本發(fā)明涉及體外檢測(cè)診斷試劑，具體地說(shuō)，涉及一種用于檢測(cè)hcv的重組融合抗原。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus，hcv)感染是重大的健康問(wèn)題，全球的平均感染率約為3％。超過(guò)75％的急性感染個(gè)體最終發(fā)展成慢性攜帶狀態(tài)，最終導(dǎo)致肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。丙型肝炎病毒主要通過(guò)血液傳播，占輸血后肝炎的80-90％。目前hcv感染的治療方法是干擾素和利巴韋林藥物聯(lián)合用藥，但該治療方法并不是在所有情況下都有效。由于目前沒(méi)有丙型肝炎的有效治療藥物，盡早發(fā)現(xiàn)hcv感染，準(zhǔn)確判斷病毒亞型及患者感染狀況，是防控丙型肝炎的重要手段。因此，利用靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的診斷試劑對(duì)血源及血液制品等執(zhí)行嚴(yán)格hcv篩查程序，對(duì)有效防控丙型肝炎起重要作用。hcv病毒屬于黃病毒科的肝炎病毒屬，其基因組為9.6kb的正義、單鏈rna，編碼一個(gè)3011個(gè)氨基酸的多蛋白前體。多蛋白前體在宿主及病毒自身蛋白酶的作用下，被切割成多個(gè)功能蛋白，包括3種結(jié)構(gòu)蛋白，即核衣殼蛋白core，囊膜糖蛋白e1和囊膜糖蛋白e2；以及6種非結(jié)構(gòu)蛋白，即ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a及ns5b。自1989年hcv被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，國(guó)際hcv診斷試劑已經(jīng)發(fā)展到了第三代。第一代抗-hcvelisa診斷試劑采用的抗原是c100-3，c100-3是hcv非結(jié)構(gòu)基因(ns3/ns4)和人超氧化物歧化酶(sod)基因嵌合后表達(dá)的融合蛋白，全長(zhǎng)為527個(gè)氨基酸，其中c100占363個(gè)氨基酸，sod占154個(gè)氨基酸。應(yīng)用c100-3對(duì)獻(xiàn)血員進(jìn)行hcv篩查后，輸血后丙型肝炎發(fā)病率下降84％。但第一代抗體有幾點(diǎn)不足:1、靈敏度低，有假陰性；2、特異性低，易出現(xiàn)假陽(yáng)性；3、不能作為傳染性的指標(biāo)。僅17～25％的抗c100-3陽(yáng)性的血制品可以傳播hcv；4、不宜用于急性丙型肝炎的早期診斷，由于抗c100出現(xiàn)較晚，輸血后獲得性丙型肝炎病人抗c100-3抗體陽(yáng)性的平均時(shí)間為18周。為彌補(bǔ)第一代試劑的不足，又發(fā)展了第二代抗-hcvelisa診斷試劑。第二代抗-hcvelisa診斷試劑包含hcv核衣殼區(qū)重組蛋白c22-3和非結(jié)構(gòu)蛋白ns3區(qū)重組蛋白c33c抗原。第二代抗-hcvelisa診斷試劑，在hcv感染高危人群(如腎透析病人，靜脈毒品成癮者和血友病患者)中，抗hcv檢出率較第一代高5～40％；在急性輸血后丙型肝炎和散發(fā)性丙型肝炎中，抗hcv檢出率高于第一代約20％以上，在慢性丙型肝炎中，抗hcv檢出率較第一代增加10％以上。此外，hcv患者血清轉(zhuǎn)換的窗口期從第一代抗-hcvelisa診斷試劑的18周縮減為10周。但第二代抗-hcvelisa診斷試劑仍存在假陽(yáng)性問(wèn)題和少數(shù)漏檢問(wèn)題。1996年fda批準(zhǔn)了第三代抗-hcvelisa試劑，與第二代抗-hcvelisa試劑相比，增加了hcvns5區(qū)作為包被抗原，可檢出單獨(dú)ns5抗體陽(yáng)性者，使特異性達(dá)到99％。目前公認(rèn)的丙型肝炎病毒確診試劑是hcv3.0riba，該試劑包含2個(gè)重組抗原(c33c，ns5)和3個(gè)合成肽(c100，c22，5-1-1)，可用于確定可疑陽(yáng)性標(biāo)本。人工合成多肽抗原具有特異性好，無(wú)感染性等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些缺點(diǎn)，合成多肽分子量較小，不易吸附至固相；結(jié)構(gòu)較短，與抗體親和力低，所包含的表位較少，易發(fā)生漏檢；合成肽的成本較高，不利于推廣等。除了漏檢風(fēng)險(xiǎn)之外，由于丙型肝炎病毒診斷試劑中使用的主要原材料重組抗原是生物活性物質(zhì)，其活性易受溫度的影響而失活，抗原的熱穩(wěn)定性較差，同時(shí)在制備成hcv檢測(cè)試劑盒之后均要求于2-8℃保存，受環(huán)境溫度影響也較大。在實(shí)際使用過(guò)程中，由于檢測(cè)試劑盒的保存條件有時(shí)并不能盡如人意，人們通常希望檢測(cè)試劑盒在經(jīng)過(guò)惡劣的環(huán)境變化后還能保持高度的穩(wěn)定性與可信度。因而，一個(gè)具有降低漏檢風(fēng)險(xiǎn)、提高耐熱性能的hcv重組融合抗原是丙型肝炎病毒診斷檢測(cè)中一直追求的目標(biāo)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)且熱穩(wěn)定性好地檢測(cè)hcv抗體的重組融合抗原。