本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種番茄內(nèi)源h2s產(chǎn)生直接相關(guān)的酶編碼基因及其在產(chǎn)生無籽番茄過程中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

種子形成是植物發(fā)育過程中的重要過程，有性繁育的植物經(jīng)過授粉和受精過程，由胚珠發(fā)育而來。同時可以利用植物的繁殖方式和遺傳變異特點(diǎn)來保持其優(yōu)良品種。無籽是一個優(yōu)良的果實(shí)性狀。無籽果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良，可食率高，更易吸引消費(fèi)者購買。無籽果實(shí)的產(chǎn)生可以提高果實(shí)品質(zhì)，達(dá)到較高的無核率，增加果粒的大小，從而最大程度保持果實(shí)中的有益物質(zhì)，獲得優(yōu)良的蔬果品種，提高市場售價(jià)和種植收益，有利于保護(hù)遺傳改良的作物特別是一年生作物品種不被改變。

番茄營養(yǎng)豐富，含有豐富的胡蘿卜素，b族維生素，維生素c和番茄紅素，可以生食，煮食，也可以加工成番茄醬，番茄汁等產(chǎn)品。番茄中的茄紅素是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，具有極強(qiáng)的清除自由基的能力，對防治前列腺癌，乳腺癌等有顯著效果，還有預(yù)防心腦血管疾病，提高免疫力和延緩衰老等功效，是自然界中最強(qiáng)的抗氧化劑之一。其抗氧化作用是β胡蘿卜素的2倍，是維生素e的100倍。同時，番茄無籽果實(shí)的可溶性固形物和糖的含量要比有籽品種高，而酸與纖維素的含量則低于有籽品種。

關(guān)于無籽番茄的獲得，通常是為果實(shí)施用一定濃度的植物激素，如在授粉前人工涂抹生長素或者生長素類似物，促進(jìn)子房發(fā)育成果實(shí)，即抑制種子發(fā)育的同時促進(jìn)果實(shí)發(fā)育，同時，其細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)并沒有發(fā)生變化。隨著分子生物學(xué)技術(shù)日新月異的發(fā)展，基因工程技術(shù)也得到了飛速的發(fā)展，通過基因編輯方法獲得無籽果實(shí)已成為可能。h2s較早被證實(shí)可以打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)。lcd是植物中以l-cys為底物，產(chǎn)生內(nèi)源h2s直接相關(guān)的酶編碼基因(papenbrocketal.，2007)，與動物的cse屬一類。番茄編碼區(qū)基因sllcd突變體中，果實(shí)正常發(fā)育，產(chǎn)生無籽表型，且番茄葉和心皮等器官中sllcd基因表達(dá)水平下降，說明抑制sllcd基因有利于無籽番茄的獲得。目前，lcd與無籽果實(shí)獲得的機(jī)理仍未報(bào)道，值得被進(jìn)一步研究。

植物體內(nèi)h2s的生成酶比動物細(xì)胞豐富，定位于細(xì)胞質(zhì)，線粒體和葉綠體等多個亞細(xì)胞部位，表達(dá)具有時空性。內(nèi)源產(chǎn)生的h2s參與了植物體生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等過程，同時發(fā)現(xiàn)h2s和活性氧，no，co，ca²⁺，以及脫落酸，茉莉酸，赤霉素，生長素，乙烯等植物激素信號路徑存在相互作用。植物體內(nèi)以cys為底物產(chǎn)生h2s的酶有多種，目前對這些酶類研究最深入的植物是擬南芥，已經(jīng)被鑒定出的酶類根據(jù)其功能主要分為4大類。即半胱氨酸脫巰基酶，半胱氨酸脫硫酶，β-氰丙氨酸合酶和o-乙酰絲氨酸硫醇裂解酶。鑒于l-cys是植物體內(nèi)cys的主要存在形式，推測以l-cys為底物的cdes是內(nèi)源h2s生成的主要貢獻(xiàn)者。最新的研究表明，h2s可以對蛋白質(zhì)的活性cys殘基進(jìn)行巰基化修飾，這可能是其參與各項(xiàng)生命活動的重要作用方式之一(pei，2016)。目前，其他內(nèi)源h2s產(chǎn)生相關(guān)的酶基因，在番茄果實(shí)成熟和種子發(fā)育等過程中的功能還未知。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供番茄sllcd編碼基因；

本發(fā)明的另一目的在于提供所述基因所編碼的番茄sllcd蛋白；

本發(fā)明的目的還在于提供含有所述基因或其片段的載體及其宿主細(xì)胞；

本發(fā)明的最終目的在于提供所述基因或其片段在調(diào)節(jié)番茄種子發(fā)育中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供番茄sllcd編碼區(qū)基因，該基因是從番茄microtom(以下簡稱mt)中克隆得到的，屬于內(nèi)源h2s產(chǎn)生直接相關(guān)的酶編碼基因，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供上述基因編碼的番茄sllcd蛋白，其為：

