水中，加水至總重為100g，得到磷酸化川牛膝多糖灌腸液。灌腸液的ph值為7.0～7.5。酸堿度緩沖溶液中，每100ml中含有碳酸氫鈉0.2～0.4g，硫酸鎂0.031～0.062g，氯化鉀0.048～0.048g，乳酸鈣0.077～0.154g，葡萄糖1.5～3.0g。此緩沖液可以調(diào)節(jié)緩沖灌腸液的ph值，吸收后有助于調(diào)節(jié)體內(nèi)電解質(zhì)平衡。實(shí)施例1至實(shí)施例4制備的磷酸化川牛膝多糖該灌腸液，天冷時(shí)可將溶液加溫至30～37℃后應(yīng)用，不影響其藥效。試驗(yàn)例一、磷酸化川牛膝多糖體外抗病毒試驗(yàn)本試驗(yàn)為磷酸化川牛膝多糖體外抗病毒試驗(yàn)。設(shè)病毒對(duì)照組(只加病毒)、細(xì)胞對(duì)照組(只加維持液)和無細(xì)胞的空白調(diào)零孔，以實(shí)施例1得到的磷酸化川牛膝多糖，按照磷酸化川牛膝多糖的最大無毒濃度15.625(μg/ml)為起始濃度的磷酸化川牛膝多糖藥液，將其2倍稀釋5個(gè)濃度(見表1)，每種濃度的磷酸化川牛膝多糖藥液重復(fù)4孔按以下3種方式加藥。1、先加磷酸化川牛膝多糖藥液再接種病毒：先將不同濃度含磷酸化川牛膝多糖藥液培養(yǎng)液接入已長滿單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每濃度4孔，每孔100μl，37℃孵育2h后，棄藥液，再接入100tcid50病毒液每孔100μl，37℃孵育2h。2、磷酸化川牛膝多糖藥液和病毒混合作用后加入細(xì)胞：先將不同濃度含磷酸化川牛膝多糖藥液培養(yǎng)液與100tcid50病毒液37℃作用2h后，再將混合液接入已長成單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每濃度4孔，每孔100μl，37℃孵育2h。3、先加病毒再加磷酸化川牛膝多糖藥液：先將100tcid50病毒液接入已長滿單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100μl，37℃孵育2h后，吸棄病毒液，再接入不同濃度含磷酸化川牛膝多糖藥液培養(yǎng)液，每濃度4孔，每孔100μl，37℃孵育2h。測定方法：cck-8法檢測，將上述處理的細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)的液體吸棄，加入維持液每孔100μl，置37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，按cck-8法測各孔的吸光度(od)值。表1磷酸化川牛膝多糖的稀釋倍數(shù)表2先加磷酸化川牛膝多糖藥液后接種病毒時(shí)各組細(xì)胞的od值注:同行數(shù)據(jù)標(biāo)不同字母者表示差異顯著(p<0.05)。從表2結(jié)果可以看出，磷酸化川牛膝多糖藥液在15.625～0.907g/ml時(shí)的細(xì)胞od值均顯著大于病毒對(duì)照組(p<0.05)。說明在這些濃度范圍內(nèi)磷酸化川牛膝多糖顯著促進(jìn)f81抵抗cpv感染(表2)。表3磷酸化川牛膝多糖藥液和病毒混合感作后加入時(shí)各組細(xì)胞的od值注:同行數(shù)據(jù)標(biāo)不同字母者表示差異顯著(p<0.05)。從表3結(jié)果可以看出，磷酸化川牛膝多糖藥液在15.625～1.954g/ml時(shí)的細(xì)胞od值均顯著大于病毒對(duì)照組(p<0.05)。說明在這些濃度范圍內(nèi)磷酸化川牛膝多糖顯著促進(jìn)f81抵抗cpv感染(表3)。表4先接種病毒后加磷酸化川牛膝多糖時(shí)各組細(xì)胞的od值注:同行數(shù)據(jù)標(biāo)不同字母者表示差異顯著(p<0.05)。從表4結(jié)果可以看出，磷酸化川牛膝多糖在15.625–0.907g/ml時(shí)的細(xì)胞od值均顯著大于病毒對(duì)照組(p<0.05)。