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明首先提供一種hcv重組融合抗原，所述融合抗原由core抗原(2-102aa)、柔性連接子和ns5抗原(2322-2422aa)構(gòu)成。該融合抗原在設(shè)計(jì)上，首先經(jīng)過(guò)對(duì)核衣殼蛋白抗原區(qū)域的優(yōu)化，去除c端多余氨基酸，選擇2-102aa抗原區(qū)域，降低假陽(yáng)率而不損害靈敏度。而后，在上述核衣殼蛋白的基礎(chǔ)上添加非結(jié)構(gòu)蛋白ns5的2322-2422aa氨基酸區(qū)域，很大程度提高了所述融合抗原的靈敏度和熱穩(wěn)定性。由于核衣殼蛋白的等電點(diǎn)很高，重組蛋白在普通的buffer條件下極不穩(wěn)定，導(dǎo)致其純化、保存困難，需添加表面活性劑。表面活性劑的添加，增大了純化成本。同時(shí)，表面活性劑對(duì)hcv診斷體系也有影響，容易導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)。本發(fā)明采用hcv核衣殼蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白ns5融合表達(dá)的方法，可很大程度提高重組抗原的親水性和穩(wěn)定性，并且不損害重組抗原的抗原性。不僅如此，本發(fā)明根據(jù)hcv核衣殼蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白ns5抗原表位的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)選擇柔性連接子進(jìn)行連接，該柔性連接也提高了融合抗原的親水性，并且可以使hcv核衣殼蛋白(core抗原)及非結(jié)構(gòu)蛋白ns5抗原表位更好的折疊形成正確的空間結(jié)構(gòu)，很大程度的提高了融合抗原的親水性和穩(wěn)定性，并且不損害融合抗原的抗原性。更為具體地，所述融合抗原由seqidno.1所示蛋白、柔性連接子和seqidno.2所示蛋白構(gòu)成。融合抗原中的上述元件不需采用天然hcv多蛋白中正常出現(xiàn)的順序。因此，core抗原可位于融合蛋白的n-和/或c-末端。所述融合抗原由n端到c端依次為：seqidno.1所示蛋白、柔性連接子和seqidno.2所示蛋白；或依次為：seqidno.2所示蛋白、柔性連接子和seqidno.1所示蛋白。進(jìn)一步地，所述柔性連接子的氨基酸序列如seqidno.3所示。作為優(yōu)選，所述融合抗原的氨基酸序列如seqidno.7所示。在上述基礎(chǔ)上，所述融合抗原的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。進(jìn)一步地，所述融合抗原的編碼基因由編碼hcv核衣殼蛋白、柔性連接子和非結(jié)構(gòu)蛋白ns5抗原的核苷酸序列組成?？蛇x地，由seqidno.4、5、6所示的核苷酸序列組成。所述編碼基因的核苷酸序列，還取決于前述融合蛋白中n端至c端的元件順序。作為優(yōu)選，所述編碼基因?yàn)槿缦?1)～(3)之一：(1)seqidno.8所示的核苷酸序列；(2)與(1)編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與(1)不同的序列；(3)在(1)或(2)的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的，且編碼相同蛋白質(zhì)的核苷酸序列。其編碼得到的融合蛋白由n端至c端依次為hcv核衣殼蛋白、柔性連接子和非結(jié)構(gòu)蛋白ns5抗原。進(jìn)一步地，含有前述融合蛋白編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或工程菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明進(jìn)一步提供了前述融合抗原及其編碼基因在制備hcv檢測(cè)試劑盒方面的應(yīng)用。所述應(yīng)用具體為，將所述融合抗原的編碼基因構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至工程菌中誘導(dǎo)表達(dá)，得到融合抗原。純化后經(jīng)復(fù)性處理，獲得可溶的融合抗原，利用其包被免疫磁珠后，用于檢測(cè)hcv抗體。經(jīng)驗(yàn)證，本發(fā)明制備的重組融合抗原盡管是以包涵體形式表達(dá)的，但十分容易復(fù)性，只需要常規(guī)的pbs等普通buffer即可成功獲得可溶的抗原。不需要添加表面活性劑，從而克服了hcv核衣殼蛋白由于必須添加表面活性劑而在免疫檢測(cè)的應(yīng)用中受限的缺點(diǎn)。因此，含有本發(fā)明所述融合抗原的試劑或試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明涉及到的原料或試劑均為普通市售產(chǎn)品，涉及到的操作如無(wú)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實(shí)施方式。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種重組融合hcv抗原，該融合抗原涵蓋了hcv核衣殼蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白ns5的優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)域，具有很高的靈敏度、很強(qiáng)的特異性以及良好的熱穩(wěn)定性。