本發(fā)明屬于植物基因克隆技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用番茄斑萎病毒nsm基因進(jìn)行抗病基因篩選的方法。

背景技術(shù)：

番茄斑萎病毒（tomatospottedwiltvirus,tswv）已對(duì)煙草、番茄、辣椒、蔬菜等作物生產(chǎn)構(gòu)成了巨大的威脅?，F(xiàn)有的主栽作物品種均能被番茄斑萎病毒侵染，成為番茄斑萎病毒流行、爆發(fā)的潛在威脅。由于其傳播介體——薊馬具有發(fā)育歷期短、個(gè)體小易隱蔽、對(duì)殺蟲劑極易產(chǎn)生抗藥性等的特點(diǎn)，所以現(xiàn)有的防治措施難以取得理想的控制效果。利用抗病基因培育抗病作物品種是最經(jīng)濟(jì)、最有效的手段。

以往進(jìn)行抗病候選基因鑒定和篩選主要利用轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)結(jié)合基因沉默技術(shù)進(jìn)行鑒定。通過(guò)分子標(biāo)記鎖定抗病基因連鎖的scaffolds或基因區(qū)段，一般都會(huì)有多個(gè)候選基因，對(duì)多個(gè)候選基因分別進(jìn)行轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)需要耗費(fèi)較大的人力物力。因此在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)前，對(duì)候選抗病基因進(jìn)行進(jìn)一步的快速準(zhǔn)確篩選將極大的減少抗病候選基因鑒定和篩選的工作量，提高準(zhǔn)確性。

在經(jīng)典遺傳學(xué)中，基因型控制的植物抗病性常常是由來(lái)源于植物的抗病基因r(resistance)與相應(yīng)的來(lái)源于病原物的無(wú)毒基因avr(avirulence)互作所決定的，即“基因?qū)颉睂W(xué)說(shuō)。avr基因的克隆和鑒定不僅有助于闡明抗病植株的抗病機(jī)制，而且基于avr基因和r基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系，更有助于r基因的鑒定和篩選，更迅速的鎖定r基因。因此在r基因克隆前，進(jìn)行avr基因的克隆和鑒定，并將含有avr的表達(dá)載體和候選抗病基因一起共浸潤(rùn)來(lái)進(jìn)行抗病基因鑒定，比起將全部候選抗病基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)，并在轉(zhuǎn)基因植株上來(lái)接種病毒來(lái)更方便、快捷，可以節(jié)約大量的人力、物力和財(cái)力。同時(shí)利用avr基因和候選抗病基因一起共浸潤(rùn)進(jìn)行抗病基因鑒定具有操作簡(jiǎn)便，能減少人為誤差，重復(fù)性好，滿足實(shí)現(xiàn)大規(guī)模檢測(cè)的特點(diǎn)。

目前番茄中抗tswv的基因sw-5b已被克隆，tswv的nsm為其對(duì)應(yīng)的avr基因。辣椒中抗tswv的基因tsw最近也被已被克隆基因，其對(duì)應(yīng)的avr基因是tswv的nss基因。但是來(lái)源于野生煙草n.alata中抗性基因rtsw還未被克隆，其對(duì)應(yīng)的tswvavr基因也未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用番茄斑萎病毒nsm基因進(jìn)行抗病基因篩選的方法，該方法能夠快速地鑒定候選抗病基因，極大的減少了候選基因驗(yàn)證的難度和工作量，為快速分離、克隆抗病基因奠定了基礎(chǔ)，對(duì)煙草抗病育種、抗病基因克隆具有顯著的意義。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種利用番茄斑萎病毒nsm基因進(jìn)行抗病基因篩選的方法，包括如下步驟：

鑒定出番茄斑萎病毒基因組中激發(fā)含有抗性位點(diǎn)rtsw的煙草產(chǎn)生抗病反應(yīng)的無(wú)毒基因，該無(wú)毒基因是nsm基因，核苷酸序列如seqidno.1所示；

用所述番茄斑萎病毒基因組中的所述無(wú)毒基因構(gòu)建含有所述無(wú)毒基因nsm的植物表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌注滲法將構(gòu)建好的含有所述無(wú)毒基因nsm的植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株中，之后制得帶有所述無(wú)毒基因nsm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液；

構(gòu)建含候選抗病基因的植物表達(dá)載體，并將候選抗病基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株中，之后制得帶有候選抗病基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液；

將帶有所述無(wú)毒基因nsm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液和帶有候選抗病基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液一起注滲到本氏煙葉片脈間，并檢測(cè)本氏煙葉片的過(guò)敏反應(yīng)。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，若在本氏煙葉片上檢測(cè)到所述過(guò)敏反應(yīng)，則表明該候選抗病基因?yàn)樵摕o(wú)毒基因的抗病基因。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述鑒定出番茄斑萎病毒基因組中激發(fā)含有抗性位點(diǎn)rtsw的煙草產(chǎn)生抗病反應(yīng)的無(wú)毒基因，具體包括：在所述番茄斑萎病毒基因組中搜索已注釋的病毒功能基因，并從病毒的功能基因中驗(yàn)證出特異針對(duì)rtsw抗性位點(diǎn)的無(wú)毒基因。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，用所述番茄斑萎病毒基因組中的所述無(wú)毒基因構(gòu)建含有所述無(wú)毒基因nsm的植物表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌注滲法將構(gòu)建好的含有所述無(wú)毒基因nsm的植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株中，之后制得帶有所述無(wú)毒基因nsm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液，具體包括：

