本發(fā)明屬于食品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及鵪鶉特異性pcr擴(kuò)增鑒定畜禽肉中鵪鶉肉源性成分。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，動(dòng)物源性食品摻雜摻假、以次充好、以廉價(jià)劣質(zhì)的畜禽肉替代高價(jià)優(yōu)質(zhì)畜禽肉等各種食品安全事件頻發(fā)，嚴(yán)重?cái)_亂了市場(chǎng)秩序，侵害了生產(chǎn)者和消費(fèi)者的合法利益，同時(shí)帶來(lái)了嚴(yán)重的食品安全隱患。在西方，一項(xiàng)對(duì)近千種肉制品的檢測(cè)分析表明，有近20％的產(chǎn)品存在標(biāo)識(shí)與品種不完全相符的現(xiàn)象。

鵪鶉屬于雞形目最大的特點(diǎn)就是耐粗飼，抗病能力強(qiáng)，出欄快，產(chǎn)蛋率高，易管理等等很多優(yōu)點(diǎn)，很多人都飼養(yǎng)鵪鶉，因此市場(chǎng)上常會(huì)利用家養(yǎng)鵪鶉冒充野生麻雀、鴿子或其他野生鳥類的不法行為。研究動(dòng)物源性食品安全檢測(cè)技術(shù)，對(duì)食品動(dòng)物源性成分進(jìn)行鑒定，顯得尤為重要。pcr技術(shù)由于其操作簡(jiǎn)便、快速高效等特點(diǎn)，已在國(guó)外肉類摻假研究中得到廣泛應(yīng)用，并取得一些創(chuàng)新性成果。動(dòng)物線粒體基因組dna作為核外遺傳物質(zhì)，無(wú)論是在種間還是種內(nèi)都具有廣泛的多態(tài)性，是設(shè)計(jì)肉類成分定性檢測(cè)的首選靶點(diǎn)，包括細(xì)胞色素b(cytb)基因、細(xì)胞色素c氧化酶第ⅰ亞基(cox1)基因、16srrna、d-loop基因等，在這些基因中16srrna在線粒體基因組中屬于進(jìn)化速率較慢的，更有利于肉類成分的定性檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種pcr檢測(cè)肉類中鵪鶉源成分鑒定的方法及專用引物，操作簡(jiǎn)便、快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的分析肉質(zhì)中鵪鶉源成分，該方法首次利用16srrna為目標(biāo)基因?qū)ι罴庸g鶉肉進(jìn)行檢測(cè)，所設(shè)計(jì)引物同時(shí)適用于pcr和實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr)方法中，不僅具有良好的特異性，且高度的靈敏性為食品中動(dòng)物源性成分的鑒定探索了新的途徑，具有操作便捷，穩(wěn)定準(zhǔn)確等有益結(jié)果。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，基于16srrna鵪鶉肉源成分pcr擴(kuò)增鑒定專用引物對(duì)，其核苷酸序列為：

所述引物對(duì)的上游引物序列為：5‘-aaggataccacaatttaac-3’，

所述引物對(duì)的下游引物序列為：5‘-agagggaaggtagtgtt-3’。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種pcr檢測(cè)肉類中鵪鶉源成分鑒定的方法：分別提取鵪鶉肉樣本dna作為陽(yáng)性對(duì)照樣本和待測(cè)肉樣dna并稀釋到同一濃度；利用所述pcr擴(kuò)增鑒定專用引物對(duì)鵪鶉肉樣本dna和待測(cè)肉樣dna同時(shí)在相同條件下進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，以鵪鶉肉樣本dna瓊脂糖凝膠電泳圖譜中118bp電泳條帶為陽(yáng)性結(jié)果；將待測(cè)肉樣dna其pcr擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜與陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，如果待測(cè)肉樣dnapcr擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜中出現(xiàn)電泳條帶118bp并與陽(yáng)性對(duì)照樣本條帶亮度相同，認(rèn)定待測(cè)鵪鶉肉為純正鵪鶉肉，反之，則是摻假鵪鶉肉。

優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×pcrmix10μl，10mol/μl上游引物0.2μl，10mol/μl下游引物0.2μl，20ng/μl模板dna或者待測(cè)肉樣dna1μl，滅菌雙蒸水8.6μl。

優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?5℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s此過(guò)程經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。

