本發(fā)明涉及含氧雜環(huán)化合物，具體涉及雙苯駢型香豆素類化合物。

背景技術(shù)：

雙苯駢型香豆素類化合物在自然界分布極少，主要通過化學合成得到系列5,6位苯駢成2h-吡喃環(huán)的雙苯駢型香豆素類化合物(yung-sonhon,tze-weitseng,chia-yicheng.electrocyclizationofcis-dienalsinorganicsynthesis:anewandversatilesyntheticmethodforthepreparationofaryl-andheteroaryl-fusedcoumarins.chem.commun.,2009,5618-5620)，該文的作者對9個合成的5,6位苯駢成2h-吡喃環(huán)的雙苯駢型香豆素類化合物進行了脂質(zhì)過氧化抑制和超氧化物清除率的實驗，發(fā)現(xiàn)其中化合物3i具有較好的抗脂質(zhì)過氧化和體內(nèi)抗炎活性。隨后又首次全合成從燈心草科植物分離得到的天然香豆素9-hydroxy-8-methyl-3h-benzo[f]-chromen-3-one(yung-sonhon,ya-chunhong,bor-chrnghong,ju-hsiouliao.thefirstsynthesisofnaturaloccurringjuncaceaecoumarin,9-hydroxy-8-methyl-3h-benzo[f]-chromen-3-one,featuringaone-potrearrangementandaromatizationcascade.j.chin.chem.soc.2012,59,407-420)。綜上所述，目前有關(guān)天然雙苯駢型香豆素類化合物結(jié)構(gòu)及其生物活性的報道極少，僅有關(guān)于該類化合物有機合成的研究報道。

猴棗(goatbezoar)為一種普通非瀕危牧羊(caprahircus)的腸胃結(jié)石，又名猴子棗、羊腸棗、域棗等，主要分布于印度東南部，馬來西亞亦有產(chǎn)，具有清熱鎮(zhèn)驚，豁痰定喘，解毒消腫之效，研粉作為散劑(葉橋,黃文青,猴棗的商品規(guī)格及其鑒別,中藥材,1995,18:555-557)。微苦，涼；具有消痰鎮(zhèn)驚、清熱解毒之功效，主治小兒驚風、痰多氣急、氣喘諸癥(仇良棟,馬來西亞猴棗與印度猴棗的鑒別研究,中藥材科技,1984,5:23-24)。

由于產(chǎn)量的限制，猴棗藥材較為昂貴，故有關(guān)猴棗的化學研究報道極少，即使在有限的報道文獻中，亦是通過試管反應或紅外光譜法推測其可能含有的功能基團(張德榮,猴棗和類似品的鑒別,中藥材科技,1979,4:36；仇良棟,馬來西亞猴棗與印度猴棗的鑒別研究,中藥材科技,1984,5:23-24)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題提供一種雙苯駢型香豆素類化合物，該化合物具有抗炎活性。

本發(fā)明要解決上述問題的技術(shù)方案是：

一種雙苯駢型香豆素類化合物，其分子結(jié)構(gòu)如式ⅰ所示：

本發(fā)明所述的雙苯駢型香豆素類化合物的分子式為c13h8o4，hr-esi-msm/z227.0358[m-h]^－，化學名為5,7-二羥基-6α,8α-苯駢香豆素(英文名為5,7-dehydroxy-6α,8α-benzocoumarin)。

本發(fā)明所述的雙苯駢型香豆素類化合物可以通過化學合成的方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過應掌握的知識確定合成步驟和工藝條件。本發(fā)明所述的雙苯駢型香豆素類化合物還可以從猴棗(goatbezoar)中分離得到，具體分離方法由下步驟組成：

(1)取猴棗，依次用12、10和8倍(即乙醇的體積為猴棗重量的倍數(shù)。如果所述的體積單位是l，所述的重量單位便是kg；若所述的體積單位是ml，所述的重量單位則是g)的體積濃度為95％的乙醇分別回流提取2h，合并乙醇提取液，回收乙醇并減壓濃縮至無醇味，得總浸膏；

(2)將總浸膏溶解于水中，然后，依次用石油醚、醋酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，取正丁醇萃取液，減壓濃縮，除去溶劑，得正丁醇萃取物；