克隆所述無(wú)毒基因nsm全長(zhǎng)序列，之后將該基因克隆于表達(dá)雙元載體pk2gw7中，構(gòu)建含有所述無(wú)毒基因nsm的植物表達(dá)載體；

通過(guò)農(nóng)桿菌注滲法將含有所述無(wú)毒基因nsm的表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌eha105菌株中，之后將包含無(wú)毒基因nsm的農(nóng)桿菌在根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)基lb中，于28℃培養(yǎng)24小時(shí)，離心收集菌體，再用浸潤(rùn)緩沖液稀釋成od600＝0.5的菌體懸液，制得帶有所述無(wú)毒基因nsm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，構(gòu)建含候選抗病基因的植物表達(dá)載體，并將候選抗病基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株中，之后制得帶有候選抗病基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液，具體包括：

克隆所述候選抗病基因全長(zhǎng)序列，之后將其克隆于表達(dá)載體phellsgate8中，構(gòu)建含有所述候選抗病基因的植物表達(dá)載體；

通過(guò)農(nóng)桿菌注滲法將含有所述候選抗病基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌eha105菌株中，之后將包含候選抗病基因的農(nóng)桿菌在根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)基lb中，于28℃培養(yǎng)24小時(shí)，離心收集菌體，再用浸潤(rùn)緩沖液稀釋成od600＝0.5的菌體懸液，制得帶有候選抗病基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，將帶有所述無(wú)毒基因nsm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液和帶有候選抗病基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液一起注滲到本氏煙葉片脈間，具體包括：

將帶有所述無(wú)毒基因nsm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液和帶有候選抗病基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌懸液按照體積比為1：1混合，并控制混合后菌體懸液的od600＝0.5；

用無(wú)菌的去掉針頭的注射器，將菌體懸液9.5-10.5微升，從本氏煙的葉背注滲入葉脈間，形成一個(gè)可見(jiàn)的浸潤(rùn)斑；將接種后的本氏煙置于20-28℃及80％濕度的環(huán)境中，交替進(jìn)行連續(xù)光照16小時(shí)及連續(xù)黑暗8小時(shí)，共觀察72小時(shí)。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，檢測(cè)本氏煙葉片的過(guò)敏反應(yīng)，具體包括：

在本氏煙上以含有pk2-35s-nsm+p2300-35s-sw-5b的eha105菌株作陽(yáng)性對(duì)照，觀察若本氏煙上產(chǎn)生混合后菌體懸液誘導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，則表明該候選抗病基因?yàn)樵摕o(wú)毒基因的抗病基因。

本發(fā)明無(wú)毒基因的克隆和鑒定方法包括如下步驟：

（1）分別擴(kuò)增tswv病毒基因組中的基因全長(zhǎng)序列作為候選基因，并將候選基因克隆于表達(dá)雙元載體pk2gw7中，構(gòu)建含有所述候選無(wú)毒基因的表達(dá)載體；

（2）通過(guò)農(nóng)桿菌注滲法分別將含有所述候選無(wú)毒基因的表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌eha105菌株中，構(gòu)建系列的鑒別菌株。

（3）分別將鑒別菌株在根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)基lb中，于28℃培養(yǎng)24小時(shí)，離心收集菌體，再用浸潤(rùn)緩沖液稀釋成od600＝0.5的菌體懸液；用無(wú)菌的去掉針頭的注射器，將菌體懸液9.5-10.5微升，從煙草植株的葉背注滲入葉脈間，形成一個(gè)可見(jiàn)的浸潤(rùn)斑；將接種后的煙草植株置于20-28℃及80％濕度的環(huán)境中，交替進(jìn)行連續(xù)光照16小時(shí)及連續(xù)黑暗8小時(shí)，共觀察72小時(shí)。

（4）觀察若n.alata和polalta上產(chǎn)生含無(wú)毒基因表達(dá)載體的鑒別菌株誘導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，表明供試抗tswv煙草植株對(duì)這個(gè)無(wú)毒候選基因發(fā)生了識(shí)別作用，即該候選基因?yàn)闊o(wú)毒基因。

本發(fā)明中激發(fā)煙草產(chǎn)生抗病反應(yīng)的nsm為rtsw抗性位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因，該基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，為genebankid:jf960236.1的第101-1009個(gè)堿基所組成的基因，其氨基酸序列為genebankid:aei70837.1；

本發(fā)明設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增nsm基因，通過(guò)gateway技術(shù)的lr反應(yīng)把nsm基因亞克隆到植物表達(dá)載體pk2gw7中，構(gòu)建含有所述nsm基因的表達(dá)載體pk2-35s-nsm；通過(guò)農(nóng)桿菌注滲法將含有所述nsm基因的表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌eha105菌株中，構(gòu)建含有無(wú)毒基因nsm表達(dá)載體的菌株。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

