專利名稱：：利用超濾膜分離懷牛膝提取液中活性成分的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及中藥活性成分的分離方法，具體是利用超濾膜分離懷牛膝提取液中活性成分的方法。(二)現(xiàn)有技術目前懷牛膝提取液的分離多以成分間的極性差異為基本原理來進行分離。懷牛膝提取液中除含有齊墩果酸、多糖等活性成分外，還含有大量的植物蛋白、鞣質(zhì)、淀粉、細菌等大分子物質(zhì)以及許多微粒、絮狀物，這些物質(zhì)不但沒有藥效作用，而且對中藥復方制劑后期調(diào)配及產(chǎn)品的穩(wěn)定性產(chǎn)生較大影響。而傳統(tǒng)的分離工藝(溶劑沉淀、萃取技術)很難將這些物質(zhì)完全去除，并且在除雜過程中不同程度地存在以下問題第一、操作步驟復雜，條件苛刻、能耗高、生產(chǎn)周期長；第二、無效成分去除率和有效成分保留率不夠高，影響藥效的充分發(fā)揮；而吸附分離技術(大孔樹脂)雖能很好的去除這些雜質(zhì)，但此技術操作步驟復雜，并且過分強調(diào)單個組分，使中藥失去了原有的復方特色，影響藥效。(三)本發(fā)明的目的就是提出一種利用超濾膜分離懷牛膝提取液中活性成分的方法，為中藥復方制劑或中藥酒劑的后期配制提供質(zhì)量穩(wěn)定的中間體；本方法活性成分透過率高，透過液濁度低，操作簡單，能耗低，生產(chǎn)周期短。本方法包括下述步驟a.將分離液以膜孔徑為0.G5um、膜材質(zhì)為AW)3的陶瓷微濾膜機組過濾，操作溫度45~75°C,跨膜壓力0.050.25Mpa，得濾液；b.微濾結束后，截留液用水頂洗3次，每次頂洗量為截留液體積的2倍，得孩i濾及頂洗合并液；c.將所得合并液用超濾膜機組過濾，操作溫度35~45°C、跨膜壓力0.6~1.0Mpa、膜管型號為5萬，得超濾液；d。截留液用水頂洗3次，頂洗溫度35-4(TC,每次頂洗量為截留液體積的2倍，得超濾及頂洗合并液；合并液中齊墩果酸及多糖的透過率分別大于或等于98.73%和99.72%,透過液濁度小于或等于2.70NTU。所述懷牛膝提取液是在懷牛膝中投入U倍量50%乙醇回流提取3次，每次提取l.5h所制得的合并液。所述懷牛膝提取液的固液分離采用碟片式離心機，轉速為6000r/min。所述陶瓷微濾膜機組的組合方式是將兩根陶瓷膜管并聯(lián)為一組，再將兩組串在一起組成兩并兩串式，每根裝0.G5um膜芯9根，共36根。所述超濾膜機組是采用5-8根超濾膜并聯(lián)，其中每根超濾膜膜管裝5萬分子量膜芯4根，共計20-32根膜芯，總膜面積800—1000平方米。本發(fā)明通過分析傳統(tǒng)工藝中的一些不足，并根據(jù)懷牛膝中有效成分和雜質(zhì)組成情況，采取相應規(guī)格的微濾膜及超濾膜對懷牛膝提取液中的活性成分進行分離，即將懷牛膝提取液通過超濾膜分離選擇性去除其中的一些大分子物質(zhì)(植物蛋白、膠質(zhì)、鞣質(zhì)、細菌等)，最大限度的保留活性成分齊墩果酸、多糖等，并將其用于中藥復方制劑或中藥酒劑的后期調(diào)配，從而達到穩(wěn)定終產(chǎn)品質(zhì)量的目的。本工藝與傳統(tǒng)工藝的區(qū)別在于，傳統(tǒng)工藝主要利用不同組分在不同溶劑中溶解度的不同而實現(xiàn)分離，而超濾膜分離技術是以具有選擇透過性的膜為分離介質(zhì)，在某種驅(qū)動力(壓力差)的作用下，物料中不同分子量、不同空間結構的成分依據(jù)濾膜孔徑的大小或通過或被截留，達到分離去雜的目的，它實現(xiàn)了中藥有效部位的分離，充分有效地保留了中藥原方配伍成分。