(3)將正丁醇萃取物溶解在水中，過rp-ods硅膠柱，依次用體積濃度為30％的甲醇和體積濃度為60％的甲醇洗脫；收集體積濃度為60％的甲醇洗脫液過sephadexlh-20柱，以體積濃度為80％的甲醇為洗脫劑洗脫，收集洗脫液，濃縮后得到淡黃色針狀結(jié)晶即可。

上述分離方法中所述的猴棗是一種來源于普通非瀕危牧羊，學名為caprahircus的腸胃，屬于腹腔結(jié)石，英文名稱為goatbezoar，學名為phytobezoar，印度名稱為powzer或buckilochen。

本發(fā)明所述的雙苯駢型香豆素化合物，具有抗炎的生物活性，可用于制備預防和治療急性氣管支氣管炎的藥物。所述的藥物是由(ⅰ)式所示雙苯駢型香豆素類化合物和藥學上可以接受的輔料組成的常用的劑型，如，注射劑、片劑或膠囊劑等。所述制劑中(i)式所示的化合物的重量百分含量為0.1％～50％。

本發(fā)明所述的雙苯駢型香豆素類化合物對col-ⅰ、tnf-α和il-1β的分泌具有明顯的抑制作用，抗炎效果顯著，可用于制備預防和治療急性氣管支氣管炎的藥物。

下面通過實驗來證明(ⅰ)式所示雙苯駢型香豆素類化合物所具有的技術(shù)效果。

(1)含藥培養(yǎng)液的配制

將下述實施例1所得到的化合物5,7-二羥基-6α,8α-苯駢香豆素用dmso溶解后配制成1000mmol/l的母液，再以dmem高糖培養(yǎng)液(即完全培養(yǎng)基：含10％胎牛血清、150μg/mlg418、青霉素100μg/ml、100μg/ml鏈霉素及0.3g/l谷氨酰胺)稀釋，分別配制成1000，500，100，10，1，0.1μmol/l共6個濃度梯度的含藥培養(yǎng)液。

(2)實驗方法

①細胞毒性實驗

cck-8法：用0.25％胰蛋白酶和2‰edta1:1混合消化單層培養(yǎng)細胞，停止消化后，加入pbs液，用彎頭吸管反復吹打分散細胞，于800rpm離心5min。棄去上清，加入1mldmem高糖培養(yǎng)液重懸，吹打分散細胞后配成單個細胞懸液，以4×10⁵個/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μl。將培養(yǎng)板放入37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞完全貼壁后，加入不同濃度的含藥培養(yǎng)液(實驗組)、正常培養(yǎng)液(空白對照組)，實驗組和空白對照組每組設4個復孔，藥物對照組(無細胞，僅加入不同濃度的含藥培養(yǎng)液)設1個復孔。各組同時培養(yǎng)24h，吸去含藥培養(yǎng)基，每孔加入含cck-8溶液的培養(yǎng)基100μl，繼續(xù)培養(yǎng)2h后在450nm下檢測od值。

在酶標儀上測各孔od值，測定波長450nm，記錄結(jié)果，計算細胞存活率和半數(shù)毒性濃度(tc50)。

細胞存活率(％)＝(od實驗組/od空白對照組)×100％

半數(shù)毒性濃度(tc50)＝antilog[logb+(50－b)的抑制百分率/(a－b)的抑制百分率×c](a≧抑制50％藥物濃度，b≦抑制50％藥物濃度，c＝log稀釋倍數(shù))，參照reed-muench法。

②對col-ⅰ、tnfα和il-1β的抑制實驗

酶聯(lián)免疫法：取細胞上清液，采用酶聯(lián)免疫法，用col-ⅰ、tnfα和il-1β檢測試劑盒按說明書操作，在酶標儀上以450nm作為檢測波長測定各孔od值。計算col-ⅰ、tnfα和il-1β的抑制率和藥物對col-ⅰ、tnfα和il-1β的半數(shù)抑制濃度(ic50)。