采用本發(fā)明的利用番茄斑萎病毒nsm基因進(jìn)行抗病基因篩選的方法，比起傳統(tǒng)的將全部候選抗病基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)，并在轉(zhuǎn)基因植株上來(lái)接種病毒來(lái)更方便、快捷，可以節(jié)約大量的人力、物力和財(cái)力，單個(gè)候選基因鑒定節(jié)約4-5個(gè)月的時(shí)間。同時(shí)利用無(wú)毒基因nsm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌和候選抗病基因一起共浸潤(rùn)本氏煙進(jìn)行抗病基因鑒定具有操作簡(jiǎn)便，能減少人為誤差，重復(fù)性好，滿足實(shí)現(xiàn)大規(guī)模檢測(cè)的特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為4種煙草品種接種pk2-35s-nsm（圖中標(biāo)記為nsm）、pk2-35s-nss（圖中標(biāo)記為nss）、pk2-35s-gn（圖中標(biāo)記為gn）、pk2-35s-gc（圖中標(biāo)記為gc）、pk2-35s-n（圖中標(biāo)記為n）和pk2-35s-nsm+p2300-35s-sw-5b（圖中標(biāo)記為nsm+sw-5b）hr反應(yīng)；

圖中：a為n.alata(pi42334)，pk2-35s-nsm浸潤(rùn)區(qū)域表現(xiàn)過(guò)敏性壞死，陽(yáng)性對(duì)照pk2-35s-nsm+p2300-35s-sw-5b浸潤(rùn)區(qū)域表現(xiàn)表現(xiàn)過(guò)敏性壞死；b為polalta，pk2-35s-nsm浸潤(rùn)區(qū)域表現(xiàn)過(guò)敏性壞死，陽(yáng)性對(duì)照pk2-35s-nsm+p2300-35s-sw-5b浸潤(rùn)區(qū)域表現(xiàn)表現(xiàn)過(guò)敏性壞死；b為n.tabacumcv.hongda，僅陽(yáng)性對(duì)照pk2-35s-nsm+p2300-35s-sw-5b浸潤(rùn)區(qū)域表現(xiàn)表現(xiàn)過(guò)敏性壞死；d為n.tabacumcv.k326，僅陽(yáng)性對(duì)照pk2-35s-nsm+p2300-35s-sw-5b浸潤(rùn)區(qū)域表現(xiàn)表現(xiàn)過(guò)敏性壞死。

圖2本氏煙葉片上使用農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種以下瞬時(shí)表達(dá)載體：phellsgate8-n'au+pk2-35s-nsm，phellsgate8-rtswcg1+pk2-35s-nsm，phellsgate8-rtswcg2+pk2-35s-nsm和p2300-35s-sw-5b+pk2-35s-nsm。接種后第3天調(diào)查hr反應(yīng)。僅有p2300-35s-sw-5b+pk2-35s-nsm有過(guò)敏性壞死斑出現(xiàn)。

圖中a為phellsgate8-n'au+pk2-35s-nsm共浸潤(rùn)，沒(méi)有過(guò)敏性壞死斑出現(xiàn)b為phellsgate8-rtswcg1+pk2-35s-nsm共浸潤(rùn)，沒(méi)有過(guò)敏性壞死斑出現(xiàn)c為phellsgate8-rtswcg2+pk2-35s-nsm共浸潤(rùn)，沒(méi)有過(guò)敏性壞死斑出現(xiàn)，d為p2300-35s-sw-5b+pk2-35s-nsm共浸潤(rùn)，有過(guò)敏性壞死斑出現(xiàn)。

圖3通過(guò)nptii基因的pcr擴(kuò)增檢測(cè)p2300-35s-sw-5b，phellsgate8-n'au，phellsgate8-rtswcg1和phellsgate8-rtswcg2表達(dá)載體的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植物。每一個(gè)點(diǎn)樣孔代表一株轉(zhuǎn)基因植株。其中標(biāo)記為“+”的點(diǎn)樣孔代表陽(yáng)性對(duì)照phellsgate8-rtswcg1質(zhì)粒，標(biāo)記為“-”的點(diǎn)樣孔代表陰性對(duì)照非轉(zhuǎn)基因野生型煙草n.tabacumcv.k326,標(biāo)記為“m”的點(diǎn)樣孔代表分子量標(biāo)尺（dnasizemarker），從下往上的條帶分別代表為100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000和1500bp。標(biāo)記為①為p2300-35s-sw-5b轉(zhuǎn)基因植株，標(biāo)記為②為phellsgate8-n'au轉(zhuǎn)基因植株，標(biāo)記為③為phellsgate8-rtswcg2轉(zhuǎn)基因植株，標(biāo)記為④為phellsgate8-rtswcg1轉(zhuǎn)基因植株。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用材料或設(shè)備未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的一種利用番茄斑萎病毒nsm基因鑒定煙草抗性的方法，基于植物表達(dá)載體農(nóng)桿菌注滲法，其發(fā)明構(gòu)思是，利用無(wú)毒基因可引起依賴于寄主抗病基因的過(guò)敏反應(yīng)這一特性，通過(guò)找出tswv無(wú)毒基因，和候選抗病基因一起共浸潤(rùn)本氏煙，并觀察本氏煙葉片是否產(chǎn)生過(guò)敏性壞死的性狀，由此能夠快速地鑒定出抗病基因。