說明在這些濃度范圍內(nèi)磷酸化川牛膝多糖顯著促進(jìn)f81抵抗cpv感染(表4)。以上結(jié)果表明：磷酸化川牛膝多糖在體外，在三種加藥方式下，均能夠顯著抑制犬細(xì)胞病毒感染細(xì)胞的能力。說明磷酸化川牛膝多糖體外具有很好的抗病毒作用。二、磷酸化川牛膝多糖灌腸液對(duì)犬細(xì)小病毒病預(yù)防和治療作用試驗(yàn)。取80只犬隨機(jī)分為8組，每組10只。第1組為空白對(duì)照組，采用生理鹽水灌腸，2次/d，連用3d，每次0.5ml/kg。第2組為陰性對(duì)照組(模型組)，用犬細(xì)小病毒攻毒不給藥。第3、4、5組為磷酸化川牛膝多糖預(yù)防組，先對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行灌腸給藥，然后再攻毒。灌腸分別采用實(shí)施例1中的灌腸液進(jìn)行高劑量(6ml/kg)、中劑量(3ml/kg)、低劑量(1.5ml/kg)的磷酸化川牛膝多糖液灌腸，2次/d，連用3d。其高劑量、中劑量和低劑量灌腸液劑量分別為6ml/kg體重、3ml/kg體重、1.5ml/kg體重。第4d用犬細(xì)小病毒攻毒。第6、7、8組為磷酸化川牛膝多糖治療組，先對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行攻毒，犬體溫升高，出現(xiàn)癥狀后再灌腸給藥。灌腸分別采用實(shí)施例1中的灌腸液進(jìn)行高劑量(6ml/kg)、中劑量(3ml/kg)、低劑量(1.5ml/kg)的磷酸化川牛膝多糖液灌腸，2次/d，連用3d。其高劑量、中劑量和低劑量灌腸液劑量分別為6ml/kg體重、3ml/kg體重、1.5ml/kg體重。以上8組，分別于攻毒前1d、治療后3d、7d采血，檢測血清中ifn-γ和il-2的濃度，并統(tǒng)計(jì)藥物對(duì)犬的保護(hù)率。1、磷酸化川牛膝多糖灌腸液對(duì)犬細(xì)小病毒病預(yù)防作用(1)磷酸化川牛膝多糖灌腸液對(duì)犬細(xì)小病毒病發(fā)病率及死亡率的影響見表5，試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)犬感染犬細(xì)小病毒后，攻毒組死亡率為80％。其他應(yīng)用磷酸化川牛膝多糖灌腸液進(jìn)行預(yù)防的各個(gè)組的結(jié)果表明，高中低劑量預(yù)防給藥組犬保護(hù)率分別為70％、60％、50％。由此可見，磷酸化川牛膝多糖可以有效預(yù)防幼犬感染犬細(xì)小病毒。川牛膝多糖灌腸液預(yù)防給藥可以有效降低犬細(xì)小病毒的感染率，及降低犬的死亡率。表5磷酸化川牛膝多糖灌腸液預(yù)防給藥對(duì)犬細(xì)小病毒的攻毒的預(yù)防作用(2)磷酸化川牛膝多糖灌腸液預(yù)防給藥對(duì)犬細(xì)小病毒的攻毒犬血清中ifn-γ水平的影響ifn-γ是體內(nèi)重要的具有抗病毒作用的細(xì)胞因子，ifn-γ的濃度反映機(jī)體抗病毒免疫的水平，血清中ifn-γ的濃度越高，機(jī)體抗病毒能力越強(qiáng)。如表6所示，與空白組相比，攻毒組的ifn-γ水平顯著下降(p<0.05)，說明抗病毒免疫水平顯著下降。攻毒前1天，中藥預(yù)防給藥高、中劑量加攻毒組的ifn-γ水平顯著高于攻毒組和空白組(p<0.05)。攻毒后第3、7d,預(yù)防給藥各組的ifn-γ水平均顯著高于攻毒組和空白組(p<0.05)。表明中藥預(yù)防性灌腸顯著促進(jìn)犬細(xì)小病毒感染犬血清中ifn-γ水平(p<0.05)。說明磷酸化川牛膝多糖灌腸液預(yù)防性給藥能夠顯著促進(jìn)cpv感染犬的抗病毒能力。