優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為：

aaggataccacaatttaacccccttatgtaaagattaagaacaattcgacggaggtacag60

ctccatcgaaaaagaatacaacctcccccagcggataaactaacactaccttccctct118

本發(fā)明的第三個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，一種qpcr檢測(cè)肉類中鵪鶉源成分鑒定的方法：提取鵪鶉肉樣本dna和待測(cè)肉樣dna并稀釋到同一濃度；利用所述pcr擴(kuò)增鑒定專用引物對(duì)鵪鶉肉樣本dna和待測(cè)肉樣dna實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增(qpcr)，實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)在abi7500序列擴(kuò)增儀中進(jìn)行，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀軟件對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的tm值熔解曲線圖譜。以鵪鶉肉樣本dna擴(kuò)增曲線的ct值小于34的擴(kuò)增曲線作為陽(yáng)性結(jié)果，將待測(cè)肉樣dna的擴(kuò)增曲線圖譜與陽(yáng)性結(jié)果對(duì)照，如果待測(cè)鵪鶉肉dna的擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值與陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果相似，即待測(cè)肉樣dna的擴(kuò)增曲線的ct值小于34，認(rèn)定待測(cè)鵪鶉肉為純正鵪鶉肉，反之，則是摻假鵪鶉肉。

優(yōu)選的，所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為20ng/μldna模板1.2μl，10pmol/μl上游引物0.2μl，10pmol/μl下游引物0.2μl，綠色熒光實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)試劑盒(sybrrealmastermix)7.5μl，雙蒸水5.9μl。

優(yōu)選的，所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序如下圖所示：50℃預(yù)熱2min，95℃預(yù)變性10min，然后95℃變性15s、60℃退火延伸1min，共40個(gè)循環(huán)，最后95℃變性15s，60℃退火延伸30s，95℃變性15s收集熔解曲線。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益結(jié)果：

第一，根據(jù)鵪鶉線粒體基因組中16srrna設(shè)計(jì)引物對(duì)；提取鵪鶉肉樣本dna后，利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行非標(biāo)記熒光pcr擴(kuò)增；應(yīng)用熒光pcr儀軟件對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的tm值熔解曲線圖譜；操作簡(jiǎn)便、快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

第二，本發(fā)明的檢測(cè)方法具有速度快、成本低、易掌握等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效檢測(cè)出肉類樣品中鵪鶉源成分，為市場(chǎng)上的摻假肉類提供便捷的鑒定方法。

第三，本發(fā)明的檢測(cè)引物無(wú)論是針對(duì)普通pcr擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)還是熒光定量pcr方法直接觀察，都能取得較好結(jié)果。

第四，本發(fā)明的方法不局限于樣品的狀態(tài)，無(wú)論是生鮮樣本還是對(duì)于dna破壞較嚴(yán)重、提取效率較低的深加工產(chǎn)品，這樣便于對(duì)市場(chǎng)上產(chǎn)品進(jìn)行便捷、有效的監(jiān)管，具有更高的實(shí)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1是普通pcr方法的特異性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖2是普通pcr方法的靈敏性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖3是熒光定量pcr(qpcr)方法的特異性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖4是熒光定量pcr(qpcr)方法的靈敏性檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

dna的提取—酚仿法

(1)取生/熟鵪鶉肉樣本25mg，剪碎，加入500μl細(xì)胞裂解液(0.5％十二烷基硫酸鈉(sds)，0.1mol/l氯化鈉(nacl)，10mmol/l三異丙基乙磺酰鹽酸緩沖液(tris-hcl，ph8.0),1mmol/l乙二胺四乙酸(edta，ph8.0))作用30min，10％蛋白酶k10μl，55℃水浴過(guò)夜。

(2)將消化后的肉樣加入等量體積的tris飽和酚(ph8.0)，緩慢顛倒離心管10min，12000rpm離心10min，用大口徑的槍頭小心吸取上清液至干凈的離心管中。

(3)重復(fù)一次上一步工作。如果上清液清亮透明，此步可以省略。

(4)加入等量的酚:氯仿(1:1)，緩慢顛倒離心管10min，12000rpm離心10min，用大口徑的槍頭小心吸取上清液至干凈的離心管中。

(5)加入等體積的氯仿，緩慢顛倒離心管10min，12000rpm離心10min，用大口徑的槍頭小心吸取上清液至干凈的離心管中。

(6)加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，輕搖離心管，待有白色霧狀沉淀出現(xiàn)停止搖動(dòng)。