本發(fā)明克隆了tswv病毒的5個(gè)功能基因——nss（為genbank:jf960235.1的第89-1492個(gè)堿基所組成的基因，其氨基酸序列為genebankid:aei70835.1）、nsm、gn（為genbank:jf960236.1的第3415-4689個(gè)堿基所組成的基因，其氨基酸序列為genebankid:aei70838.1中1-425個(gè)氨基酸）、gc（為genbank:jf960236.1的第1282-3414個(gè)堿基所組成的基因，其氨基酸序列為genebankid:aei70838.1中426-1136個(gè)氨基酸）和n（為genbank:jf960235.1的第2043-2819個(gè)堿基所組成的基因，其氨基酸序列為genebankid:aei70836.1），用這5個(gè)功能基因構(gòu)建了一系列鑒別菌株pk2-35s-nss、pk2-35s-nsm、pk2-35s-gn、pk2-35s-gc和pk2-35s-n，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)的方法接種抗性寄主n.alata和polalta快速鑒定出無(wú)毒基因?yàn)閚sm。

下面結(jié)合實(shí)例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換，均落入本發(fā)明保護(hù)范圍。

如無(wú)特殊說(shuō)明，下述各實(shí)施例使用的均為常規(guī)方法；如無(wú)特殊說(shuō)明，所用的試驗(yàn)材料均為自常規(guī)生化試劑公司購(gòu)買得到的。煙草材料為n.alata（pi42334）、polalta、本氏煙（n.benthamiana）、n.tabacumcv.hongda，n.tabacumcv.k326，polalta×k326bc6f1s和polalta×k326bc6f1r均來(lái)自云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。tswv病毒來(lái)自云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。tswv的cdna通過(guò)常規(guī)方法提取病毒侵染的煙草葉片總rna并利用試劑盒隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄方法獲得。

gatewaylrclonaseenzymemixkit、pentr/d-topo載體試劑盒購(gòu)自invitrogen公司，農(nóng)桿菌eha105購(gòu)自invitrogen公司。pk2gw7（購(gòu)自flandersinteruniversityinstituteforbiotechnology，vib）。質(zhì)粒dna提取試劑盒、瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒、dna片段純化試劑盒購(gòu)自qiagen公司。phusionhigh-fidelitydnapolymerase(m0530)試劑盒購(gòu)自neb公司。大腸桿菌(escherichiacoli)dh5α、限制性內(nèi)切酶、m-mulvreversetranscriptasekit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dnasizemarker、t4dna聚合酶及t4dna連接酶、卡拉霉素、壯觀霉素均購(gòu)自大連寶生物公司和roche公司。rna提取試劑盒trizol購(gòu)自invitrogen公司，檢測(cè)tswv的elisa試劑盒和試紙條購(gòu)自agdia公司。

實(shí)施例1激發(fā)rtsw抗病位點(diǎn)產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)的無(wú)毒基因確定

無(wú)毒基因鑒定通過(guò)tswv病毒的5個(gè)功能基因（nss、nsm、gn、gc和n）的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌瞬時(shí)浸潤(rùn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。所有的載體構(gòu)建過(guò)程中，均在正向引物的5’端加上cacc，擴(kuò)增得到整個(gè)表達(dá)盒片段，這樣片段的5’端與入門載體pentr/d-topo的突出末端gtgg序列互補(bǔ)，在拓?fù)洚悩?gòu)酶i的作用下使基因以正確的方向插入到pentr/d-topo載體的兩個(gè)attl重組位點(diǎn)之間，形成帶有兩個(gè)attl重組位點(diǎn)的入門克?。惶崛?gòu)建正確的入門克隆質(zhì)粒，按摩爾比1:1-3:1比例與目的載體pk2gw7混合，在lrclonaseenzymemix的作用下，入門克隆載體的兩個(gè)attl重組位點(diǎn)與pk2gw7的兩個(gè)attr位點(diǎn)進(jìn)行l(wèi)r位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)，得到目的重組載體。

1、用trizolreagent（invitrogen）從0.1gtswv毒源葉片中提取總rna。取-80℃保存的tswv毒源葉片約0.1g，加入1ml的trizol提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min后移入離心管，再加入0.2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min（12000rpm），轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入0.5ml異丙醇，混勻室溫放置10min，4℃離心10min（12000rpm），棄上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃離心5min（7500rpm），棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯（depc）處理水溶解rna。使用m-mulvreversetranscriptasekit（takara）進(jìn)行cdna的合成，取植物總rna約0.1μg-5μg，randomprimer50ng，10mmdntpmix1μl，用depc處理水補(bǔ)足至10μl，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65℃加熱5min，冰浴10min，加入反應(yīng)混合物9μl（5×reactionbuffer2μl，25mmmgcl24μl，0.1mdtt2μl，rna酶抑制劑1μl），將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25℃保溫2min，加入1μlm-mulvreversetranscriptase，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25℃保溫20min，然后42℃保溫70min，合成cdna。

