本發(fā)明屬于動物病毒學(xué)及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體涉及一種檢測豬圓環(huán)病毒3型的引物、試劑盒及方法。
背景技術(shù):
:豬圓環(huán)病毒(porcinecircoviruses,pcv)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,是目前發(fā)現(xiàn)的最小的無囊膜單股環(huán)狀dna病毒,基因組大小約為1.7kb。目前,已經(jīng)確定有兩種類型的pcv,即豬圓環(huán)病毒1型(pcv1)和豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)。pcv1于1974年首次在pk細(xì)胞培養(yǎng)物中作為一種污染物被鑒定,其對豬只沒有致病性。pcv2于1998年首次報道,其在臨床條件下能引起豬只的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcinecircovirusassociateddiseases,pcvad)。主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征,肺炎,豬皮炎腎病綜合癥和繁殖障礙,主要表現(xiàn)為呼吸、泌尿、腸道、淋巴、心血管、神經(jīng)、繁殖系統(tǒng)以及皮膚的功能紊亂,對全世界生豬養(yǎng)殖造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。最近,美國學(xué)者對疑似豬皮炎腎病綜合征癥狀的病料樣本檢測時,常見的pcv2、prv、prrsv、csfv等病原均未檢測到。隨后對其做宏基因組學(xué)分析,其中發(fā)現(xiàn)了一種新的病毒,由于其遺傳結(jié)構(gòu)與圓環(huán)病毒屬非常相似,且其capsid蛋白的氨基酸序列與其他圓環(huán)病毒的同源性小于70%。他們提出了其屬于新型豬圓環(huán)病毒,即豬圓環(huán)病毒3型(porcinecircovirus3,pcv3)(palinskir,p,shangpetal,2016.anovelporcinecircovirusdistantlyrelatedtoknowncircovirusesisassociatedwithporcinedermatitisandnephropathysyndromeandreproductivefailure.jvirol,91(1).doi:10.1128/jvi.01879-16)。隨后,國內(nèi)也報道了pcv3的出現(xiàn)(shenh,liux,zhangpetal,2017.genomecharacterizationofaporcinecircovirustype3insouthchina.transboundemergdis.doi:10.1111/tbed.12639)。研究表明,pcv3能引起豬的皮炎腎病綜合癥、繁殖障礙及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)(phantg,giannittif,rossowsetal,2016.detectionofanovelcircoviruspcv3inpigswithcardiacandmulti-systemicinflammation.virolj,13(1):184.doi:10.1186/s12985-016-0642-z)。而在上述報道病例中,常見的pcv2、prv、prrsv、csfv等病原均未檢測到,表明pcv3是一種重要的病原,需要我們值得警惕。目前,國內(nèi)尚無針對該病毒的特異性pcr檢測方法,國外采用pcr方法對該病毒進(jìn)行檢測,但國外文獻(xiàn)報道的是驗證性引物,不是專門設(shè)計的檢測性引物,運用國外的驗證性引物方法對臨床樣品進(jìn)行檢測時常出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶,影響檢測準(zhǔn)確性,目前報道的pcv3檢測方法有病毒分離鑒定和熒光定量pcr(palinskir,p,shangpetal,2016.anovelporcinecircovirusdistantlyrelatedtoknowncircovirusesisassociatedwithporcinedermatitisandnephropathysyndromeandreproductivefailure.jvirol,91(1).doi:10.1128/jvi.01879-16)。雖然病毒分離培養(yǎng)是鑒定pcv3的金標(biāo)準(zhǔn),但由于病毒分離麻煩繁瑣,需要專業(yè)人員操作、耗時較長、成本高;熒光定量pcr特異性強(qiáng)、靈敏度高,但熒光定量pcr儀器昂貴,探針合成周期長,檢測成本高、不能觀測到擴(kuò)增產(chǎn)物大小等問題。