本發(fā)明屬于病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合側(cè)向流動(dòng)試紙條檢測錦鯉皰疹病毒。

背景技術(shù)：

錦鯉皰疹病毒病(koiherpesvirusdisease，khvd)于1998年5月在以色列首次發(fā)現(xiàn)，到1999年才確認(rèn)其病原為錦鯉皰疹病毒(koiherpesvirus，khv)，又稱鯉皰疹病毒iii型(cyhv-3)。該病隨后在美國、印尼、英國、歐洲大陸、日本等地區(qū)都有大面積爆發(fā)。

khv主要感染錦鯉、鯉魚及其普通變種。潛伏感染khv的魚體并不表現(xiàn)出臨床癥狀，水溫適宜時(shí)會(huì)暴發(fā)和死亡。該病具有高度傳染性和極強(qiáng)致死率，不僅可以水平傳染，也會(huì)垂直傳播。近年來給我國錦鯉、鏡鯉、普通鯉魚的養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國農(nóng)業(yè)部、國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局聯(lián)合公告第2013號公布的《中華人民共和國進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病名錄》里將其列為二類動(dòng)物疫病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)將其列為必須申報(bào)的疾病。因此，做好khv的檢測與監(jiān)控工作是控制khv傳播的首要工作。錦鯉皰疹病毒早期檢測是降低其流行風(fēng)險(xiǎn)、減少其發(fā)病導(dǎo)致巨額經(jīng)濟(jì)損失的有效手段，所以建立簡單、快速、高靈敏的檢查方法，并開發(fā)適用于現(xiàn)場應(yīng)用的錦鯉皰疹病毒檢測試劑盒顯得尤為重要。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)技術(shù)是notomi等于2000年報(bào)道的一種新型等溫核酸擴(kuò)增方法(國際專利公開號wo00/28082)，針對靶基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)4條lamp引物，利用一種具有鏈置換活性的dna聚合酶(bstdna聚合酶)，在恒溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增靶序列，適合于現(xiàn)場和實(shí)驗(yàn)條件較簡單的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快捷檢測。引入一對環(huán)狀引物的改進(jìn)方法，進(jìn)一步縮短了反應(yīng)時(shí)間。

橫向流動(dòng)試紙條(lateralflowdipstick，lfd)是一種新的檢測方法，反應(yīng)中fitc標(biāo)記的探針與生物素標(biāo)記的lamp擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交，避免了瓊脂糖凝膠電泳或熒光染料染色肉眼觀察由非特異性擴(kuò)增造成的假陽性，進(jìn)一步提高了反應(yīng)的特異性和靈敏度。lfd檢測無需特殊的設(shè)備，操作者只需將產(chǎn)物和試紙條浸入緩沖液，并且不需有毒試劑，操作簡便且更安全。lamp-lfd結(jié)合技術(shù)的檢測結(jié)果可以直接肉眼觀察。lfd試紙條上具有控制帶和檢測帶，兩條帶均顯色表示檢測結(jié)果為陽性，只有控制帶顯色檢測帶不顯色表明檢測結(jié)果為陰性。lamp-lfd結(jié)合方法安全、快捷、高效、高靈敏度，且無設(shè)備及技術(shù)限制，具有其他技術(shù)所無法替代的優(yōu)勢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明一個(gè)目的是提供一種檢測錦鯉皰疹病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增成套引物。

本發(fā)明提供的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增成套引物，由上游外引物、下游外引物、上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物組成；

所述上游外引物的核苷酸序列為序列1；

所述下游外引物的核苷酸序列為序列2；

所述上游內(nèi)引物的核苷酸序列為序列3；

所述下游內(nèi)引物的核苷酸序列為序列4。

上述成套引物中，所述上游外引物、所述下游外引物、所述上游內(nèi)引物和所述下游內(nèi)引物的摩爾比為1:1:8:8；

或所述上游內(nèi)引物或所述下游內(nèi)引物生物素的5’端標(biāo)記生物素。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種檢測錦鯉皰疹病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑。