同時(shí)，本發(fā)明公布了經(jīng)篩選后的hcv核衣殼蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白ns5的氨基酸序列、核苷酸序列，以及整個(gè)抗原設(shè)計(jì)構(gòu)建的技術(shù)路線，為高品質(zhì)丙型肝炎病毒抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定圖；從左到右，依次為：markerdl10000、酶切結(jié)果：pet28a-1025。圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中重組抗原誘導(dǎo)表達(dá)鑒定圖；從左到右，依次為：蛋白marker、誘導(dǎo)前菌樣、誘導(dǎo)后菌樣。圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中重組抗原純化電泳圖；從左到右，依次為：蛋白marker、菌體破碎上清、包涵體溶解上清、穿透樣品、洗脫目的蛋白。圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中重組抗原復(fù)性電泳圖；從左到右，依次為：蛋白marker、復(fù)性過(guò)程中的沉淀蛋白、復(fù)性重組抗原。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1hcv重組融合抗原的設(shè)計(jì)由于病毒性傳染病的抗原往往較大，在體外難以實(shí)現(xiàn)完整抗原蛋白的表達(dá)，或者即使實(shí)現(xiàn)體外表達(dá)，分子量比較大的抗原蛋白也往往不能正確折疊，導(dǎo)致后期的復(fù)性困難，或者復(fù)性獲得的抗原活性很差，制約了檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)。因此利用基因工程技術(shù)，將多個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位基因融合表達(dá)成為抗原研究的方向。本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)的篩選，最后確定選取core(2-102aa)、ns5(2322-2422aa)兩個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位，對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化后通過(guò)親水性較強(qiáng)的柔性連接gggsgg將其串聯(lián)。選取的core的抗原表位為2-102aa，其氨基酸序列為seqidno.1，對(duì)應(yīng)的優(yōu)化后的核苷酸序列為seqidno.4。選取的ns5的抗原表位為2322-2422aa，其氨基酸序列為seqidno.2，對(duì)應(yīng)的優(yōu)化后的核苷酸序列為seqidno.5。將上述兩個(gè)抗原表位通過(guò)相應(yīng)的連接子串聯(lián)后的氨基酸序列為core+ns5(seqidno.7)，該hcv重組融合抗原對(duì)應(yīng)優(yōu)化后的核苷酸組成序列為core+ns5(seqidno.8)。以上優(yōu)化的編碼hcv重組融合抗原的表達(dá)基因序列采用化學(xué)合成的方法得到核苷酸序列core+ns5(seqidno.8)。以core+ns5(seqidno.8)為模板，以core+ns5-f(seqidno.9)、core+ns5-r(seqidno.10)為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系為：pcr反應(yīng)條件為：94℃，5分鐘；94℃，30秒，59℃，30秒，72℃，1分鐘(擴(kuò)增30個(gè)循環(huán))；72℃，5分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用1％tae瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用axygen小量膠回收試劑盒回收。即得到目的基因片段1025(seqidno.11)。實(shí)施例2hcv重組融合抗原表達(dá)載體的構(gòu)建將實(shí)施例1中得到的目的基因片段1025(seqidno.11)和表達(dá)載體pet28a分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶ecori和xhoi雙酶切處理。目的基因片段1025的酶切反應(yīng)體系為：表達(dá)載體pet28a的酶切反應(yīng)體系為：37℃水浴酶切過(guò)夜。酶切產(chǎn)物用1％tae瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用axygen小量膠回收試劑盒回收。