藥物對col-ⅰ、tnfα和il-1β的抑制率(％)＝(1-od實驗組/od空白對照組)×100％

藥物對col-ⅰ、tnfα和il-1β的半數(shù)抑制濃度(ic50)＝antilog[logb+(50-b)的抑制百分率/(a-b)的抑制百分率×c](a≧抑制50％藥物濃度，b≦抑制50％藥物濃度，c＝log稀釋倍數(shù))，參照reed-muench法。

③統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標準差)表示，統(tǒng)計分析采用spss17.0統(tǒng)計軟件。同一化合物在不同濃度組間的od值，經(jīng)方差齊性檢驗后進行單因素方差分析(one-wayanova)：方差齊時采用lsd法檢驗；方差不齊時采用dunnett’st3法。顯著性水準取α＝0.05，以p<0.05時，判斷組間差異具有統(tǒng)計學意義。

④計算治療指數(shù)

對col-ⅰ、tnf-α和il-1β的分泌有明顯抑制作用，且抑制率與藥物濃度呈典型量效關(guān)系的化合物，其體外抗hbv作用治療指數(shù)(ti)評價。

治療指數(shù)(ti)＝tc50/ic50，其中ti≧2為有效低毒；1＜ti＜2為低效有毒；ti≦1為毒性。ti數(shù)值越大化合物越安全。

(3)實驗結(jié)果與討論

將實驗數(shù)據(jù)經(jīng)上述統(tǒng)計學處理后結(jié)果如下表1～3所示。

表1細胞毒性實驗結(jié)果

*：與空白對照組比較時p<0.05

表2對col-ⅰ、tnf-α和il-1β的抑制實驗結(jié)果

*：與空白對照組比較時p<0.05

表3tc50、ic50和ti值

上述實驗結(jié)果表明本發(fā)明所述的5,7-二羥基-6α,8α-苯駢香豆素具有抗炎活性，對col-ⅰ、tnf-α和il-1β的ti均大于2，可用于制備急性氣管支氣管炎的治療和預防藥物。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述化合物的¹h-nmr圖(500mhz)。

圖2為本發(fā)明所述化合物的¹³c-nmr圖(125mhz)。

圖3為本發(fā)明所述化合物的dept圖。

圖4為本發(fā)明所述化合物的hsqcnmr圖。

圖5為本發(fā)明所述化合物的hmbcnmr圖。

圖6為本發(fā)明所述化合物的noenmr圖。

具體實施方式

下述實驗用猴棗(goatbezoar)采自印度東南部的安得拉邦。

例1：

一、化合物的制備

(1)取干燥的猴棗粗粉1kg，依次用12l，10l和8l濃度為95％的乙醇回流提取2h，合并乙醇提取液，回收乙醇并減壓濃縮至無醇味，得總浸膏；

(2)將總浸膏溶解于水中，然后，依次用3l石油醚、3l醋酸乙酯和3l水飽和的正丁醇萃取3次，取正丁醇萃取液，減壓濃縮除去溶劑，得正丁醇萃取物48g；

(3)取正丁醇萃取物40g溶解在600ml水中，過rp-ods硅膠柱，依次用濃度為30％的甲醇和濃度為60％的甲醇洗脫；收集濃度為60％的甲醇洗脫液過過sephadexlh-20柱，以濃度為80％的甲醇為洗脫劑洗脫，收集洗脫液，濃縮后得到淡黃色針狀結(jié)晶380mg。

二、化合物的鑒定

所得到的為淡黃色針晶，易溶于甲醇。uv254nm下現(xiàn)明顯暗斑，三氯化鐵-鐵氰化鉀反應呈陽性，顯示含有酚羥基；ir(kbr)νmax:3471cm^-1處有-oh強吸收峰，3166cm^-1處有ar-h強吸收峰，并且在1702cm^-1左右有c＝o伸縮振動特征峰出現(xiàn)，1510，1583，1615cm^-1提示分子中含有苯環(huán)。hr-esi-msm/z:[m-h]^-227.0358，提示該化合物的分子量為228.0358，在esi-ms給出的碎片離子m/z199.0[m-co]^-，171.1[m-2co]^-顯示出典型的香豆素類化合物裂解過程。結(jié)合¹³c-nmr(125mhz,c5d5n)和dept譜確定該化合物分子式為c13h8o4。