雖然超濾技術已經(jīng)在中藥活性成分分離中得到應用，但每一種中藥材由于其活性成分及雜質(zhì)的組成不同，它們的微觀分子結構不同，分離后分離液的使用方式不同，因此，采用什么型號的膜管膜芯，膜管的組合方式以及才喿作條件來進行分離，是膜分離中要解決的關鍵問題。為篩選出本工藝的最佳工藝參數(shù)，本發(fā)明以不同操作條件下活性成分超濾透過率及透過液的濁度為考核指標進行實驗，具體實驗情況如下表l九種操作條件一覽表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2不同操作條件下活性成分的透過率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注超濾進料液中齊墩果酸總量10223.51mg,多糖總量421.03g透過率=透過液中某一成分含量/進料液中某一成分總量表3不同操作條件下超濾膜透過液的濁度變化情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>通過超濾膜活性成分透過率及透過液濁度綜合比較優(yōu)選出本工藝過程最佳操作參數(shù)為溫度3545。C、跨膜壓力0.6~1.0Mpa、膜管型號5萬。由于齊墩果酸及牛膝多糖的含量測定尚無統(tǒng)一方法，本發(fā)明中專門摸索并建立了齊墩果酸及牛膝多糖含量測定方法。經(jīng)驗證，本檢測方法易于操作，重現(xiàn)性好。具體測定方法如下齊墩果酸的測定(紫外-可見分光光度法)1、對照品溶液的配制精密稱取齊墩果酸標準品5.18mg(中國藥品生物制品檢定所110709-200304),至50ml容量瓶中用氯仿溶解，并用氯仿定容至刻度，搖勻，備用。2、標準曲線用可調(diào)式微量移液器分別精密吸取200,400，600,800,1000iu1對照品溶液于10ml具塞比色管中，分別用氯仿定容到lml。然后水浴揮干溶劑。各加6%香草醛冰醋酸溶液0.2ml,高氯酸0.8ml，蓋上塞子后在7(TC水浴15分鐘，用冰水冷卻，分別加冰醋酸5ml，搖勻。另再估文一空白，用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計于560腿處一全測其吸光度。既可得標準曲線。線性回歸方程為Abs=0.0516*(C)+0.00435,線性范圍r=0.9989;3、供試品的前處理取供試品溶液(包括牛膝提取液，微濾液，超濾液)水浴揮干溶劑，用5%硫酸95%酒精(1:1)水解6小時，水溫控制在100。C左右，水解完全后蒸去酒精。然后放冷后，用氯仿20ml、10ml、10ml分3次萃取，萃取液用氯仿液定容至50ml,備用。4、齊榜t果酸的測定用可調(diào)式微量移液器分別精密吸取上述前處理的提取液1m1(或者0.5ml)。揮干氯仿后，加6°/。香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸G.8ml，蓋上塞子后在70。C水浴15分鐘，用冰水冷卻，再加冰醋酸5ml，搖勻。另再j故一空白，用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計于560nm處斗僉測其齊墩果酸的含量。牛膝總多糖的測定(硫酸苯酚法)1、實驗原理提取液中的多糖成分在硫酸的作用下，先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后和苯酚縮合成有色化合物，用紫外分光光度法于490nm處測定其洗光度，并由此計算其含量。2、標準品溶液的配制精密稱耳又D-葡萄糖標準品12mg至100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度。