16℃連接4h，并將連接產(chǎn)物通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入感受態(tài)e.colidh5α細(xì)胞，涂布于含50μg/mlkan+的lb瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃條件下，倒置培養(yǎng)過(guò)夜或培養(yǎng)12～14小時(shí)至長(zhǎng)出單菌落。利用菌液pcr進(jìn)行初步篩選。具體做法是首先用無(wú)菌牙簽挑取單菌落于含有1mllb(50μg/mlkan+)的1.5mleppendoff管中，37℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)后取出菌液備用。按下列比例加好pcr反應(yīng)體系(20μl)：加好反應(yīng)體系后，用小槍頭吸取1.0μl培養(yǎng)過(guò)的菌液，混于混合物中，放入pcr儀后開(kāi)始擴(kuò)增。pcr反應(yīng)條件為：94℃，5分鐘；94℃，30秒，59℃，30秒，72℃，1分鐘(擴(kuò)增30個(gè)循環(huán))；72℃，5分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用1％tae瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用雙酶切鑒定進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。具體做法是：吸取10μl經(jīng)菌液pcr鑒定正確的克隆子菌液，加入到含有5mllb(50μg/mlkan+)的15ml試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。用axygen小量質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。用限制性內(nèi)切酶ecori和xhoi進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系為：37℃水浴酶切2h。酶切產(chǎn)物用1％tae瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)經(jīng)菌液pcr和質(zhì)粒酶切鑒定正確的菌液進(jìn)行菌種保存后送到生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。未發(fā)生堿基置換、缺失或者添加；雙酶切鑒定可見(jiàn)一條大小600bp左右的目的片段，與seqidno.8的片段大小一致(見(jiàn)圖1)。說(shuō)明目的基因成功克隆至表達(dá)載體pet28a，將其命名為pet28a-1025。實(shí)施例3hcv重組融合抗原的誘導(dǎo)表達(dá)將測(cè)序正確的酶切鑒定過(guò)的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pet28a-1025用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌e.colibl21(rossetta)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50μg/mlkan+和25μg/mlchl+的lb瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃條件下，倒置培養(yǎng)過(guò)夜或培養(yǎng)12～14小時(shí)至長(zhǎng)出單菌落。挑取2個(gè)單菌落接種至含50μg/mlkan+和25μg/mlchl+的5mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。次日，取200μl菌液轉(zhuǎn)接于5ml新鮮的含50μg/mlkan+和25μg/mlchl+的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)至od600≈0.8。加入iptg至終濃度1mm，于37℃下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。誘導(dǎo)結(jié)束后進(jìn)行sds-page電泳(見(jiàn)圖2)。將誘導(dǎo)出目的蛋白的克隆子菌液進(jìn)行菌種保存，并將其命名為rpet28a-1025。選擇誘導(dǎo)出目的蛋白的克隆子rpet28a-1025按上述確定的誘導(dǎo)條件進(jìn)行大量發(fā)酵培養(yǎng)2000ml。收集菌體，并用20mmpbsph7.4的緩沖液洗滌兩次。rpet28a-1025菌體凍存于-20℃。實(shí)施例4hcv重組融合抗原的純化用破菌緩沖液(20mmpbsph7.4，0.5mnacl)重懸rpet28a-1025發(fā)酵菌體，加入1mmpmsf后冰浴條件下超聲破碎(超聲破碎條件為：超聲5s，間隔10s，超聲總時(shí)間為15min，共循環(huán)4次)；超聲結(jié)束后12000rpm/min，4℃條件下離心15min；去上清。用上樣緩沖液(20mmpbsph7.4，0.5mnacl，8m尿素)重懸包涵體沉淀，加入1mmpmsf后冰浴條件下超聲破碎包涵體沉淀，(超聲破碎條件為：超聲5s，間隔10s，超聲總時(shí)間為15min，共循環(huán)2次)，而后2-8℃放置2-4h，使包涵體充分溶解；包涵體溶解后，12000rpm/min，4℃條件下離心15min；取上清進(jìn)行純化。