本發(fā)明提供的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，包括上述的成套引物、pcr擴(kuò)增緩沖液和dna聚合酶；

所述上游外引物和所述下游外引物的濃度均為0.2μmol/l；

所述上游內(nèi)引物和所述下游內(nèi)引物的濃度均為1.6μmol/l。

本發(fā)明第3個(gè)目的是提供一種檢測錦鯉皰疹病毒的試劑。

本發(fā)明提供的試劑，由上述的成套引物和探針組成；

所述探針的核苷酸序列為序列5，

或所述探針的5'端末端異硫氰酸熒光素fitc標(biāo)記。

本發(fā)明第4個(gè)目的是提供一種檢測錦鯉皰疹病毒的試劑盒，包括上述的成套引物或上述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或上述的試劑。

上述的成套引物或上述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或上述的試劑或上述的試劑盒在檢測或輔助檢測錦鯉皰疹病毒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或，上述的成套引物或上述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或上述的試劑或上述的試劑盒在制備檢測或輔助檢測錦鯉皰疹病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述的成套引物或上述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或上述的試劑或上述的試劑盒在檢測或輔助檢測待測樣本是否感染錦鯉皰疹病毒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或，上述的成套引物或上述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或上述的試劑或上述的試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣本是否感染錦鯉皰疹病毒產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明第5個(gè)目的是提供一種檢測或輔助檢測待測樣本是否感染錦鯉皰疹病毒的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1)用上述的成套引物對待測樣本進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，得到環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物；

2)用上述的試劑中的所述探針雜交所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，得到雜交產(chǎn)物；

3)側(cè)向流動(dòng)試紙條檢測所述雜交產(chǎn)物，若所述試劑條的檢測帶顯色2條，則所述待測樣本感染或候選感染khv，若所述試劑條的檢測帶顯色1條，則所述待測樣本未感染或候選未感染khv。

本發(fā)明第6個(gè)目的是提供一種檢測或輔助檢測待測樣本是否感染錦鯉皰疹病毒的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1)用上述的成套引物對待測樣本進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，得到環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物；

2)電泳檢測所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，若含有擴(kuò)增產(chǎn)物，則所述待測樣本感染或候選感染khv，若不含有所述擴(kuò)增產(chǎn)物，則所述待測樣本未感染或候選未感染khv。

上述方法中，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的模板為待測樣本的基因組dna或khv基因組dna或者含有khv特異基因片段的物質(zhì)。

上述方法中，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的條件為63℃水浴45min；

或所述雜交的條件63℃雜交5min。

本發(fā)明所提供的khv的lamp-lfd檢測方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：

一、高靈敏度，對khv的檢測最低限可至320pg，其檢測靈敏度比傳統(tǒng)pcr的檢測靈敏度高10倍；

二、強(qiáng)特異性，所用的特異性引物根據(jù)khv的tk基因中的六個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)，并加入特異序列做為dna特異性探針；

三、檢測時(shí)間短，50分鐘左右可獲得檢測結(jié)果，比常規(guī)pcr檢測時(shí)間節(jié)省2-4h；

四、儀器設(shè)備要求低，不需要pcr儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)，只需一個(gè)恒溫加熱器即可完成檢測；

五、操作簡便、結(jié)果明顯，整個(gè)檢測過程不涉及復(fù)雜昂貴儀器設(shè)備，稍具有分子生物學(xué)基礎(chǔ)的人員即可完成整個(gè)操作，可直接通過肉眼觀察即判別，檢測結(jié)果清晰明顯；

六、對實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境更友好，檢測過程不需要進(jìn)行凝膠電泳，故不使用有毒試劑。

本發(fā)明具有比現(xiàn)有傳統(tǒng)pcr技術(shù)檢測khv的方法具有更高的特異性、靈敏度、實(shí)用性及便捷性，可以在實(shí)際野外現(xiàn)場即時(shí)檢測，有利于預(yù)防控制錦鯉皰疹病毒的爆發(fā)，對保護(hù)我國水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。