表6磷酸化川牛膝多糖灌腸液預(yù)防給藥對(duì)犬細(xì)小病毒的攻毒犬體內(nèi)ifn-γ含量的影響組別攻毒前1天攻毒后第3天攻毒后第7天第1組421.21±39.91a432.21±43.46a419.21±32.94a第2組429.25±26.22a263.25±23.76d183.25±34.97d第3組431.29±28.12a399.48±51.43b339.67±34.27c第4組447.54±46.09b368.34±39.36c370.24±31.52b第5組452.25±48.28b406.53±47.13b383.51±42.34b注：同列數(shù)值不同字母表示差異顯著(p<0.05)(3)磷酸化川牛膝多糖灌腸液預(yù)防給藥對(duì)犬細(xì)小病毒的感染犬血清中il-2水平的影響il-2的濃度反映機(jī)體抗病毒免疫的水平，il-2的濃度越大，病毒病毒免疫水平越高。如表7所示，與空白組相比，攻毒組的il-2水平顯著下降(p<0.05)，說明細(xì)小病毒感染病犬抗病毒免疫水平顯著下降。預(yù)防給予灌腸液的各組動(dòng)物攻毒后的il-2水平顯著高于攻毒組(p<0.05)，表明各個(gè)磷酸化川牛膝多糖預(yù)防灌腸顯著減少犬細(xì)小病毒感染犬血清中il-2含量下降(p<0.05)。說明磷酸化川牛膝多糖灌腸預(yù)防性給藥能夠促進(jìn)cpv感染犬的抗病毒水能力。表7磷酸化川牛膝多糖灌腸液預(yù)防給藥對(duì)犬細(xì)小病毒的攻毒犬血清中il-2含量的影響組別攻毒前1天攻毒后第3天攻毒后第7天第1組159.21±39.91c162.12±43.46b171.21±23.49a第2組162.23±31.24c85.52±23.76c83.25±43.79d第3組181.29±24.57b152.65±42.81b159.39±32.72b第4組193.67±93.23a157.37±39.54b133.48±39.61c第5組204.25±56.12a179.25±31.45a134.57±13.51c注：同列數(shù)值不同字母表示差異顯著(p<0.05)2、磷酸化川牛膝多糖灌腸液對(duì)犬細(xì)小病毒病治療作用(1)磷酸化川牛膝多糖灌腸液對(duì)犬細(xì)小病毒的攻毒犬死亡率及保護(hù)率的影響如表8所示，試驗(yàn)犬感染犬細(xì)小病毒后，攻毒組死亡率為80％，我們使用磷酸化川牛膝多糖灌腸液對(duì)攻毒犬進(jìn)行了治療，治療結(jié)果表明，磷酸化川牛膝多糖高中低劑量治療組犬保護(hù)率分別為80％、70％、60％。由此可見，磷酸化川牛膝多糖對(duì)幼犬感染犬細(xì)小病毒具有很好的治療作用，可有效的提高感染細(xì)小病毒犬的生存率。表8磷酸化川牛膝多糖灌腸液對(duì)犬細(xì)小病毒的攻毒的治療作用(2)磷酸化川牛膝多糖灌腸液對(duì)犬細(xì)小病毒的攻毒犬血清中ifn-γ水平的影響ifn-γ的濃度反映機(jī)體抗病毒免疫的水平，ifn-γ的濃度越大，病毒免疫水平越高。如表9所示，與空白組相比，攻毒組的ifn-γ水平顯著下降(p<0.05)，說明抗病毒免疫水平顯著下降。攻毒加中藥灌腸各組的ifn-γ水平顯著高于攻毒組(p<0.05)，表明各個(gè)中藥灌腸組顯著促進(jìn)犬細(xì)小病毒感染犬血清中ifn-γ含量(p<0.05)。說明磷酸化川牛膝多糖能夠促進(jìn)cpv感染犬的抗病毒水平。表9磷酸化川牛膝多糖灌腸液對(duì)犬細(xì)小病毒的攻毒犬體內(nèi)ifn-γ含量的影響。組別攻毒前1天攻毒后第3天攻毒后第7天第1組421.21±39.91a432.21±43.46a419.21±32.94a第2組429.25±26.22a263.25±23.76d183.25±34.97d第6組398.29±42.88a382.29±42.81b379.67±23.21b第7組408.67±39.11a368.34±39.65b370.24±39.23b第8組416.25±31.84a326.79±31.21c346.25±31.54c注：同列數(shù)值不同字母表示差異顯著(p<0.05)(3)磷酸化川牛膝多糖灌腸液對(duì)犬細(xì)小病毒的感染犬血清中il-2水平的影響il-2的濃度反映機(jī)體抗病毒免疫的水平，il-2的濃度越大，病毒病毒免疫水平越高。