搖勻即得。3、標準曲線的制備用可調(diào)式微量移液器分別精密吸取D-葡萄糖標準品溶液0.lml,0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml,1.Oml于1Oml比色管中,分別補加蒸餾水至1ml,另再喉支一空白組。加入5%苯酚溶液1ml(配制苯酚溶液的苯酚需重蒸過)。然后迅速加入5ml濃碌u酸，于沸水中煮沸15分鐘。冷卻至室溫后于490歷處測定吸光度。既可得標準曲線。線性回歸方程為Abs=0.0579x(C)-O.00355,線性范圍r=0.9998。4、供試品的前處理供試品(包括牛膝提取液，微濾液，超濾液)未做特殊的前處理，只是根據(jù)相應濃度進行稀釋即可(一般稀釋lGO-^0倍)5、牛膝總多糖的測定-.姊青密吸耳又上述供試品lml,加入5°/。苯酚溶液lml(配制苯酚溶液的苯酚需重蒸過)。然后迅速加入5ml濃;琉酸，于沸水中煮沸15分鐘。另再做一空白，冷卻至室溫后于490nm處測定吸光度，即可檢測出供試品中多糖的濃度。本發(fā)明具有以下特點:(l)在常溫下操作，適于熱敏性物質(zhì)的分離、純化；(2)分離過程無相變發(fā)生，不會改變中藥的有效成分及結構；(3)分離系數(shù)大，能夠更好地除去雜質(zhì)，并能有效地保留中藥原方配伍成分，有效成分損失較少，成品穩(wěn)定性優(yōu)于傳統(tǒng)產(chǎn)品；(4)能耗低；(5)操作方便，易于自動化，生產(chǎn)周期短。本發(fā)明除具有以上特點外，還具有下述特點(1)以特定孔徑、材質(zhì)和組合方式的微濾膜機組和超濾膜機組二重組合，在優(yōu)選的工藝條件下分離，分離液中活性成分透過率高，透過液濁度明顯低于現(xiàn)有方法；(2)摸索并建立了中藥懷牛膝中活性成分齊墩果酸及牛膝多糖的含量測定方法，為本發(fā)明定量的判斷分離效果提供了直觀的數(shù)據(jù)支持。本工藝與大孔樹脂生產(chǎn)周期對比情況:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注大孔樹脂與超濾膜分離工藝進料量都為600Kg，其中各工藝過程的的提取階段相同。大孔樹脂與超濾膜分離工藝有效成分轉移率對比表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>分析本發(fā)明方法生產(chǎn)周期明顯短于大孔樹脂分離工藝，且超濾膜分離工藝的分離效果明顯優(yōu)于大孔樹脂的分離效果。在大孔樹脂的分離純化過程中，多糖等有效成分被洗脫掉，導致多糖轉移率為0.00%,而超濾膜分離工藝根據(jù)有效成分分子量的大小、空間結構的不同對有效成分進行篩分分離，實現(xiàn)中藥有效部位的分離，充分保留了中藥原方配伍成分。具體實施例方式1、懷牛膝提取液的制備在懷牛膝中投入12倍量的50%乙醇，回流提取3次，每次提if又1.5h,合并3次提耳又液，分別測定活性成分含量，備用；2、固液分離將上述提取液用碟片式離心機進行高速離心，轉速6000r/min;收集上清液，離心后的溶液要求澄清透明，離心后的沉淀直接排掉。3、微濾將離心后的上清液用陶瓷微濾膜機組過濾，其中膜孔徑0.05um、膜材質(zhì)AL20,除去其中的一些果膠、懸浮物等物質(zhì)，為后續(xù)超濾工序進行料液預處理；所述陶資微濾膜機組采用兩根陶瓷膜并聯(lián)為一組，再將兩組串在一起組成兩并兩串式，每根裝0.05um膜芯9根，共36根。孩吏濾溫度45~75°C、跨膜壓力0.05~0.25Mpa-敞濾結束后，截留液用水頂洗3次，每次頂洗量為截留液體積的2倍量。