本發(fā)明涉及一種分離不飽和脂肪酸和植物甾醇的方法，具體涉及一種從加納籽油脂中分離不飽和脂肪酸和植物甾醇的方法。

背景技術(shù)：

加納籽（griffoniasimplicifolia）為云實亞科加納籽屬植物，原產(chǎn)于加納、科特迪瓦和多哥等西非國家。加納籽具有治療盆腔充血、腹瀉、惡心嘔吐、胃疼等功效，還具有抗生素的特性，此外，在提高人類性功能方面也頗具盛名。加納籽中的5-羥基色氨酸（5-htp）作為一種天然、安全的抗抑郁藥物，其治療效果在世界范圍內(nèi)備受關(guān)注，國內(nèi)外需求量在不斷提高。然而，到目前為止，加納籽仍需從非洲進(jìn)口，導(dǎo)致生產(chǎn)5-htp的成本居高不下。

cn103145602a公開了一種5-羥基色氨酸的新型提取純化工藝，該方法通過壓榨除油、提取、濃縮、脫脂、結(jié)晶、干燥等步驟獲得5-羥基色氨酸；cn102093281a公開了一種從加納籽中分離五羥基色氨酸的方法，該方法通過脫脂、提取、除雜后結(jié)晶、重結(jié)晶、母液處理等步驟得到5-羥基色氨酸。但是，上述方法僅公開了從加納籽中分離其主要成分——5-羥基色氨酸的方法，對于脫脂步驟的副產(chǎn)物——加納籽油脂并未加工利用。通常，這些副產(chǎn)物只是當(dāng)作廢棄物處理或廉價燃料出售，不僅浪費了寶貴的資源，還會對環(huán)境造成極大的污染。

鑒于非洲加納籽廣泛的民間藥用價值，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)其中還有多種天然活性成分，如凝集素、脂肪酸（包括不飽和脂肪酸）、植物甾醇等，市場開發(fā)潛力巨大。如果能從脫脂步驟的副產(chǎn)物——加納籽油脂中，將其它天然活性成分分離，不但能夠?qū)①Y源綜合利用，還可最大程度的提高產(chǎn)品的附加值，大幅度的降低生產(chǎn)和經(jīng)營的成本。

cn103570797a公開了一種從青蒿精油中分離植物甾醇的方法，該方法是以青蒿精油為原料，通過皂化、萃取、柱層析、重結(jié)晶等步驟，獲得植物甾醇。但是，該方法堿的用量較大，且使用了有毒有害的化學(xué)溶劑，對環(huán)境的污染較大，不符合清潔生產(chǎn)的要求。

cn103265472a公開了加納籽提取物結(jié)晶母液分離5-羥基色氨酸的方法，該方法是以加納籽提取物結(jié)晶母液為原料，通過硅膠拌料、乙醇洗脫、濃縮結(jié)晶、蒸餾水重結(jié)晶等步驟獲得5-羥基色氨酸。該方法雖能夠從結(jié)晶母液中回收部分5-羥基色氨酸產(chǎn)品，但是，其它有經(jīng)濟(jì)價值的成分，如不飽和脂肪酸和植物甾醇等未充分利用。

cn106008444a公開了一種從煙草中同時提取茄尼醇、西松烷二萜、維生素e、植物甾醇的方法，該方法通過提取、皂化、葡聚糖凝膠柱分離、多次硅膠柱層析等步驟獲得了包括植物甾醇在內(nèi)的多種成分。但是，該方法步驟繁多、成本高昂，獲得的植物甾醇的純度和收率都偏低，不適宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種產(chǎn)品收率、純度高，工藝過程可操作性強(qiáng)，成本低，環(huán)保無污染，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)的從加納籽油脂中分離不飽和脂肪酸和植物甾醇的方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：從加納籽油脂中分離不飽和脂肪酸和植物甾醇的方法，包括以下步驟：