附圖說明

圖1為khv-tk基因的lamp-lfd引物和探針設(shè)計(jì)示意圖，引物和探針由橫線標(biāo)出。

圖2為lamp檢測khv的靈敏度。

m為200bpdnamarker,0為陰性對照，1泳道為1(模板濃度32ng/μl)，2-5依次為10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍濃度基因組dna。

圖3為lamp-lfd檢測khv靈敏度。

m為200bpdnamarker,0為陰性對照，1泳道為1(模板濃度32ng/μl)，2-5依次為10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍濃度基因組dna。

圖4為lamp檢測khv的特異性。

m為200bpdnamarker，0為陰性對照，1-3依次為：以khv、鯉春病毒血癥病毒(springviraemiaofcarpvirus，svcv)、草魚呼腸孤病毒(grasscarpreovirus，gcrv)特異基因重組質(zhì)粒作為模板的lamp反應(yīng)產(chǎn)物。

圖5為lamp-lfd檢測khv的特異性。

m為200bpdnamarker，0為陰性對照，1-3依次為：以khv、鯉春病毒血癥病毒(springviraemiaofcarpvirus，svcv)、草魚呼腸孤病毒(grasscarpreovirus，gcrv)特異基因重組質(zhì)粒作為模板的lamp反應(yīng)產(chǎn)物。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括以下三個(gè)部分：

1)提供2對用于khv的lamp引物序列，即長度分別為19bp、18bp、38bp、38bp、17bp和20bp的寡核苷酸序列，依次命名為khv-tk-f3、khv-tk-b3、khv-tk-fip、khv-tk-bip；

2)配制lamp反應(yīng)體系，通過lamp反應(yīng)程序?qū)悠纺０暹M(jìn)行擴(kuò)增，確定最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件；

3)設(shè)計(jì)khv-tk-hp為dna探針，結(jié)合lfd技術(shù)對lamp擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

khv記載在如下文獻(xiàn)中：rahmati‐holasooh,zargara,ahmadivands,etal.firstdetectionofkoiherpesvirusfromkoi,cyprinuscarpiol.experiencingmassmortalitiesiniran:clinical,histopathologicalandmolecularstudy[j].journaloffishdiseases,2016,39(10):1153-1163。

svcv記載在如下文獻(xiàn)中：shivappar,kozlowiczs,rollandj,etal.springviremiaofcarpintheunitedstatesofamerica:evaluationofcurrentdiagnostics[j].diseasesinasianaquaculturevi.fishhealthsection,asianfisheriessociety,manila,philippines,2008:143-156。

gcrv記載在如下文獻(xiàn)中jabbara,narankhajidm,nolanmj,etal.afirstinsightintothegenotypesofechinococcusgranulosusfromhumansinmongolia[j].molecularandcellularprobes,2011,25(1):49-54。

實(shí)施例1、lamp-lfd技術(shù)檢測khv方法建立

一、lamp引物的設(shè)計(jì)

對ncbi中公開的khv的tk基因(ab375390)進(jìn)行同源性分析后，并比較了與khv近似種的tk基因的序列，從而設(shè)計(jì)和篩選出下面2對引物，以及一條探針，序列如下：

khv-tk-f3：5'-tggacggggactttatgca-3'(序列1)；

khv-tk-b3：5'-agacagggacgacacacc-3'(序列2)；

khv-tk-fip：

5'-bio-ttcatgcacaccgccgtcaggcagcccttcaagcaggt-3'(序列3)；

khv-tk-bip：

5'-acgcacccttcaccgtcaga-aagactcggcgcctccaa-3'(序列4)；

khv-tk-hp：5'-fitc-gtgcaagatgcgcgacgcac-3'(序列5)。

其中khv-tk-fip為5'端生物素標(biāo)記引物，khv-tk-hp為5'端異硫氰酸熒光素fitc標(biāo)記探針；

khv的tk基因lamp擴(kuò)增引物序列位置如圖1(f1，f2，f3，b1，b2，b3)注：fip為f2與f1c(f1c為f1互補(bǔ)序列)相連所得，bip為b2與b1c(b1c為b1互補(bǔ)序列)相連所得。所示。按照上述引物序列，在上海生工公司進(jìn)行l(wèi)amp引物合成。