(7)用槍頭小心將dna沉淀挑出，置于盛有75％乙醇的離心管中。

(8)將乙醇吸凈，室溫下讓乙醇揮發(fā)干凈(在通風(fēng)櫥中約3小時(shí)，或者室溫過(guò)夜6-8小時(shí))，加入200μl0.1mol/l的naoh溶液溶解，最后適量雙蒸水或te緩沖液稀釋dna。

(9)待dna完全溶解后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果或在分光光度儀上檢測(cè)濃度。

(10)將溶解好的dna置于-20℃保存。

pcr反應(yīng)

引物設(shè)計(jì)

根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)上的鵪鶉的線粒體全基因組序列，找出16srrna的dna序列(見序列表seqidno4)，利用primerexpress3.0程序設(shè)計(jì)引物，最后優(yōu)化出1對(duì)引物進(jìn)行pcr及qpcr擴(kuò)增測(cè)序。

表1pcr及qpcr反應(yīng)引物信息

建立最佳pcr反應(yīng)體系

普通20μlpcr擴(kuò)增反應(yīng)體系，各成分配比如表2。

反應(yīng)程序：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s此過(guò)程經(jīng)過(guò)32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。

表220μlpcr擴(kuò)增體系

pcr產(chǎn)物檢驗(yàn)

1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：

(1)取5μlpcr產(chǎn)物，加1μl上樣緩沖液，上樣。

(2)120v，電泳20min。

(3)照膠并保存膠圖。

特異性檢測(cè)：

利用同一pcr擴(kuò)增體系，同一對(duì)引物對(duì)9個(gè)不同物種dna模板進(jìn)行擴(kuò)增以檢測(cè)引物的特異性。其擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，這對(duì)引物具有較好的特異性，對(duì)鵪鶉以外的其他8個(gè)物種均沒有擴(kuò)增，具有較好的針對(duì)性，能夠作為一種特征引物對(duì)鵪鶉肉樣進(jìn)行特異性檢測(cè)。

靈敏性檢測(cè)：

先測(cè)取所有物種dna的濃度，并稀釋成統(tǒng)一濃度，除鵪鶉dna外，將其他物種dna等比例混勻成干擾dnamix，將目標(biāo)模板dna用混勻的dnamix分別稀釋成10^-1、10^-2、10^-3、一直到10^-8倍。分別使用該引物對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)以考察方法的靈敏性。其pcr檢測(cè)膠圖如圖2所示。

由試驗(yàn)得知，25mg深加工肉樣一般提取的dna在微克級(jí)，經(jīng)稀釋后，我們的檢測(cè)體系可以達(dá)到皮克級(jí)，滿足了市場(chǎng)檢測(cè)的需要，相比于國(guó)外文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)較多的多重pcr鑒定，本研究的方法雖通量較小，但反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果更可靠。

定量pcr

反應(yīng)體系與程序

實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr)對(duì)樣品的dna和陰性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增。整個(gè)反應(yīng)在abi7500序列擴(kuò)增儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件如下所示，試驗(yàn)用的體系見下表。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表3qpcr擴(kuò)增體系

實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)條件為：50℃預(yù)熱2min，95℃預(yù)變性10min，然后95℃變性15s、60℃退火延伸1min，共40個(gè)循環(huán)，最后95℃變性15s，60℃退火延伸30s，95℃變性15s收集熔解曲線。

特異性檢測(cè)結(jié)果見圖3。

靈敏性檢測(cè)結(jié)果見圖4。

由圖中結(jié)果顯示，這對(duì)引物在熒光定量pcr擴(kuò)增體系中仍能取得較好的特性結(jié)果，鵪鶉以外的其他物種的dna擴(kuò)增曲線的ct值均在34以上，可以有效地辨別模板dna的來(lái)源。在靈敏性檢測(cè)中，利用普通pcr同樣的稀釋方法，擴(kuò)增結(jié)果顯示，在稀釋倍數(shù)為10^-7(e^-7)時(shí)，仍能有較好的擴(kuò)增曲線。