（1）低碳醇浸提：將加納籽油脂加入低碳醇水溶液中，低溫攪拌分散，過濾，得醇浸提液和浸提渣；

（2）除雜脫色：將步驟（1）所得醇浸提液通過樹脂層析柱，收集流出液，減壓回收溶劑至無醇和水，得不飽和脂肪酸；

（3）低極性有機(jī)溶劑提取：在步驟（1）所得浸提渣中加入低極性有機(jī)溶劑，攪拌分散，過濾，得低極性有機(jī)溶劑提取液；

（4）堿洗除雜：在步驟（3）所得低極性有機(jī)溶劑提取液中加入堿水溶液，攪拌，靜置分層，分水，取有機(jī)層用水洗至中性，得中性有機(jī)層；

（5）硅膠層析：將步驟（4）所得中性有機(jī)層通過硅膠層析柱，用洗脫劑洗脫，收集洗脫液，濃縮去除溶劑，得植物甾醇粗品；

（6）重結(jié)晶：將步驟（5）所得植物甾醇粗品用有機(jī)溶劑加熱溶解，過濾，濃縮，冷卻結(jié)晶，過濾，干燥，得植物甾醇精品。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述加納籽油脂為加納籽提取5-羥基色氨酸的脫脂副產(chǎn)物，其中，不飽和脂肪酸的質(zhì)量含量為10～20%，總植物甾醇的質(zhì)量含量為6～15%，不飽和脂肪酸中主要含有油酸和亞油酸，所含油酸的質(zhì)量含量為8～10%，亞油酸的質(zhì)量含量為4～6%。所述加納籽油脂是在現(xiàn)有技術(shù)用加納籽提取5-羥基色氨酸的脫脂步驟，通過物理壓榨法或溶劑提取法所得的植物油脂。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述低碳醇水溶液與加納籽油脂的體積質(zhì)量比（l/kg）為5～20:1（更優(yōu)選10～15:1），低碳醇水溶液的體積濃度為50～99%（更優(yōu)選65～85%）。加入低碳醇的目的是將不飽和脂肪酸提取出來，若低碳醇的用量過少，則不飽和脂肪酸的提取不充分；若低碳醇的用量過多，則將造成溶劑的浪費。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述低碳醇為甲醇、乙醇，異丙醇或正丁醇等中的一種或幾種。由于高碳醇價格昂貴，沸點高，難以回收利用，不適合實際生產(chǎn)，因此，低碳醇更有利于將不飽和脂肪酸提取出來。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述低溫攪拌分散的溫度為0～15℃（更優(yōu)選5～10℃），時間為5～24h（更優(yōu)選6～12h）。由于在低溫條件下，低碳醇對雜質(zhì)的溶解度很小，對不飽和脂肪酸溶解度較大，因此，低溫攪拌提取出來的不飽和脂肪酸純度較高。若攪拌的時間過短，則油脂無法分散，提取的效果不佳；若攪拌的時間過長，則易造成時間和溶劑的浪費。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述樹脂與加納籽油脂原料的質(zhì)量比為1～10:1（更優(yōu)選1.5～4.0:1）。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述層析柱的高徑比為1～10:1（更優(yōu)選5～9:1），上柱的流速為0.5～2.0bv/h。

若樹脂用量過少或?qū)游鲋母邚奖冗^小，都將導(dǎo)致雜質(zhì)吸附量減少，無法徹底除雜脫色；若樹脂用量過多或?qū)游鲋邚奖冗^大，都將造成產(chǎn)品和樹脂的損失和浪費。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述樹脂為氧化鋁、硅膠、活性炭或硅藻土等中的一種或幾種。所述樹脂能有效去除醇提液中的色素等雜質(zhì)。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述低極性有機(jī)溶劑與加納籽油脂的體積質(zhì)量比（l/kg）為1～6:1（更優(yōu)選3～5:1）。若低極性有機(jī)溶劑的用量過少，則將導(dǎo)致植物甾醇的萃取不充分，收率偏低；若低極性有機(jī)溶劑的用量過多，則將造成溶劑的浪費，并增加后續(xù)水洗的用水量和硅膠的用量。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述低極性有機(jī)溶劑為乙醚、石油醚、正己烷、環(huán)己烷或6號抽提溶劑油中的一種或幾種。植物甾醇在低極性有機(jī)溶劑中的溶解度較大，使用低極性有機(jī)溶劑可以將浸提渣中的植物甾醇萃取出來。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述攪拌分散的時間為2～10h（更優(yōu)選3～5h）。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述堿水溶液與加納籽油脂的體積質(zhì)量比（l/kg）為1～10:1（更優(yōu)選2～8:1），堿水溶液的質(zhì)量濃度為0.5～5.0%。若堿液的濃度過小或堿液的用量過少，都將使得雜質(zhì)去除不徹底；若堿液的濃度過大或堿液的用量過多，都將造成堿的浪費，并增加水洗的難度。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述堿水溶液中的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣。使用堿液的目的是將低極性有機(jī)溶劑提取液中的油脂類雜質(zhì)除去。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述攪拌的時間為0.5～2.0h。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述靜置的時間為2～6h。