二、lamp擴(kuò)增及條件優(yōu)化

提取錦鯉皰疹病毒病(koiherpesvirusdisease，khvd)的重組質(zhì)粒dna作為模板進(jìn)行擴(kuò)增條件優(yōu)化。

首先配制具有最佳擴(kuò)增效率和檢測特異性的反應(yīng)體系。本發(fā)明中的lamp反應(yīng)體系為：各引物濃度為：fip-bio和bip各1.6μmol/l，f3和b3各0.2μmol/l；1×緩沖液組成及濃度為：20mmol/ltris-hcl(ph8.8)、50mmol/lkcl、2mmol/lmgso4、10mmol/l(nh4)2so4、0.1％的tween-20，6mmolmgso4，1.4mmol/ldntps，8ubstdna聚合酶和1-2μl樣品dna模板，加雙蒸水使反應(yīng)體系總體積為25μl。lamp反應(yīng)體系見表1。

表1lamp反應(yīng)體系

將上述lamp反應(yīng)體系在如下條件下lamp反應(yīng)，得到lamp反應(yīng)產(chǎn)物：

65℃恒溫水浴60min進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，之后80℃水浴5min終止反應(yīng)。在反應(yīng)過程中，擴(kuò)增溫度過高或過低都不利于lamp反應(yīng)。應(yīng)用本發(fā)明提供的引物和采用本發(fā)明確定的反應(yīng)體系，分別比較不同溫度(61℃、63℃、65℃)條件下對lamp反應(yīng)的影響，通過瓊脂糖凝膠電泳法最終確定最佳反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)所需溫度。

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析最終選擇63℃，45min作為后續(xù)lamp擴(kuò)增的最佳反應(yīng)條件。

三、lfd檢測

lamp擴(kuò)增結(jié)束后，向反應(yīng)管內(nèi)加入2μl10mmol/l的hp探針(使其在反應(yīng)管中的終濃度為0.8mmol/l)，63℃雜交5min，得到雜交反應(yīng)產(chǎn)物。

取10μl雜交反應(yīng)產(chǎn)物加入到lfd試紙條(杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司，貨號：d003-03)樣品墊上，并將lfd試紙條垂直浸入100μlbuffer溶液(試劑盒中自帶)中，觀察試紙條檢測帶是否顯色。

如果檢測帶顯色2條則表示該樣品中khv的檢測結(jié)果為陽性，即感染khv或候選感染khv，如果顯色一條則表示該樣品khv的檢測結(jié)果為陰性，即未感染khv或候選未感染khv。

實(shí)施例2、lamp-lfd檢測khv靈敏度的評價(jià)

將khv的基因組dna模板原始濃度(32ng/μl)按10倍梯度稀釋，分別做為反應(yīng)模板。

分別用lamp、lamp-lfd對khv進(jìn)行檢測比較靈敏度。

lamp檢測：以上述梯度稀釋的基因組dna為模板，用實(shí)施例1中的二的lamp擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

如果電泳檢測有擴(kuò)增產(chǎn)物，則該樣品中khv的檢測結(jié)果為陽性，即感染khv或候選感染khv，如果電泳檢測無擴(kuò)增產(chǎn)物，則表示該樣品khv的檢測結(jié)果為陰性，即未感染khv或候選未感染khv。

結(jié)果見圖2所示，可以看出，lamp反應(yīng)產(chǎn)物量隨模板濃度(10^-2、10^-3、10^-4、10^-5)降低而減少，其檢測到的最低模板濃度為10^-5倍稀釋濃度。

lamp-lfd檢測：以上述梯度稀釋的基因組dna為模板，用實(shí)施例1中的二中的lamp擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；再按照實(shí)施例1中的三中的方法向lamp擴(kuò)增產(chǎn)物中加入hp探針繼續(xù)反應(yīng)，得到雜交反應(yīng)產(chǎn)物。試紙條檢測雜交反應(yīng)產(chǎn)物。