得微濾及頂洗合并液；(分別測定活性成分含量)4、超濾超濾是一種膜濾法，也有錯流過濾之稱。其原理近似機械篩，對不同分子量、不同空間結構的物質(zhì)進行分離。超濾膜的孔徑一屏殳為l100nm,能夠截留分子量300~500000道爾頓的物質(zhì)。當物質(zhì)大小相差10倍時，分離效果最佳。將步驟3之合并液用(50000D)超濾膜組進行超濾，其中所述所述超濾膜機組是采用5-8根超濾膜并聯(lián)，其中每根超濾膜裝5萬分子量膜芯4根，膜芯連接方式亦為并聯(lián)，共計20-32根膜芯，總膜面積800-1000平方米，超濾溫度35~45°C,跨膜壓力0.6~1.謹pa,膜管型號5萬，膜芯材質(zhì)聚偏氟乙蹄，得超濾液。(分別測定超濾液中活性成分含量)懷牛膝超濾膜透過液質(zhì)量要求<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上述超濾液可直接用于配制復方中藥制劑或中藥保健酒，如中國勁酒等。權利要求1、利用超濾膜分離懷牛膝提取液中活性成分的方法，先將懷牛膝提取液進行固液分離，得分離液；其特征在于還包括下述步驟a.將分離液以膜孔徑為0.05um、膜材質(zhì)為AL2O3的陶瓷微濾膜機組過濾，操作溫度45～75℃，跨膜壓力0.05～0.25Mpa，得濾液；b.微濾結束后，截留液用水頂洗3次，每次頂洗量為截留液體積的2倍，得微濾及頂洗合并液；c.將所得合并液用超濾膜機組過濾，操作溫度35～45℃、跨膜壓力0.6～1.0Mpa、膜管型號為5萬，得超濾液；d.截留液用水頂洗3次，頂洗溫度35-40℃，每次頂洗量為截留液體積的2倍，得超濾及頂洗合并液；合并液中齊墩果酸及多糖的透過率分別大于或等于98.73％和99.72％，透過液濁度小于或等于2.70NTU。2、根據(jù)權利要求1所述的利用超濾膜分離懷牛膝提取液中活性成分的方法，其特征在于所述懷牛膝提取液是在懷牛膝中投入12倍量50%乙醇回流提取3次，每次提取l.5h所制得的合并液。3、根據(jù)權利要求1所述的利用超濾膜分離懷牛膝提取液中活性成分的方法，其特征在于所述懷牛膝提取液的固液分離采用石萊片式離心4幾，轉速為6000r/min。4、根據(jù)權利要求1所述的利用超濾膜分離懷牛膝提取液中活性成分的方法，其特征在于所述陶瓷微濾膜機組的組合方式是將兩根陶瓷膜管并聯(lián)為一組，再將兩組串在一起組成兩并兩串式，每根裝0.05um膜芯9根，共36根。5、根據(jù)權利要求1所述的利用超濾膜分離懷牛膝提取液中活性成分的方法，其特征在于所述超濾膜機組是采用5-8根超濾膜并聯(lián)，其中每根超濾膜膜管裝5萬分子量膜芯4根，共計20-32根膜芯,總膜面積800-1000平方米。全文摘要利用超濾膜分離懷牛膝提取液中活性成分的方法，先將懷牛膝提取液進行固液分離，得分離液；將分離液以膜孔徑為0.05um、膜材質(zhì)為AL₂O₃的陶瓷微濾膜機組過濾，得濾液；微濾結束后，截留液用水頂洗3次，每次頂洗量為截留液體積的2倍，得微濾及頂洗合并液；將所得合并液用超濾膜機組過濾，得超濾液；截留液用水頂洗3次，頂洗溫度35-40℃，每次頂洗量為截留液體積的2倍，得超濾及頂洗合并液；本方法與現(xiàn)有技術相比，操作簡單，能耗低，活性成分透過率高，生產(chǎn)周期短；超濾后的藥液無論是配制復方制劑還是中藥酒劑，產(chǎn)品質(zhì)量都十分穩(wěn)定。文檔編號A61K36/185GK101632695SQ200810048520公開日2010年1月27日申請日期2008年7月24日優(yōu)先權日2008年7月24日發(fā)明者劉世龍,劉源才,楊躍軍,趙國鋒申請人:勁牌有限公司