優(yōu)選地，步驟（5）中，所述硅膠與加納籽油脂的質(zhì)量比為1～10:1（更優(yōu)選1.5～4.0:1）。硅膠層析的目的是利用植物甾醇易被硅膠吸附，分離效果好，收率高，而其它低極性雜質(zhì)不易被硅膠吸附的特點，通過洗脫劑解吸附以得到純度較高的植物甾醇。

優(yōu)選地，步驟（5）中，所述層析柱的高徑比為1～10:1（更優(yōu)選3～5:1），上柱的流速為0.5～2.0bv/h。

若硅膠用量過少或?qū)游鲋邚奖冗^小，都將導(dǎo)致植物甾醇無法全部吸附；若硅膠用量過多或?qū)游鲋邚奖冗^大，都將造成物料的浪費，并加大洗脫的難度。

優(yōu)選地，步驟（5）中，所述洗脫劑的用量為4～10bv（更優(yōu)選5～7bv），洗脫的流速為0.5～2.0bv/h。

優(yōu)選地，步驟（5）中，所述洗脫劑為低極性溶劑與極性溶劑以體積比2～50:1（更優(yōu)選5～15:1）混合的溶劑，所述低極性溶劑為乙醚、石油醚、正己烷、環(huán)己烷或6號抽提溶劑油等中的一種或幾種，所述極性溶劑為乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷或三氯甲烷等中的一種或幾種。上述溶劑的混合比例可以將洗脫劑調(diào)節(jié)至合適的極性，更易于將植物甾醇洗脫下來。若配比過大，洗脫劑的極性偏小，將導(dǎo)致植物甾醇無法洗脫；若配比過小，洗脫劑的極性偏大，將導(dǎo)致植物甾醇和其它雜質(zhì)成分全部被洗脫，無法達(dá)到分離的目的。

優(yōu)選地，步驟（6）中，所述有機(jī)溶劑與植物甾醇粗品的體積質(zhì)量比（l/kg）為10～20:1，所述有機(jī)溶劑為石油醚、正己烷、環(huán)己烷、6號抽提溶劑油、乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷等中的一種或幾種。重結(jié)晶有利于進(jìn)一步提高產(chǎn)品純度。

優(yōu)選地，步驟（6）中，所述加熱溶解的溫度為30～60℃。

優(yōu)選地，步驟（6）中，所述濃縮是指濃縮至濃縮液的固含量為20～40%。

優(yōu)選地，步驟（6）中，所述冷卻結(jié)晶的溫度為5～15℃，時間為12～24h。

本發(fā)明方法中，1bv=1柱床體積。

本發(fā)明方法的原理為：低溫下，低碳醇可將極性小的不飽和脂肪酸提取出，而對其它高級脂肪酸的溶解度很小，而醇相中的不飽和脂肪酸很難被樹脂吸附，因此，穿過對雜質(zhì)和色素吸附作用較強(qiáng)的樹脂之后，可以得到純度較高的不飽和脂肪酸。而植物甾醇由于難溶于低碳醇，因而保留在浸提渣中。低碳醇浸提渣中的植物甾醇和油脂類雜質(zhì)都可以用低極性有機(jī)溶劑提取出來，而植物甾醇不與堿液反應(yīng)，但油脂類雜質(zhì)容易與堿反應(yīng)生成易溶于水的高級脂肪酸鹽，從而油脂類雜質(zhì)得以除去；最后再通過硅膠層析的分離和重結(jié)晶的提純，得到高純度的植物甾醇。