如果檢測帶顯色2條則表示該樣品中khv的檢測結(jié)果為陽性，即感染khv或候選感染khv，如果顯色一條則表示該樣品khv的檢測結(jié)果為陰性，即未感染khv或候選未感染khv。

結(jié)果見圖3所示，可以看出，lamp反應(yīng)產(chǎn)物量隨模板濃度降低而減少，檢測線顏色逐級變淺，以此方法能夠檢測到的最低模板濃度為10^-2倍稀釋濃度。

從上述可以看出，khv基因組dna模板10倍梯度稀釋實(shí)驗(yàn)證明，lamp-lfd最低稀釋濃度為10^-2，lamp檢測的最低稀釋濃度為10^-5，模板濃度為320pg/μl。上述結(jié)果表明本發(fā)明的引物組能夠保證檢測時(shí)的靈敏性。

實(shí)施例3、lamp-lfd檢測對khv特異性的評價(jià)

分別以含khv特異基因的質(zhì)粒dna、含svcv特異基因的質(zhì)粒dna、含gcrv特異基因的質(zhì)粒dna作為模板，以雙蒸水為模板作為陰性對照。

含khv特異基因的質(zhì)粒dna為將khv的特異片段(ncbi登錄號：ab375390，序列6)插入puc57載體中的smai位點(diǎn)得到的質(zhì)粒。

含svcv特異基因的質(zhì)粒dna為將svcv的特異片段(ncbi登錄號：ay527273序列7)插入puc57載體中的smai位點(diǎn)得到的質(zhì)粒。

含gcrv特異基因的質(zhì)粒dna為將gcrv的特異片段(ncbi登錄號：hq231204序列8)插入puc57載體中的smai位點(diǎn)得到的質(zhì)粒。

用實(shí)施例1中的二的lamp擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增，得到lamp擴(kuò)增產(chǎn)物；再按照實(shí)施例1中的三中的方法向lamp擴(kuò)增產(chǎn)物中加入hp探針繼續(xù)反應(yīng)，得到雜交反應(yīng)產(chǎn)物。

1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測lamp擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖4所示，可以看出，以khv為模板的反應(yīng)呈陽性，而以svcv，gcrv為模板的反應(yīng)呈陰性，以雙蒸水為模板的反應(yīng)也呈陰性。

試紙條檢測雜交反應(yīng)產(chǎn)物，如果檢測帶顯色2條則表示該樣品中khv的檢測結(jié)果為陽性，即感染khv或候選感染khv，如果顯色一條則表示該樣品khv的檢測結(jié)果為陰性，即未感染khv或候選未感染khv。

結(jié)果如圖5所示，可以看出，以khv為模板的反應(yīng)呈陽性，檢測線顯紅色條帶，而以svcv，gcrv為模板的反應(yīng)呈陰性，以雙蒸水為模板的反應(yīng)也呈陰性，檢測線均無變化。

上述結(jié)果表明，說明本發(fā)明提供的khv的lamp-lfd檢測方法能保證只對khv具有特異性，不與其它水產(chǎn)病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。

序列表

<110>河北農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合側(cè)向流動(dòng)試紙條檢測錦鯉皰疹病毒

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tggacggggactttatgca19

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

agacagggacgacacacc18

<210>3

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ttcatgcacaccgccgtcaggcagcccttcaagcaggt38

<210>4

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

acgcacccttcaccgtcagaaagactcggcgcctccaa38

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gtgcaagatgcgcgacgcac20

<210>6

<211>997

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

aacgcgggccagctgaacatttttgtgaagttgacaggtttgacaaagtgttgagagggc60

ccgtgatgccaaccacttaatcgcgaggtttcgcgcagctcctagagccgcgctgcgggc120

cctacgcctctctttatctcgcagccgcaccaccgccgcacactctgaaaaaggatggct180

atgctggaactggtgatcggacccatgttcgcgggcaagagcacagagagctgcaggcgg240

ctggagcgtctgtcctacagcgggcgacgctgcatcgccgtcaagcacgccatagaccag300

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