1)由seqidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白；或

2)seqidno.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的衍生蛋白。

序列分析結(jié)果顯示，番茄sllcd基因?qū)儆趌型半胱氨酸脫巰基酶(以下簡稱lcd)編碼基因，由該基因所編碼的蛋白可以以l型半胱氨酸為底物產(chǎn)生內(nèi)源h2s。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，由該基因所編碼的蛋白同擬南芥中l(wèi)cd的相似性為63％；番茄sllcd基因在萼片、花瓣、雄蕊等器官中表達(dá)較弱，在葉片中表達(dá)較強(qiáng)，通過精細(xì)分析后發(fā)現(xiàn)，該基因在心皮中的表達(dá)最強(qiáng)。

應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。本發(fā)明的番茄sllcd蛋白還包括seqidno.2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有番茄sllcd蛋白同等活性的由番茄sllcd蛋白衍生得到的蛋白。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。

本發(fā)明還提供含有上述番茄sllcd基因或其片段的載體，以及含有該載體的宿主細(xì)胞；所述載體為所述番茄sllcd基因或其片段的克隆載體或各類表達(dá)載體；所述片段是指番茄sllcd基因cdna的一段3’端序列，其核苷酸序列如seqidno.5所示。

具體地說，本發(fā)明將番茄sllcd基因cdna的一段3’端序列(400bp，其核苷酸序列如seqidno.5所示)首先反向構(gòu)建到中間載體pkannibal中，最終構(gòu)建到雙元載體part27中，并在大腸桿菌dh5α中擴(kuò)繁。

本發(fā)明還通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，將part27攜帶的sllcd編碼區(qū)基因cdna的3’端序列轉(zhuǎn)入番茄，獲得番茄轉(zhuǎn)化植株。

本發(fā)明的番茄sllcd編碼區(qū)基因在調(diào)節(jié)番茄種子發(fā)育中的應(yīng)用。所述應(yīng)用是指通過抑制番茄sllcd編碼區(qū)基因的表達(dá)，產(chǎn)生沒有種子或種子發(fā)育不完全的轉(zhuǎn)基因植株，從而保護(hù)各種番茄作物的編碼區(qū)基因優(yōu)勢以及番茄果實(shí)的優(yōu)良性狀。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明的番茄sllcd基因，其屬于內(nèi)源h2s產(chǎn)生直接相關(guān)的酶編碼基因，在番茄中抑制sllcd編碼區(qū)基因的表達(dá)能夠明顯影響到番茄種子的發(fā)育，產(chǎn)生沒有種子或種子發(fā)育不完全的轉(zhuǎn)基因植株；可用于保護(hù)各種番茄作物的編碼區(qū)基因優(yōu)勢；而且，在sllcd轉(zhuǎn)基因植株中，果實(shí)發(fā)育不受影響，因此可以保持番茄果實(shí)的優(yōu)良性狀；說明sllcd在發(fā)育過程中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的番茄sllcd編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的克隆載體pet28a；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3的克隆中間載體pkannibal；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例3的植物表達(dá)載體part27；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例4的番茄sllcd基因影響番茄種子發(fā)育圖；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例4的番茄sllcd轉(zhuǎn)基因植株中的無籽表型圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例5的番茄sllcd基因的表達(dá)譜；其中，sd，幼苗；r，根；s，莖；l，葉；se，萼片；pe，花瓣；sta，雄蕊；ca，心皮；img，未成熟綠果；mg，成熟綠果；b，破果期果實(shí)，rf，成熟期果實(shí)。

圖8是本發(fā)明實(shí)施例6的番茄sllcd基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平；其中，1，2，4代表不同的轉(zhuǎn)基因株系；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例7的番茄sllcd基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平；其中，1，2，4，5，6，7代表不同的轉(zhuǎn)基因株系。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1番茄sllcd編碼區(qū)基因的克隆

利用核苷酸序列如seqidno.3所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.4所示的反向引物，從番茄mt的心皮cdna中克隆sllcd基因的編碼區(qū)序列；

pcr程序：94℃，5分鐘；94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1分30秒；重復(fù)35次；72℃，10分鐘。

將上述pcr產(chǎn)物通過雙酶切的方法連接到克隆載體pet28a上(如圖2所示)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，并在其中擴(kuò)繁，陽性克隆經(jīng)過測序篩選獲得番茄sllcd基因的編碼區(qū)cdna序列，其核苷酸序列如seqidno.1所示，由其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如seqidno.2所示。

實(shí)施例2番茄sllcd蛋白的序列結(jié)構(gòu)分析

番茄sllcd具有產(chǎn)生內(nèi)源h2s的功能，同擬南芥中l(wèi)cd編碼區(qū)蛋白序列的相似性為63％。結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例3番茄sllcd基因表達(dá)載體及轉(zhuǎn)基因植株