tswv病毒的5個(gè)功能基因——nss、nsm、gn、gc和n分別采用如下引物對(duì)擴(kuò)增合成的cdna：

tswvnssf:5’-caccatgtcttcaagtgtttatgagtcgat-3’;（seqidno.2）

tswvnssr:5’-ttattttgatcctgaagcatatgctt-3’;（seqidno.3）

tswvnsmf:5’-caccatgttgactttttttggtaataag-3’；（seqidno.4）

tswvnsmr:5’-ctatatctcatcaaaagataactgag-3’；（seqidno.5）

tswvnf:5’-caccatgtctaaggttaagctcactaag-3’;（seqidno.6）

tswvnr:5’-ttaagcaagttctgcaagttttgtc-3’;（seqidno.7）

tswvgnf:5’-caccatgagaattttaaaactactagaac-3’;（seqidno.8）

tswvgnr:5’-ttagctagtccacttatgtttgttgtagt-3’;（seqidno.9）

tswvgcf:5’-caccatggaatggttccatctaatagtga-3’;（seqidno.10）

tswvgcr:5’-tcagacaaggtgagagaaatccatag-3’;（seqidno.11）

2、以合成的cdna第一鏈為模板、用phusionhigh-fidelitydnapolymerase(m0530)試劑盒的20μl體系進(jìn)行擴(kuò)增（5xphusionhf緩沖液4μl，10mmdntps0.4μl，10μm上游引物1μl，10μm下游引物1μl，模板dna1μl，phusiondna聚合酶0.2μl，加無(wú)菌水12.4μl至20μl）。擴(kuò)增程序?yàn)?8℃預(yù)變性30s；30個(gè)循環(huán)的98℃變性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；pcr產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)為單一條帶，純化后備用；

3、pentr-nss、pentr-nsm、pentr-gn、pentr-gc和pentr-n入門載體的構(gòu)建

將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與pentr/d-topo載體按照摩爾比1：1比例混合，即體系為pentr/d-topo載體1μ1，saltsolution1μ1，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物1-3μ1，無(wú)菌水補(bǔ)充至6μ1。室溫下連接5min，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α后涂布在含有kan(100mg/l)的平板上篩選，挑取單菌落進(jìn)行pcr鑒定，提取質(zhì)粒并測(cè)序，將測(cè)序正確的重組載體即為入門克隆載體，記作pentr-nss、pentr-nsm、pentr-gn、pentr-gc和pentr-n。

4、pk2-35s-nss、pk2-35s-nsm、pk2-35s-gn、pk2-35s-gc和pk2-35s-n載體的構(gòu)建

由于入門克隆載體pentr-nss、pentr-nsm、pentr-gn、pentr-gc和pentr-n為卡那霉素抗性，而目的載體pk2gw7為壯觀霉素抗性，故可以直接利用質(zhì)粒進(jìn)行l(wèi)r反應(yīng)。參照invitrogen公司gatewaylrclonaseenzymemix說(shuō)明書，在0.5mlep管中依次加入如下組分進(jìn)行l(wèi)r重組反應(yīng)：入門克隆載體2μ1，pk2gw7目的載體2μ1，tebuffer(pη8.0)4μ1，lrclonaseenzymemix2μ1。短暫混勻后25℃孵育1小時(shí)，待反應(yīng)完全后加入1μl蛋白酶k于37℃、10分鐘終止反應(yīng)。取2μl反應(yīng)液熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，菌液涂布在含有壯觀霉素(100mg/l)的平板上篩選，挑取單菌落進(jìn)行pcr鑒定，提取質(zhì)粒并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明目的序列已經(jīng)插在了pk2gw7的attrl和attr2之間，表明得到的重組載體正確，記作pk2-35s-nss、pk2-35s-nsm、pk2-35s-gn、pk2-35s-gc和pk2-35s-n。

5、農(nóng)桿菌培養(yǎng)與接種方法：

用于陽(yáng)性對(duì)照的載體p2300-35s-sw-5b的農(nóng)桿菌菌液在文獻(xiàn)“zhaow,jiangl,fengz,chenx,huangy,xuef,huangc,liuy,lif,liuyetal.plasmodesmatatargetingandintercellulartraffickingoftomatospottedwilttospovirusmovementproteinnsmisindependentofitsfunctioninhrinduction.jgenvirol.2016;97:1990-7.”中公開過(guò)，公眾可從云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院獲得。

制備農(nóng)桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，用電脈沖法將上述構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pk2-35s-nss、pk2-35s-nsm、pk2-35s-gn、pk2-35s-gc和pk2-35s-n轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（agrobacteriumtumefaciens）eha105中，在加有50mg/l利福平和50mg/l壯觀霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子。取少量質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀(bio-rad)滑槽中，用1mm的電擊杯和200歐姆、2.5kv/0.2cm的參數(shù)進(jìn)行電擊，電擊后立即取出電轉(zhuǎn)化杯，迅速加入0.5mlsoc培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中；28℃、200rpm搖床培養(yǎng)3-5h；室溫下，7500rpm離心1min，棄大部分上清，保留100μl將細(xì)胞懸浮；把農(nóng)桿菌涂布于lb抗生素（50mg/l利福平，50mg/l壯觀霉素)固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2天獲得單菌落，挑取單菌落進(jìn)行pcr鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆.