對于基層實驗室,需要進(jìn)行疫病的早期初步診斷及流行病學(xué)調(diào)查,檢測特異性好、周期短、操作簡單的檢測手段會更為實用。可見,現(xiàn)有技術(shù)還需要改善。技術(shù)實現(xiàn)要素:鑒于此,有必要針對上述問題提供一種豬圓環(huán)病毒3型特異性檢測引物、試劑盒及方法,可特異性地擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒3型,快速對臨床樣品進(jìn)行檢測、鑒別。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:一種檢測豬圓環(huán)病毒3型(pcv3)的特異性引物,核苷酸序列如下:上游引物:5’-caaacttctttcgtgccgta-3’(seqidno:1);下游引物:5’-cattacccgcctaaacgag-3’(seqidno:2)。一種檢測豬圓環(huán)病毒3型(pcv3)的試劑盒,所述試劑盒包括上述檢測豬圓環(huán)病毒3型的特異性引物。一種檢測豬圓環(huán)病毒3型的方法包括以下步驟:(1)待檢樣本基因組dna的提取;(2)利用所述的特異性引物,pcr擴(kuò)增步驟(1)中的樣本基因組dna;(3)取步驟(2)中pcr反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定;(4)結(jié)果判定。進(jìn)一步的,所述步驟(2)中pcr反應(yīng)體系為:premixextaq12.5μlseqidno:10.5μlseqidno:20.5μl模板2μl滅菌蒸餾水加至25μl進(jìn)一步的,所述步驟(2)中pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件為:進(jìn)一步的,所述步驟(1)中的樣本包括血清、肺臟、扁桃體和淋巴結(jié)樣本。本發(fā)明有益效果:1、本發(fā)明提供了一對pcr引物,可以特異性地擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒3型,對其他常見病原如豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、日本腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒無反應(yīng)。2、本發(fā)明的檢測豬圓環(huán)病毒3型的方法敏感性高,特異性強(qiáng),操作簡單、成本低、實用,可用于豬圓環(huán)病毒3型的檢測和流行病學(xué)調(diào)查,利于快速制定針對性的防控措施。且目前國內(nèi)尚無針對該病毒的特異性好、快速高效的普通pcr檢測方法。附圖說明圖1為本發(fā)明的樣本pcr擴(kuò)增電泳結(jié)果。其中泳道1為陽性血清樣本,泳道2為陰性對照。圖2為本發(fā)明的pcr特異性試驗結(jié)果。其中泳道1為血清陽性樣本,泳道2-8分別為豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、日本腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒,泳道9為陰性對照。圖3為本發(fā)明的pcr敏感性試驗結(jié)果。其中泳道1-7代表的dna濃度分別為1.72μg/μl、172ng/μl、17.2ng/μl、1.72ng/μl、172fg/μl、17.2fg/μl、1.72fg/μl。圖4為實施例1檢測結(jié)果。其中泳道1為豬陽性血清樣品,泳道2為豬肺臟樣本1,泳道3為豬扁桃體樣本2,泳道4豬淋巴結(jié)樣本3,泳道5為陰性對照。具體實施方式為了更好地說明本發(fā)明所解決的問題、所采用的技術(shù)方案和所達(dá)到的效果,現(xiàn)結(jié)合具體實施例和相關(guān)資料進(jìn)一步闡述。需要說明的是,本
發(fā)明內(nèi)容包含但不限于以下實施例及其組合實施方式。以下實施例中涉及的實驗材料如無特殊說明,均來源于市售,以下實施例中所采用的操作均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)操作。實施例1一種檢測豬圓環(huán)病毒3型的引物和方法1、一種豬圓環(huán)病毒3型的pcr檢測引物對ncbi登陸的豬圓環(huán)病毒3型毒株cap基因序列(登錄號:ky354038、ky354039、kx458235、nc-031753、kx778720和kx966193)比對分析,cap基因編碼pcv3的核衣殼蛋白,是決定pcv3免疫原性的基因,它是對pcv3病原進(jìn)行pcr檢測的首選分子基因,通過oligo7軟件設(shè)計了以下pcr特異性引物:上游引物:5’-caaacttctttcgtgccgta-3’(seqidno:1);下游引物:5’-cattacccgcctaaacgag-3’(seqidno:2)。