如表10所示，與空白組相比，攻毒組的il-2水平顯著下降(p<0.05)，說明細(xì)小病毒感染病犬抗病毒免疫水平顯著下降。攻毒加中藥灌腸各組的il-2水平顯著高于攻毒組(p<0.05)，表明各個(gè)中藥灌腸組顯著促進(jìn)犬細(xì)小病毒感染犬血清中il-2含量(p<0.05)。說明磷酸化川牛膝多糖灌腸給藥能夠促進(jìn)cpv感染犬的抗病毒水平。表10磷酸化川牛膝多糖灌腸液對(duì)犬細(xì)小病毒的攻毒犬血清中il-2含量的影響組別攻毒前1天攻毒后第3天攻毒后第7天第1組159.21±39.91a162.12±43.46a171.21±23.49a第2組179.25±62.22a85.52±23.76d83.25±43.79d第6組178.29±24.88a132.92±42.81b149.67±32.12b第7組169.67±93.11a118.43±39.65c123.24±39.32c第8組163.25±13.84a116.97±31.21c114.25±13.45c注：同列數(shù)值不同字母表示差異顯著(p<0.05)治療案例病例1：病例情況：2015年9月2日、金毛犬、年齡：4個(gè)月、體重：10kg、疫苗情況：未作任何疫苗。犬主敘述：昨天給小狗剛洗完澡，沒有吹的很干，突然精神沉郁，有點(diǎn)吐，并且伴有拉稀現(xiàn)象、并且糞便內(nèi)可見血絲。臨床癥狀：嘔吐、稀便、惡臭，并且糞便中伴有血色、精神萎靡，眼窩深陷。診斷方法：做實(shí)驗(yàn)室cpv檢查，結(jié)果cpv檢測為犬細(xì)小病病毒、根據(jù)臨床癥狀、試紙檢查結(jié)果初步判斷為犬細(xì)小病病毒。治療方法：使用灌腸療法，首先使用肥皂水灌入直腸，用于清除直腸和結(jié)腸中蓄積糞便，然后使用磷酸化川牛膝多糖灌腸液，按照3ml/kg體重的劑量灌腸，灌腸后前低后高的位置保持5min。每天2次，連用3天。第二天，腸道出血減輕，犬精神好轉(zhuǎn)，第3天無血便排出。病例2：病例情況：時(shí)間：2015年11月7日、犬種：薩摩耶犬、年齡：3個(gè)月、體重：8kg、疫苗情況：只做了兩次疫苗免疫。犬主敘述：回家之后便，之后有點(diǎn)咳嗽，晚上開始排稀便，番茄汁樣稀便。臨床癥狀：血便，精神萎靡。診斷方法：通過膠體金試紙板檢查，結(jié)果cpv陽性，根據(jù)臨床癥狀、試紙檢查結(jié)果初步判斷為犬細(xì)小病病毒。治療方法：使用灌腸療法，首先使用生理鹽水灌入直腸，用于清除直腸和結(jié)腸中的糞便，然后使用磷酸化川牛膝多糖灌腸液，按照3ml/kg體重的劑量灌腸，灌腸后前低后高的位置保持5min。每天2次，連用5天。第二天，血便顏色變淡，出血減輕，第5天無血便排出。病例3：病例情況：2015年4月23日、犬種：雜交犬，年齡：10歲、體重：5kg、犬主敘述：發(fā)現(xiàn)該犬精神沉郁，持續(xù)嘔吐，排稀便混有血絲，體溫40℃。診斷方法：通過膠體金試紙板檢查，結(jié)果cpv陽性，根據(jù)臨床癥狀、試紙檢查結(jié)果初步判斷為犬細(xì)小病病毒。治療方法：治療周期5日、采用灌腸療法。治療前的準(zhǔn)備：溫肥皂水調(diào)至37～38℃，首先使用問肥皂水灌入直腸清除直腸和結(jié)腸中的糞便，然后使用磷酸化川牛膝多糖灌腸液，按照3ml/kg體重的劑量灌腸，灌腸后前低后高的位置保持5min。每天2次，連用5天。第二天，血便顏色變淡，出血減輕，第5天無血便排出。以上對(duì)本發(fā)明所提供一種能夠抗犬細(xì)小病毒作用的灌腸液及其制作方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹，以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12