本發(fā)明方法的有益效果如下：

（1）本發(fā)明方法實現(xiàn)了從5-羥基色氨酸生產(chǎn)的副產(chǎn)物——加納籽油脂中分離經(jīng)濟(jì)價值高的不飽和脂肪酸和植物甾醇，其中，不飽和脂肪酸為淡黃色透明液體，經(jīng)gc-ms檢測，所含油酸和亞油酸的總量可高達(dá)89.1%，油酸和亞油酸的總收率＞90%；植物甾醇精品的純度可高達(dá)97.5%，植物甾醇的最終收率＞89%，實現(xiàn)了變廢為寶，減少了環(huán)境污染，提高了原料的利用率和產(chǎn)品附加值；

（2）本發(fā)明方法采用的分離和提純方法設(shè)備簡單、操作簡便，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

本發(fā)明實施例所使用的加納籽油脂是在現(xiàn)有技術(shù)用加納籽提取5-羥基色氨酸的脫脂步驟，通過物理壓榨法脫脂所得，其中，不飽和脂肪酸的質(zhì)量含量為16.8%（所含油酸的質(zhì)量含量為9.2%，亞油酸的質(zhì)量含量為5.5%），總植物甾醇的質(zhì)量含量為8.1%；本發(fā)明實施例所使用的化學(xué)試劑和原料，如無特殊說明，均通過常規(guī)商業(yè)途徑獲得。

本發(fā)明實施例中，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gc-ms）檢測油酸和亞油酸的含量；采用高效液相色譜（hplc）外標(biāo)法檢測植物甾醇的含量。

實施例1

（1）低碳醇浸提：將200g加納籽油脂加入2000ml體積濃度為70%的乙醇水溶液中，在10℃下，低溫攪拌分散6h，過濾，得醇浸提液和浸提渣；

（2）除雜脫色：將步驟（1）所得醇浸提液以流速1bv/h通過氧化鋁層析柱（氧化鋁的用量為400g，層析柱的高徑比為7:1），收集流出液，減壓回收溶劑至無醇和水，得不飽和脂肪酸29.9g；

（3）低極性有機(jī)溶劑提?。涸诓襟E（1）所得浸提渣中加入800ml石油醚，室溫攪拌分散3h，過濾，得石油醚提取液；

（4）堿洗除雜：在步驟（3）所得石油醚提取液中加入400ml質(zhì)量濃度為5%的氫氧化鈉水溶液，室溫攪拌0.5h，靜置分層2h，分水，取石油醚層用水洗至中性，得中性石油醚層；

（5）硅膠層析：將步驟（4）所得中性石油醚層以流速0.5bv/h通過硅膠層析柱（硅膠的用量為300g，層析柱的高徑比為3:1），用6bv石油醚和乙酸乙酯體積比為90:10的混合溶劑作為洗脫劑，以流速0.5bv/h洗脫，收集洗脫液，濃縮去除溶劑，得植物甾醇粗品25g；

（6）重結(jié)晶：將步驟（5）所得25g植物甾醇粗品用250ml正己烷，在50℃下，加熱溶解，過濾，濃縮至固含量為20%，冷卻至5℃，結(jié)晶12h，過濾，干燥，得植物甾醇精品15.5g。

本實施例所得不飽和脂肪酸為淡黃色透明液體，經(jīng)gc-ms檢測，其中，油酸的質(zhì)量含量為55.6%，亞油酸的質(zhì)量含量為33.5%，總含量為89.1%，油酸和亞油酸的總收率為90.6%；經(jīng)hplc檢測，本實施例所得植物甾醇精品的純度為96.2%，植物甾醇的總收率為92%。