篩選得到的陽(yáng)性克隆和保存的p2300-35s-sw-5b菌液分別在2mllb抗生素（50mg/l利福平，50mg/l壯觀霉素)和2mllb抗生素（50mg/l利福平，50mg/l卡那霉素)培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)活化，28℃、210r/min，30h。取150μl活化菌液至10mllb培養(yǎng)基[含10mmol/l嗎啉乙磺酸(mes)(ph5.6)，40μmol/l乙醚丁香酮（acetosyringone），50mg/l利福平]28℃、210r/min，培養(yǎng)24h后，4700r/min，離心5min收集菌體。用浸潤(rùn)緩沖液(10mmol/lmgcl2，10mmol/lmes，200μmol/lacetosyringone)懸浮調(diào)整至菌液od600＝0.5。室溫放置3h。

選取兩種tswv抗性煙草即含有rtsw抗性位點(diǎn)的煙草：n.alata（pi42334）、polalta和兩種tswv感病煙草即不含rtsw抗性位點(diǎn)的煙草：n.tabacumcv.hongda，n.tabacumcv.k326各5株，用2ml注射器浸潤(rùn)4周大小煙苗最大的2片葉片。每張葉片注射六孔，分別為pk2-35s-nsm、pk2-35s-nss、pk2-35s-gn、pk2-35s-gc、pk2-35s-n和pk2-35s-nsm+p2300-35s-sw-5b（pk2-35s-nsm：p2300-35s-sw-5b體積比1:1）。其中pk2-35s-nsm+p2300-35s-sw-5b為陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照在所有的煙草上都會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏性壞死。煙苗接種后20-28℃的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)72h，調(diào)查觀察過(guò)敏壞死（hr反應(yīng)）。

結(jié)果（圖1）表明：感病煙草n.tabacumcv.hongda和n.tabacumcv.k326接種pk2-35s-nsm的農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)載體無(wú)hr反應(yīng)，僅陽(yáng)性對(duì)照pk2-35s-nsm+p2300-35s-sw-5b有hr反應(yīng)。而抗性煙草n.alata（pi42334）和polalta除了陽(yáng)性對(duì)照pk2-35s-nsm+p2300-35s-sw-5b外，接種pk2-35s-nsm的農(nóng)桿菌也表現(xiàn)明顯的hr反應(yīng)，這說(shuō)明n.alata（pi42334）和polalta中抗病基因與tswv互作的無(wú)毒基因?yàn)?i>nsm。

實(shí)施例2利用番茄斑萎病毒nsm基因進(jìn)行抗病基因篩選和利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行抗病基因篩選的比較

（1）利用無(wú)毒基因nsm植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌和候選抗病基因一起共浸潤(rùn)本氏煙進(jìn)行抗病基因篩選

設(shè)計(jì)引物從n.alata（pi42334）中擴(kuò)增候選基因，并構(gòu)建候選基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。分別和帶有所述無(wú)毒基因nsm植物表達(dá)載體pk2-35s-nsm的農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)本氏煙，如有候選抗病基因能在葉片浸潤(rùn)區(qū)域誘導(dǎo)過(guò)敏性壞死，則表明該基因?yàn)榭共』颉?/p>

n'au瞬時(shí)表達(dá)載體phellsgate8-n'au在專利“一種抗煙草花葉病毒的n′au基因及其克隆方法和應(yīng)用，申請(qǐng)人：劉勇，袁欣婕，黃昌軍，李永平，于海芹，陳學(xué)軍，肖炳光，申請(qǐng)?zhí)枺?01510768990.8，申請(qǐng)公開號(hào)：cn105274120a”中公開過(guò)，公眾可從云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院獲得。特征是n'au是煙草中抗煙草花葉病毒（tmv）基因，其對(duì)應(yīng)的無(wú)毒蛋白為tmv-cp。

步驟1：rtsw位點(diǎn)候選抗病基因（rtswcg1和rtswcg2）基因克?。?/p>

以n.alata（pi42334）的dna為模板，用引物對(duì)：

rtswcg1f：5’-tgcatccaacgcgttgggagctcatcgcaaagaaggcccaactgattga-3’；（seqidno.12）

rtswcg1r：5’-tctcattaaagcaggactctagagtagtaatgttacagtataaggagactg-3’；（seqidno.13）

rtswcg2f：5’-tgcatccaacgcgttgggagctctaggttaagagaggatgagggatcta-3’；（seqidno.14）

rtswcg2r：5’-tctcattaaagcaggactctagaggtggatcggtgatatcaaaagtga-3’；（seqidno.15）

進(jìn)行pcr擴(kuò)增。用phusionhigh-fidelitydnapolymerase(m0530)試劑盒的20μl體系進(jìn)行擴(kuò)增（5xphusionhf緩沖液4μl，10mmdntps0.4μl，10μm上游引物1μl，10μm下游引物1μl，模板dna1μl，phusiondna聚合酶0.2μl，加無(wú)菌水12.4μl至20μl）。擴(kuò)增程序?yàn)?8℃預(yù)變性30s；30個(gè)循環(huán)的98℃變性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；pcr產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)為單一條帶，純化后備用；

2、用saci+xbai雙酶切phellsgate8空載體，切膠回收載體骨架，測(cè)定濃度。

3、采用onestepcloningkitclonexpresstmii（vazyme，中國(guó)南京）的重組反應(yīng)體系：5xceiibuffer2ul，exnaseii1ul，線性化克隆載體25-100ng，插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物10-100ng，ddh2oto10ul。室溫下配置反應(yīng)體系，37℃反應(yīng)30min后，迅速轉(zhuǎn)移到冰水中放置5min，直接轉(zhuǎn)化。37℃環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜，并利用步驟1中的候選基因的特異性引物進(jìn)行pcr菌落篩選，得到陽(yáng)性克隆。