番茄內(nèi)源h2s產(chǎn)生酶相關(guān)基因sllcd的一段3’端序列(400bp，其核苷酸序列如seqidno.5所示)，反向構(gòu)建在圖4所示的中間載體part27中，用于利用rna干擾的原理在番茄中抑制sllcd的表達(dá)水平，進(jìn)而研究其功能。

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，將part27攜帶的sllcd基因cdna的3’端序列轉(zhuǎn)入番茄，以番茄種子無菌播種后的子葉為受體，獲得番茄轉(zhuǎn)化植株，植物中的篩選標(biāo)記為卡那霉素。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法和步驟如下：

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄的方法和步驟如下：

1.種子準(zhǔn)備

將1.5g番茄種子依次經(jīng)95％乙醇清洗，20％次氯酸鈉消毒和無菌水清洗后，將種子均勻放置于1/2mso培養(yǎng)基表面，在24℃培養(yǎng)間長光照(16h光照，8h黑暗)培養(yǎng)6天。

2.外植體準(zhǔn)備

當(dāng)子葉從種皮中長出后，用鋒利的解剖刀將子葉切成25mm²大小，并將子葉近軸面向上放置在盛有濾紙(whatmanfilterpaper)的d1培養(yǎng)基的表面(注意無菌操作)；于24℃培養(yǎng)間長光照(16h光照，8h黑暗)培養(yǎng)2天。

3.農(nóng)桿菌準(zhǔn)備

固體培養(yǎng)基上活化-80℃存放的農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens，eha105)，挑單克隆至相應(yīng)抗性的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至od600處于0.6～0.7之間，收集菌體，mso清洗懸浮并加入乙酰丁香酮(as)制備成侵染液。

4.共培養(yǎng)

用上一步制成的侵染液侵染子葉，侵染完成后將子葉遠(yuǎn)軸端朝上培養(yǎng)于新的盛有濾紙和d1培養(yǎng)基的新培養(yǎng)皿中，在24℃培養(yǎng)間放置2天(16h光照，8h黑暗)。

5.選擇轉(zhuǎn)化愈傷

將子葉轉(zhuǎn)移至ci培養(yǎng)基上(沒有濾紙)。約10天更換一次培養(yǎng)基，直至有芽出現(xiàn)后轉(zhuǎn)移至si選擇性培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，約兩周更換一次培養(yǎng)基。

6.生根

當(dāng)再生苗至少有2cm長并包含至少一個生長點(diǎn)的時候，可從外植體上切下再生苗(不包括愈傷組織)，將再生苗放入mmsv培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

生根后的植株生長到足夠大時，就可轉(zhuǎn)移至裝有蛭石和營養(yǎng)土的培養(yǎng)缽中，于一般生長箱中生長。這些植株即為t0代植株。

其中，使用到的培養(yǎng)基配方為：

實(shí)施例4番茄sllcd基因?qū)ΨN子發(fā)育的影響

將實(shí)施例3獲得的共7株番茄轉(zhuǎn)化植株與其野生型對照(mt)植株在培養(yǎng)間中同時一起培育(16小時光照，22℃/8小時黑暗，20℃的光周期)，直至完成整個生命周期。7株番茄轉(zhuǎn)化植株共表現(xiàn)出如圖5，圖6所示的2種表型，其中4株如圖5所示，即在番茄中抑制sllcd基因的表達(dá)，導(dǎo)致種子不完全發(fā)育甚至消失，(左側(cè)a圖為野生型對照(mt)，右側(cè)b圖為實(shí)施例3獲得的轉(zhuǎn)基因植株)。上述結(jié)果說明：番茄sllcd參與果實(shí)發(fā)育，控制種子的形成。

由于不同轉(zhuǎn)基因植株中sllcd被抑制的程度不同，所以轉(zhuǎn)基因植株的表型會有程度上的差異(沒有種子或種子發(fā)育不完全)，這可能與外源基因在番茄基因組上的插入位點(diǎn)有關(guān)系，運(yùn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法來轉(zhuǎn)化植物，外源基因的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的。同時這種轉(zhuǎn)基因植株的表型方式是應(yīng)用rna干擾的方法來沉默基因的一種普遍的表型表現(xiàn)方式，更說明了sllcd編碼區(qū)參與種子的發(fā)育。

實(shí)施例5

通過實(shí)時定量熒光pcr(quantitativerealtimeqrt-pcr)測定番茄sllcd基因在各器官中的表達(dá)譜。結(jié)果如圖7所示。

結(jié)果表明：番茄sllcd基因在心皮中高水平表達(dá)。

實(shí)施例6

利用rt-pcr測定sllcd反義轉(zhuǎn)基因株系中sllcd的表達(dá)量，結(jié)果如圖8所示。

實(shí)施例7

利用qrt-pcr測定sllcd反義轉(zhuǎn)基因株系中sllcd的表達(dá)量，結(jié)果如圖9所示。

結(jié)果表明：番茄中sllcd基因在sllcd反義轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量下降。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方式，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

sequencelisting

<110>山西大學(xué)

<120>番茄sllcd基因及其應(yīng)用

<130>.

<160>5

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