上樣緩沖液為20mmpbsph7.4，0.5mnacl，8m尿素；平衡緩沖液為：20mmpbsph7.4，0.5mnacl，8m尿素，30mm咪唑；洗脫緩沖液為：20mmpbsph7.4，0.5mnacl，8m尿素，300mm咪唑。分別取破碎上清、流穿樣品、洗脫目的蛋白的小樣進(jìn)行sds-page電泳，目的蛋白大小與預(yù)期一致(見(jiàn)圖3)，蛋白純度大于80％，重組蛋白命名為1025。實(shí)施例5hcv重組融合抗原的復(fù)性對(duì)純化后的目的蛋白進(jìn)行尿素梯度稀釋復(fù)性處理。具體為：將目的蛋白裝入分子量3000的透析袋中，在20mmpbsph7.4，5mmedta，0.1％pc300，4m尿素透析液中透析處理4h；而后將目的蛋白轉(zhuǎn)入20mmpbsph7.4，5mmedta，0.1％pc300，2m尿素透析液中透析處理4h；而后將目的蛋白轉(zhuǎn)入20mmpbsph7.4，5mmedta，0.1％pc300，1m尿素透析液中透析處理4h；而后將目的蛋白轉(zhuǎn)入20mmpbsph7.4，5mmedta，0.1％pc300，0.5m尿素透析液中透析處理4h；而后將目的蛋白轉(zhuǎn)入20mmpbsph7.4，5mmedta，0.1％pc300透析液中透析處理4h，重復(fù)該操作一次。收集目的蛋白透析液，12000rpm/min，4℃條件下離心15min。上清即為復(fù)性后的hcv重組融合抗原。取小樣進(jìn)行行sds-page電泳。目的蛋白大小與預(yù)期一致，蛋白純度大于80％(見(jiàn)圖4)。實(shí)施例6hcv重組融合抗原的靈敏度檢測(cè)在其它生產(chǎn)工藝完全一致的情況下，用本發(fā)明的實(shí)施例5所制備的hcv重組融合抗原代替四川邁克生物科技股份有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)中的所使用的免疫磁珠包被蛋白1(含core(2-120aa)、ns5(2212-2313aa)區(qū)域的嵌合抗原)(暫命名為：所述hcv重組融合抗原制備的1025丙型肝炎病毒抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法))，并檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體診斷試劑國(guó)家參考品，進(jìn)行本發(fā)明蛋白的靈敏度評(píng)價(jià)。將四川邁克生物科技股份有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)作為對(duì)照試劑盒。結(jié)果表明本發(fā)明重組融合抗原對(duì)丙型肝炎病毒抗體診斷試劑國(guó)家參考品檢測(cè)均能達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，能滿足免疫診斷試劑開(kāi)發(fā)的需求(見(jiàn)表1)表11025丙型肝炎病毒抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)靈敏度檢測(cè)結(jié)果注：rlu：信號(hào)值；s/co＜1陰，s/co≥1陽(yáng)。注：丙型肝炎病毒抗體診斷試劑國(guó)家參考品，其中n1～n30為陰性參考品；p1～p30為陽(yáng)性參考品，l1～l4為最低檢出限參考品。陰性參考品要求≥29/30，實(shí)際檢測(cè)結(jié)果為30/30；陽(yáng)性參考品要求≥29/30，實(shí)際檢測(cè)結(jié)果為29/29；最低檢出限參考品要求≥2/4(l4需為陰性)，實(shí)際檢測(cè)結(jié)果為3/4且l4為陰性。對(duì)照試劑盒在2～8℃保存條件下，測(cè)試國(guó)家參考品漏檢4個(gè)，不符合要求。含有包被本發(fā)明所述hcv重組融合抗原的免疫磁珠的試劑盒，在2～8℃保存條件下，以及在37℃加速熱破壞6天后，測(cè)試anti-hcv國(guó)家參考品均符合要求。實(shí)施例7hcv重組融合抗原的臨床樣本檢測(cè)在其它生產(chǎn)工藝完全一致的情況下，用本發(fā)明的實(shí)施例5所制備的hcv重組融合抗原代替四川邁克生物科技股份有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)中的所使用的某公司生產(chǎn)的免疫磁珠包被蛋白1(暫命名為：所述hcv重組融合抗原制備的1025丙型肝炎病毒抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法))，并檢測(cè)臨床隨機(jī)樣本1167例，進(jìn)行本發(fā)明蛋白的臨床樣本符合率的評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1167例臨床隨機(jī)樣本中，1025丙型肝炎病毒抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)檢測(cè)出陽(yáng)性樣本129例，四川邁克生物科技股份有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)對(duì)照試劑檢測(cè)出陽(yáng)性樣本125例(表2)。將檢測(cè)結(jié)果不一致的四個(gè)臨床樣本dj-59、dj-12、dj-64和eps-0358分別用第三方roche試劑進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性(表3)。