使用上述引物可特異性的擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒3型。2、一種豬圓環(huán)病毒3型的pcr檢測方法(1)待檢樣本基因組dna的提?。?00μl陽性血清和臨床3份各100mg病料(病料1為肺臟樣本,病料2為扁桃體樣本,病料3為淋巴結(jié)樣本)樣本作為待檢樣本,分別進(jìn)行以下操作:病料樣本加入1mlpbs緩沖液進(jìn)行充分研磨,-20℃反復(fù)凍融3次,8000rpm離心10min,取上清液200μl,用axygenaxypeptmbodyfluidviraldna/rnaminiprepkit進(jìn)行dna抽提,抽提按照試劑盒說明書進(jìn)行,最后加40μl的te進(jìn)行洗脫,洗脫后的dna放于-20℃保存。所述陽性血清樣本測序結(jié)果為:(2)將含有上述提取的樣本基因組dna的pcr反應(yīng)體系置于pcr管內(nèi)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。其中pcr反應(yīng)體系為:premixextaq12.5μlseqidno:1(20pmol/μl)0.5μlseqidno:2(20pmol/μl)0.5μl樣本基因組dna2μl滅菌蒸餾水加至25μl(3)將步驟(2)的pcr管置于pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。其中擴(kuò)增反應(yīng)條件為:(4)分別取10μlpcr反應(yīng)產(chǎn)物在2%(質(zhì)量比)的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳鑒定。(5)結(jié)果判定:如果擴(kuò)增出的片段大小在426bp左右則為陽性,無條帶則為陰性。電泳圖見圖4,檢測結(jié)果見表1。表1待檢樣本檢測結(jié)果待檢樣本結(jié)果判定陽性血清樣本陽性病料樣本1陽性病料樣本2陽性病料樣本3陽性實施例2特異性檢驗以陽性血清樣本dna作為陽性對照,以無菌蒸餾水為陰性對照,分別按實施例1步驟(2)、(3)進(jìn)行擴(kuò)增,按步驟(4)方法做電泳鑒定,結(jié)果如圖1所示。以檢測陽性的血清樣本作為陽性對照,對豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、日本腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒進(jìn)行特異性檢測,使用實施例1的方法與引物,結(jié)果除陽性對照在426bp處有條帶,其他均無條帶(見圖2)。實施例3敏感性檢驗將實施例1中血清樣本提取的基因組dna用滅菌蒸餾水做10倍的梯度稀釋,dna含量分別為1.72μg/μl、172ng/μl、17.2ng/μl、1.72ng/μl、172fg/μl、17.2fg/μl、1.72fg/μl作為模板,每個稀釋度各取2μl作為模板,按實施例1方法進(jìn)行檢測和電泳鑒定,觀察陽性條帶,以出現(xiàn)陽性預(yù)期條帶所用模板量的最高稀釋度計算其敏感性,結(jié)果表明最小檢出量為3.44fg(見圖3)。目前報道的pcv3檢測方法有病毒分離鑒定和熒光定量pcr。但由于病毒分離麻煩繁瑣,需要專業(yè)人員操作、耗時較長、成本高,及熒光定量pcr儀器昂貴,探針合成周期長,檢測成本高、不能觀測到擴(kuò)增產(chǎn)物大小等問題。與這些相比,本檢發(fā)明的測方法操作簡單、技術(shù)要求低、成本低和檢測引物特異性好、靈敏度高等優(yōu)點,適合于在基層實驗室應(yīng)用推廣,可用于pcv3的臨床檢測及流行病學(xué)調(diào)查。以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式,其描述較為具體和詳細(xì),但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是,對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干變形和改進(jìn),這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此,本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。<110>廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司<120>一種檢測豬圓環(huán)病毒3型的引物、試劑盒及方法<160>2<170>oligo7<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1caaacttctttcgtgccgta20<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2cattacccgcctaaacgag19當(dāng)前第1頁12