4、pcr篩選得到陽(yáng)性克隆phellsgate8-rtswcg1和phellsgate8-rtswcg2，構(gòu)建完成后，電脈沖法將上述構(gòu)建好的候選基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌eha105中。在本氏煙葉片上使用農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種以下瞬時(shí)表達(dá)載體：p2300-35s-sw-5b+pk2-35s-nsm（p2300-35s-sw-5b：pk2-35s-nsm體積比1：1），phellsgate8-n'au+pk2-35s-nsm（phellsgate8-n'au：pk2-35s-nsm體積比1：1），phellsgate8-rtswcg1+pk2-35s-nsm（phellsgate8-rtswcg1：pk2-35s-nsm體積比1：1）和phellsgate8-rtswcg2+pk2-35s-nsm（phellsgate8-rtswcg2：pk2-35s-nsm體積比1：1）。每株接種2片最大葉片。接種后第3天調(diào)查hr反應(yīng)。（圖2）結(jié)果可知僅有p2300-35s-sw-5b+pk2-35s-nsm產(chǎn)生了過(guò)敏性反應(yīng)，phellsgate8-n'au+pk2-35s-nsm，phellsgate8-rtswcg1+pk2-35s-nsm和phellsgate8-rtswcg2+pk2-35s-nsm都沒(méi)有過(guò)敏性反應(yīng)，表明rtswcg1和rtswcg1都不是抗病基因。

（2）利用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行抗病基因鑒定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證利用番茄斑萎病毒nsm基因進(jìn)行抗病基因篩選的準(zhǔn)確性和比較利用番茄斑萎病毒nsm基因進(jìn)行抗病基因篩選和利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行抗病基因篩選的優(yōu)勢(shì)，我們利用傳統(tǒng)方法將植物表達(dá)載體p2300-35s-sw-5b、phellsgate8-n'au、phellsgate8-rtswcg1和phellsgate8-rtswcg2的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草nicotianatabacumcv.k326。

步驟1植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草

挑取攜帶有質(zhì)粒p2300-35s-sw-5b、phellsgate8-n'au、phellsgate8-rtswcg1和phellsgate8-rtswcg2的農(nóng)桿菌單菌落接種于50ml的lb培養(yǎng)基中。phellsgate8-n'au、phellsgate8-rtswcg1和phellsgate8-rtswcg2在含50mg/l利福平、50mg/l壯觀霉素的lb中培養(yǎng)，p2300-35s-sw-5b在含50mg/l利福平、50mg/l卡那霉素的lb中培養(yǎng)，180rpm，28℃培養(yǎng)24h，待菌液od600至1.0左右，離心10min（3000rpm），沉淀菌體。再用10ml左右的ms液體培養(yǎng)基懸浮，離心10min（3000rpm），沉淀菌體。重復(fù)以上操作2～3次。最后加入一定體積的ms液體培養(yǎng)基重懸浮，使菌體的od600值為0.5。

制備煙草(nicotianatabacumcv.k326)的無(wú)菌苗，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，然后通過(guò)組織培養(yǎng)獲得小苗，進(jìn)一步篩選獲得所需的轉(zhuǎn)基因植物。把無(wú)菌煙草的葉片切成小片葉盤，在制備好的農(nóng)桿菌菌液中浸染15-20min，用無(wú)菌吸水紙吸干后，平鋪于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基ms1（ms+naa0.21μg/ml+bap0.02μg/ml）上黑暗共培養(yǎng)2天，將外植體轉(zhuǎn)移至含卡那霉素(50μg/ml)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基ms4（ms+naa0.53μg/ml+bap0.5μg/ml）上進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，約15天繼代一次（共3-4次）。待有芽生成后，轉(zhuǎn)入含卡那霉素(50ug/ml)的ms培養(yǎng)基上進(jìn)行根的誘導(dǎo)（約需25-30天左右）。

步驟2目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況及表達(dá)水平的檢測(cè)

為了確認(rèn)通過(guò)卡那霉素篩選的轉(zhuǎn)基因煙草株系確實(shí)含有導(dǎo)入的目的基因的dna片段，用pcr方法對(duì)篩選到的轉(zhuǎn)基因煙草作進(jìn)一步的鑒定。首先采用ctab法提取植物基因組：稱取植物葉片100mg左右置于1.5ml離心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末狀；加入900μl預(yù)熱到65℃的2×ctab緩沖液（tris-hclph7.5100mm,edta20mm,nacl1.4m，ctab2%），65℃度水浴加熱20分鐘后取出冷卻；加入500ul氯仿－異戊醇混合液（體積比24：1）搖勻，4℃離心10min（7500rpm）后轉(zhuǎn)移上清至1.5mlep管；再次加入500μl氯仿－異戊醇混合液（24：1）搖勻，4℃離心10min（7500rpm）；取出上清置于新的ep管中，加入1/10體積3mph5.2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻后4℃離心20min（12000rpm）；棄上清，用75％乙醇清洗兩次后，干燥，用含rnase的te緩沖液溶解并降解rna，獲得的基因組dna樣品。以轉(zhuǎn)煙草抗性苗基因組作為模板，以phellsgate8-rtswcg1質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照（圖3中用“+”標(biāo)記），以非轉(zhuǎn)基因野生型煙草n.tabacumcv.k326為陰性對(duì)照（圖3中用“-”標(biāo)記），用表達(dá)載體都含有的nptii基因的上下游引物nptiif：5’-ggtggagaggctattcggctatga-3’（seqidno.16）和nptiir：5’-cgctcagaagaactcgtcaagaagg-3’（seqidno.17）進(jìn)行pcr擴(kuò)增檢測(cè)目的基因是否插入煙草基因組。擴(kuò)增產(chǎn)物大小和預(yù)期推測(cè)(754bp)一致，說(shuō)明目的基因均已插入這些轉(zhuǎn)基因株系的基因組，野生型煙草n.tabacumcv.k326基因組pcr產(chǎn)物未出現(xiàn)目標(biāo)條帶（圖3）。