基于16srrna鵪鶉肉源成分pcr擴(kuò)增鑒定方法和專用引物

<110>江蘇省家禽科學(xué)研究所

<120>基于16srrna鵪鶉肉源成分pcr擴(kuò)增鑒定方法和專用引物

<160>4

seqidno1

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>基于16srrna鵪鶉肉源成分pcr擴(kuò)增鑒定專用引物對(duì)上游引物

<400>1

aaggataccacaatttaac19

seqidno2

<210>2

<211>17

<212>dna（序列類型，例如：dna、rna或prt）

<213>人工序列（序列來(lái)源的生物名稱）

<220>

<223>基于16srrna鵪鶉肉源成分pcr擴(kuò)增鑒定專用引物對(duì)下游引物

<400>2

agagggaaggtagtgtt17

seqidno3

<210>3

<211>118

<212>dna（序列類型，例如：dna、rna或prt）

<213>人工序列（序列來(lái)源的生物名稱）

<220>

<223>pcr擴(kuò)增產(chǎn)物

<400>3

aaggataccacaatttaacccccttatgtaaagattaagaacaattcgacggaggtacag60

ctccatcgaaaaagaatacaacctcccccagcggataaactaacactaccttccctct118

seqidno4

<210>4

<211>1615

<212>dna（序列類型，例如：dna、rna或prt）

<213>人工序列（序列來(lái)源的生物名稱）

<220>

<223>coturnixjaponicamitochondrialdna中16s1615bp序列

<400>4

tttgccctacctctagcccaaccaacaaatcttcaaaaaatccaaaatcacctcacacag60

tttaattaaaacatttaatcttatcctagtataggcgatagaaccgacccgaggcgcaat120

agagaccaaccgtaccgtaagggaaagatgaaataacaatgaaaaacacaagcaaaaagc180

agtaaagacaaacccttgtacctcttgcatcatgatttagcaagaacaaccaagcaaagc240

ggactaaagcttgccttcccgaaacccaagcgagctacttgcgagcagctaaaattgagc300

gaacccgtctctgtcgcaaaagagtgggatgactcgctagtagaggtgaaaagccaaccg360

agctgggtgatagctggttacctgccaaacgaatctaagttcccccttaatctctcccta420

aaggataccacaatttaacccccttatgtaaagattaagaacaattcgacggaggtacag480

ctccatcgaaaaagaatacaacctcccccagcggataaactaacactaccttccctctct540

ccgtgggccttcaagcagccatcaacaaaagagtgcgtcaaagctcctctactaaaaatc600

cagatactaatttgattccctcatccaaagcaggtcaacctatgacaatagaagaatcaa660

tgctaaaatgagtaacttggaaccttcctctacacagcgtagacttacatcaacacatta720

ttaacagacctaacttatactcacaccacaacaagaactcatatgtctatgatctgttag780

cccaactcaggaacgcccacaagatgattaaaatccgcaaaaggaattcggcaaaccaaa840

gacccgactgtttcccaaaaacatagccttcagcaatcaacaagtattgaaggtgacgcc900

tgcccagtgacccgcaacgttcaacggccgcggtatcctaaccgtgcaaaggtagcgcaa960

tcaattgtcccataaatcgagacttgtatgaatggctaaacgaggtcttaactgtctcct1020

gcagataatcagtgaaattagtatcctcgtgcaaaaacgagaatgtgaccataagacgag1080

aagaccctgtggaactttaaaatcacgaccacccttataattacattcaccccaccgggc1140

acatccacactaacacccttggtcgacatttttcggttggggcgaccttggagaaaaaca1200

aaacctccaaacttacagaccacacctcttaaccaagatccacccatcaaagtcctaaca1260

gtaactagacccaatataattgattaatggaccaagctaccccagggataacagcgcaat1320

ctcctccaagagcccctatcgacaaggaggtttacgacctcgatgttggatcaggacaac1380

ctaatggtgtagccgctattaagggttcgtttgttcaacgattaacagtcctacgtgatc1440

tgagttcagaccggagtaatccaggtcggtttctatctatgaacacactcctcctagtac1500

gaaaggaccggagaagtagggtcaataccacaagcacaccctaaccttccaagcaatgaa1560

ctcaacttaattgccaagaagctcaccatccacttacactcctagaaaaggaaca1615