表21025丙型肝炎病毒抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)臨床特異性檢測(cè)結(jié)果1025丙型肝炎病毒抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)對(duì)照試劑盒臨床樣本1167例129125表31025丙型肝炎病毒抗體測(cè)定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)疑似假陽(yáng)血清確診結(jié)果注：rlu：信號(hào)值；s/co＜1陰，s/co≥1陽(yáng)。由此說(shuō)明，含有本發(fā)明所述hcv重組融合抗原的試劑盒，相比對(duì)照試劑盒的檢測(cè)準(zhǔn)確性更高。實(shí)施例8hcv重組融合抗原的熱穩(wěn)定性檢測(cè)對(duì)1025免疫磁珠進(jìn)行37℃加速熱破壞，進(jìn)行本發(fā)明蛋白的試劑穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明本發(fā)明重組融合抗原熱加速穩(wěn)定性能達(dá)到公司對(duì)該產(chǎn)品的要求，且較現(xiàn)售的免疫磁珠包被蛋白1具有更優(yōu)的穩(wěn)定性，能滿足免疫診斷試劑開(kāi)發(fā)的需求(表4)。表41025免疫磁珠穩(wěn)定性驗(yàn)證注：cal1：陰性質(zhì)控品，cal2：陽(yáng)性質(zhì)控品，rep1：重復(fù)1，rep2：重復(fù)2，ave：平均值雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>四川邁克生物新材料技術(shù)有限公司<120>一種hcv重組融合抗原及其應(yīng)用<130>khp171113001.5<160>11<170>patentinversion3.5<210>1<211>101<212>prt<213>core2-102aa<400>1serthrasnprolysproglnarglysthrlysargasnthrasnarg151015argproglnaspvallyspheproglyglyglyglnilevalglygly202530valtyrleuleuproargargglyproargleuglyvalargalathr354045arglysthrsergluargserglnproargglyargargglnproile505560prolysalaargargprogluglyargthrtrpalaglnproglytyr65707580protrpproleutyrglyasngluglyleuglytrpalaglytrpleu859095leuserproarggly100<210>2<211>101<212>prt<213>ns52322-2422aa<400>2alaproproileproproproargarglysargthrvalvalleuthr151015gluserthrvalserseralaleualagluleualathrlysalaphe202530glyserserlysserseralathraspglyglythralathralapro354045proasphisalaseraspaspglyasplysglyseraspvalgluser505560tyrsersermetproproleugluglygluproglyaspproaspleu65707580seraspglysertrpserthrvalsergluglualasergluaspval859095valcyscyssermet100<210>3<211>6<212>prt<213>linker<400>3glyglyglyserglygly15<210>4<211>303<212>dna<213>core2-102aa<400>4agcacgaatcctaaacctcaaagaaaaaccaaacgtaacaccaaccgccgcccacaggac60gtcaagttcccgggcggtggtcagatcgttggtggagtttacctgttgccgcgcaggggc120cccaggttgggtgtgcgcgcgactaggaagacttccgagcggtcacaacctcgtggaagg180cgacaacctatccccaaggctcgccgtcccgagggaaggacctgggcgcagcccgggtac240ccttggcccctctatggcaatgagggcttggggtgggcaggatggctcctgtcaccccga300ggc303<210>5<211>306<212>dna<213>ns52322-2422aa<400>5gcccccccaataccgcctccacggaggaagaggacggttgtcctgacagagtccaccgtg60tcttctgccttggcggagctcgctactaaggccttcggcagctccaaatcatcggccacc120gacggcggcacggcgaccgcccctcctgaccacgcctccgacgacggcgacaaaggatcc180gacgttgagtcgtactcctccatgcccccccttgagggagagccgggggaccccgatctc240agcgacgggtcctggtctaccgtgagcgaggaggccagtgaggacgtcgtctgctgctca300atgtaa306<210>6<211>18<212>dna<213>linker<400>6ggtggtggtagtggtggt18<210>7<211>208<212>prt<213>hcv重組融合抗原<400>7serthrasnprolysproglnarglysthrlysargasnthrasnarg151015argproglnaspvallyspheproglyglyglyglnilevalglygly202530valtyrleuleuproargargglyproargleuglyvalargalathr354045arglysthrsergluargserglnproargglyargargglnproile505560prolysalaargargprogluglyargthrtrpalaglnproglytyr65707580protrpproleutyrglyasngluglyleuglytrpalaglytrpleu859095leuserproargglyglyglyglyserglyglyalaproproilepro100105110proproargarglysargthrvalvalleuthrgluserthrvalser115120125seralaleualagluleualathrlysalapheglyserserlysser130135140seralathraspglyglythralathralaproproasphisalaser145150155160aspaspglyasplysglyseraspvalglusertyrsersermetpro165170175proleugluglygluproglyaspproaspleuseraspglysertrp180185190serthrvalsergluglualasergluaspvalvalcyscyssermet195200205<210>8<211>627<212>dna<213>hcv重組融合抗原<400>8agcacgaatcctaaacctcaaagaaaaaccaaacgtaacaccaaccgccgcccacaggac60gtcaagttcccgggcggtggtcagatcgttggtggagtttacctgttgccgcgcaggggc120cccaggttgggtgtgcgcgcgactaggaagacttccgagcggtcacaacctcgtggaagg180cgacaacctatccccaaggctcgccgtcccgagggaaggacctgggcgcagcccgggtac240ccttggcccctctatggcaatgagggcttggggtgggcaggatggctcctgtcaccccga300ggcggtggtggtagtggtggtgcccccccaataccgcctccacggaggaagaggacggtt360gtcctgacagagtccaccgtgtcttctgccttggcggagctcgctactaaggccttcggc420agctccaaatcatcggccaccgacggcggcacggcgaccgcccctcctgaccacgcctcc480gacgacggcgacaaaggatccgacgttgagtcgtactcctccatgcccccccttgaggga540gagccgggggaccccgatctcagcgacgggtcctggtctaccgtgagcgaggaggccagt600gaggacgtcgtctgctgctcaatgtaa627<210>9<211>27<212>dna<213>人工序列<400>9gaattcagcacgaatcctaaacctcaa27<210>10<211>32<212>dna<213>人工序列<400>10ctcgagttacattgagcagcagacgacgtcct32<210>11<211>639<212>dna<213>目的基因片段1025<400>11gaattcagcacgaatcctaaacctcaaagaaaaaccaaacgtaacaccaaccgccgccca60caggacgtcaagttcccgggcggtggtcagatcgttggtggagtttacctgttgccgcgc120aggggccccaggttgggtgtgcgcgcgactaggaagacttccgagcggtcacaacctcgt180ggaaggcgacaacctatccccaaggctcgccgtcccgagggaaggacctgggcgcagccc240gggtacccttggcccctctatggcaatgagggcttggggtgggcaggatggctcctgtca300ccccgaggcggtggtggtagtggtggtgcccccccaataccgcctccacggaggaagagg360acggttgtcctgacagagtccaccgtgtcttctgccttggcggagctcgctactaaggcc420ttcggcagctccaaatcatcggccaccgacggcggcacggcgaccgcccctcctgaccac480gcctccgacgacggcgacaaaggatccgacgttgagtcgtactcctccatgccccccctt540gagggagagccgggggaccccgatctcagcgacgggtcctggtctaccgtgagcgaggag600gccagtgaggacgtcgtctgctgctcaatgtaactcgag639當(dāng)前第1頁(yè)12