步驟3p2300-35s-sw-5b、phellsgate8-n'au、phellsgate8-rtswcg1和phellsgate8-rtswcg2轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株各得到16、12、15、25株，分別接種tswv。接種后的第9、16、23、30天調(diào)查記錄癥狀，并采樣進(jìn)行elisa檢測(cè)。具體步驟如下：

接種緩沖液的配制：配制0.1mph7.0的磷酸緩沖液，121℃滅菌20分鐘；在接種前半個(gè)小時(shí)內(nèi)，每100ml磷酸緩沖液加入0.2g亞硫酸鈉、10ulbeta-巰基乙醇，配成tswv接種緩沖液，放置冰上，備用；

待檢煙苗接種：取tswv毒源1-2g，放于研缽中，加入5-10ml步驟（1）獲得的tswv接種緩沖液和2-3g200-400目金剛砂，冰上充分研磨至混合均勻，得到tswv毒源汁液；

接種前洗凈雙手或者戴一次性乳膠手套操作；

接種時(shí)，首先將粒徑為200-400目金剛砂按照每片葉0.1-0.2g的用量均勻的撒至本氏煙幼苗的葉表面，之后取tswv毒源汁液，用一只手托住待接種煙苗葉片，另一只手從待接種煙苗葉片的葉基到葉尖的方向輕輕地、均勻地涂擦tswv毒源汁液；tswv毒源汁液的用量為每片葉50-100ul；

涂擦后用清水沖洗接種過(guò)的葉片，接著將植株于溫度22-25℃、濕度為60-80%條件下暗培養(yǎng)一天，之后將植株移至溫度22-25℃、光周期是晝/夜為14h/10h、濕度為80%條件下繼續(xù)培養(yǎng)；

發(fā)病率統(tǒng)計(jì)：從接種后第9天開始，每7天取煙草新鮮嫩葉并利用雙抗體夾心elisa法檢測(cè)tswv，并計(jì)算煙苗番茄斑萎病毒的發(fā)病率a，共調(diào)查4次。根據(jù)elisa結(jié)果區(qū)分待檢植株的抗感性，調(diào)查方法為：第一次采集全部葉片檢測(cè)，其后每次檢測(cè)前一次呈現(xiàn)陰性的植株。呈現(xiàn)陽(yáng)性的植株直接登記為感病。即第二次采集第一次檢測(cè)呈現(xiàn)陰性的樣品，第三次檢測(cè)第二次呈現(xiàn)陰性的樣品，第四次檢測(cè)第三次呈現(xiàn)陰性的樣品。為了減少人為操作的誤差，每個(gè)樣品的elisa檢測(cè)設(shè)計(jì)三次技術(shù)重復(fù)。

雙抗體夾心elisa法步驟如下：

1.用as-0105igg包被板，用cb緩沖液稀釋1000倍，每孔加入200μl，37℃反應(yīng)2-4h，洗板。

2.加入磨好的樣品200μl，用1×pbst+2%pvp磨樣，4℃過(guò)夜，洗板。

3.加鼠單抗，用eci稀釋3000倍，37℃、2到4h，洗板。

4.加入用eci稀釋的羊抗鼠-ap，37℃、2h，洗板。

5.加入pnpp底物，室溫，1h后測(cè)od值。

將四次的陽(yáng)性株數(shù)加和即為總的發(fā)病株數(shù)。發(fā)病率a=（該品種感病植株數(shù)量/該品種總植株數(shù)量）×100%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行抗性鑒定

*dpi（dayspostinoculation）,即表示接種后的天數(shù)。9dpi、16dpi、23、dpi、30dpi分別表示的是接種后第9、16、23、30天。

從以上結(jié)果可知，通過(guò)和候選抗病基因共浸潤(rùn)本氏煙，觀察本氏煙葉片是否產(chǎn)生過(guò)敏性壞死的性狀，進(jìn)而對(duì)候選抗病基因進(jìn)行鑒定和傳統(tǒng)方法鑒定的結(jié)果吻合，結(jié)果準(zhǔn)確。該方法僅用3天即能明確鑒定結(jié)果并且可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)候選基因鑒定，而傳統(tǒng)方法需要3-4個(gè)月進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，并需要一個(gè)月左右明確鑒定結(jié)果，且每個(gè)候選基因都需單獨(dú)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因后才能進(jìn)行鑒定，耗時(shí)耗力。利用番茄斑萎病毒nsm基因進(jìn)行抗病基因篩選的方法能迅速、高通量的進(jìn)行抗病基因的鑒定，表明基于該基因開發(fā)的植物抗病基因篩選的方法具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。

序列表

seqidno.1

ttagtttcacttgctaaacataacggtaatgttgaagtctcaaaaccatggtcttcttct120

gatgaaaagcttgctttaaccaaagctatggatacatccaaaggaaagatactgttgaac180

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