實施例2

（1）低碳醇浸提：將400g加納籽油脂加入4000ml體積濃度為85%的甲醇水溶液中，在5℃下，低溫攪拌分散10h，過濾，得醇浸提液和浸提渣；

（2）除雜脫色：將步驟（1）所得醇浸提液以流速0.5bv/h通過硅藻土層析柱（硅藻土的用量為1000g，層析柱的高徑比為5:1），收集流出液，減壓回收溶劑至無醇和水，得不飽和脂肪酸61.6g；

（3）低極性有機(jī)溶劑提?。涸诓襟E（1）所得浸提渣中加入2000ml環(huán)己烷，室溫攪拌分散4h，過濾，得環(huán)己烷提取液；

（4）堿洗除雜：在步驟（3）所得環(huán)己烷提取液中加入3200ml質(zhì)量濃度為0.5%的氫氧化鈣水溶液，室溫攪拌1h，靜置分層6h，分水，取環(huán)己烷層用水洗至中性，得中性環(huán)己烷層；

（5）硅膠層析：將步驟（4）所得中性環(huán)己烷層以流速1bv/h通過硅膠層析柱（硅膠的用量為600g，層析柱的高徑比為5:1），用7bv環(huán)己烷和二氯甲烷體積比為92:8的混合溶劑作為洗脫劑，以流速1bv/h洗脫，收集洗脫液，濃縮去除溶劑，得植物甾醇粗品52g；

（6）重結(jié)晶：將步驟（5）所得52g植物甾醇粗品用780ml乙酸乙酯，在45℃下，加熱溶解，過濾，濃縮至固含量為35%，冷卻至10℃，結(jié)晶24h，過濾，干燥，得植物甾醇精品31.4g。

本實施例所得不飽和脂肪酸為淡黃色透明液體，經(jīng)gc-ms檢測，其中，油酸的質(zhì)量含量為54.9%，亞油酸的質(zhì)量含量為32.8%，總含量為87.7%，油酸和亞油酸的總收率為91.9%；經(jīng)hplc檢測，本實施例所得植物甾醇精品的純度為95.8%，植物甾醇的總收率為92.8%。

實施例3

（1）低碳醇浸提：將200g加納籽油脂加入3000ml體積濃度為65%的異丙醇水溶液中，在10℃下，低溫攪拌分散12h，過濾，得醇浸提液和浸提渣；

（2）除雜脫色：將步驟（1）所得醇浸提液以流速0.5bv/h通過氧化鋁層析柱（氧化鋁的用量為300g，層析柱的高徑比為9:1），收集流出液，減壓回收溶劑至無醇和水，得不飽和脂肪酸31.1g；

（3）低極性有機(jī)溶劑提取：在步驟（1）所得浸提渣中加入600ml6號抽提溶劑油，室溫攪拌分散5h，過濾，得6號抽提溶劑油提取液；

（4）堿洗除雜：在步驟（3）所得6號抽提溶劑油提取液中加入600ml質(zhì)量濃度為5%的氫氧化鉀水溶液，室溫攪拌1.5h，靜置分層3h，分水，取6號抽提溶劑油層用水洗至中性，得中性6號抽提溶劑油層；

（5）硅膠層析：將步驟（4）所得中性6號抽提溶劑油層以流速1bv/h通過硅膠層析柱（硅膠的用量為400g，層析柱的高徑比為5:1），用5bv6號抽提溶劑油和乙酸乙酯體積比為85:15的混合溶劑作為洗脫劑，以流速1bv/h洗脫，收集洗脫液，濃縮去除溶劑，得植物甾醇粗品23g；

（6）重結(jié)晶：將步驟（5）所得23g植物甾醇粗品用230ml二氯甲烷，在30℃下，加熱溶解，過濾，濃縮至固含量為40%，冷卻至5℃，結(jié)晶20h，過濾，干燥，得植物甾醇精品14.9g。

本實施例所得不飽和脂肪酸為淡黃色透明液體，經(jīng)gc-ms檢測，其中，油酸的質(zhì)量含量為55.0%，亞油酸的質(zhì)量含量為32.9%，總含量為87.9%，油酸和亞油酸的總收率為93.6%；經(jīng)hplc檢測，本實施例所得植物甾醇精品的純度為97.5%，植物甾醇的總收率為89.7%。