¹h-nmr(500mhz,c5d5n)僅在芳香區(qū)出現(xiàn)6個質(zhì)子信號峰，δh8.43,7.98,7.76,7.24,7.10,7.07，通過hsqc譜分析得到對應的碳信號分別為133.1,124.8,106.9,117.0,103.9,113.6，δh8.43(1h,d,j＝8.5hz)和δh7.24(1h,d,j＝8.5hz)為雙鍵上順式偶合的兩個氫質(zhì)子，是香豆素類化合物母核上h-3和是h-4的特征質(zhì)子信號峰，故確證該化合物母核為香豆素類。

¹³c-nmr(125mhz,c5d5n)共顯示13個碳信號，均出現(xiàn)在165～100之間，其中1個羰基碳δc:165.1；3個連氧季碳δc161.4,161.3,153.7；δc165.1,133.1,117.0提示α、β不飽和內(nèi)酯環(huán)的存在，δc133.1和117.0為雙鍵碳信號。hsqc譜顯示δc106.9和103.9分別與δh7.76(1h,d,j＝2.0hz)和δh7.10(1h,d,j＝2.0hz)對應，在苯環(huán)中處于間位的2個次甲基；同樣通過hsqc譜得到δc124.8和113.6分別與δh7.98(1h,d,j＝8.5hz)和δh7.04(1h,d,j＝8.5hz)對應，提示苯環(huán)存在處于鄰位的2個次甲基。對化合物hz-2核磁數(shù)據(jù)進行全歸屬，歸屬后的數(shù)據(jù)與文獻^b中報道的6-hydroxy-7methyl-5α,8α-benzocoumarin核磁數(shù)據(jù)高度一致，說明兩者結(jié)構(gòu)相似。¹h-nmr和¹³c-nmr的數(shù)據(jù)見表4。

¹h-¹hcosy結(jié)合hsqc譜顯示δh8.43(δc133.1)和δh7.24(δc117.0)相關(guān)，此為h-3與h-4相關(guān)。δh7.98(δc124.8)和δh7.04(δc113.6)相關(guān)，此為h-9與h-10相關(guān)。

hmbc譜分析：δh7.04與δc165.1，117.6，110.4，103.8有遠程相關(guān)；δh7.10與δc153.7，110.4有遠程相關(guān)；δh7.24與δc113.6，106.9有遠程相關(guān)；δh7.76與δc165.1，124.8，117.6，113.6，110.4有遠程相關(guān)；δh7.98與δc161.3，153.7，138.4，106.9有遠程相關(guān)；δh8.43與δc165.1，161.4，138.4有遠程相關(guān)。

綜合上述分析，鑒定該化合物為5,7-二羥基-6α,8α-苯駢香豆素，結(jié)構(gòu)式見發(fā)明內(nèi)容部分的式(ⅰ)，經(jīng)scifinder檢索，未見文獻報道，初步判斷為一新化合物。

表4.化合物hz-2的¹h和¹³c-nmr(c5d5n)數(shù)據(jù)歸屬

例2：(片劑)

取采用上述實施例1所述方法得到的化合物5000mg與4000mg淀粉、200mg交聯(lián)pvp、300mg羧甲基淀粉鈉混合均勻，用5％pvp的75％乙醇溶液作為粘合劑，制軟材，以18目篩制粒，60℃干燥后1h，20目整粒后加入適量滑石粉，混勻，壓片，制成規(guī)格為100mg/片的片劑供口服使用。

例3：(注射劑)

取采用上述實施例1所述方法得到的化合物1000mg，加1000ml的注射用水，用碳酸鈉調(diào)ph值至7～7.4，攪拌使溶解，除菌濾過，灌封，經(jīng)100℃15分鐘流通蒸汽滅菌，制成每支2mg/2ml的注射液供注射使用。

例4：(膠囊劑)

取采用上述實施例1所述方法得到的化合物5000mg與4000mg微晶纖維素、500mg羧甲基淀粉鈉、400mg十二烷基硫酸鈉等輔料充分混合，采用輥壓法進行干法制粒，再與適量硬脂酸鎂混勻，填充入3#空心膠囊，制成規(guī)格為100mg/粒的膠囊劑供口服使用。