本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗疲勞作用的麗蕾金線蘭多糖提取物的制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
疲勞是一種常見的生理現(xiàn)象，其過程為過度勞動(dòng)或運(yùn)動(dòng)引起機(jī)體生理生化功能改變而導(dǎo)致機(jī)體勞動(dòng)或運(yùn)動(dòng)能力的暫時(shí)降低，實(shí)際上疲勞是防止機(jī)體發(fā)生機(jī)能衰竭而產(chǎn)生的一種保護(hù)性反應(yīng)。疲勞可以導(dǎo)致精神不振、注意力不集中、抵抗力下降等一系列后果，嚴(yán)重影響工作效率或運(yùn)動(dòng)成績(jī)，故研究延緩或消除疲勞的措施具有十分重要的意義。目前市場(chǎng)上用于抗疲勞的化學(xué)藥物在延緩疲勞和消除疲勞方面具有一定的效果，但是長(zhǎng)期服用，具有一定的成癮性和依賴性，因此限制了其臨床應(yīng)用。因此，從天然植物資源中提取安全、有效、不含對(duì)人體有害成分的抗疲勞成分已成為近年來抗疲勞藥物的研究熱點(diǎn)。
麗蕾金線蘭為蘭科開唇蘭屬植物麗蕾金線蘭anoectochiluslyleirolfeexdownie的新鮮或干燥全草?，F(xiàn)有關(guān)于麗蕾金線蘭的研究較少，未見其具有抗疲勞作用的相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的之一是提供一種具有確切的抗疲勞活性，無毒副作用的麗蕾金線蘭多糖提取物的制備方法。
本發(fā)明的目的之二是將上述麗蕾金線蘭多糖提取物制成各種抗疲勞藥物制劑或制備其他抗疲勞藥物的原料藥。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
一種麗蕾金線蘭多糖提取物的制備方法，麗蕾金線蘭原料藥材脫脂后，再經(jīng)過水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖經(jīng)過透析、離子交換層析脫去蛋白、色素，除去小分子化學(xué)成分，制成較高純度的麗蕾金線蘭多糖提取物。
其包括以下具體步驟：
（1）將麗蕾金線蘭藥材用高濃度乙醇回流除去脂溶性雜質(zhì)；
（2）殘?jiān)铀訜崽崛。瑸V液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得沉淀；
（3）沉淀依次用無水乙醇、丙酮分別洗滌；
（4）洗滌后的沉淀用蒸餾水溶解后透析；
（5）透析液濃縮至一定體積，采用陽(yáng)離子交換樹脂法脫去多糖中的色素和蛋白質(zhì)；
（6）將除去色素和蛋白質(zhì)的洗脫液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得多糖沉淀；
（7）多糖沉淀依次用無水乙醇、丙酮分別洗滌，干燥，即得麗蕾金線蘭多糖提取物。
為了達(dá)到更好的提取效果，優(yōu)選的，
步驟（1）中將麗蕾金線蘭用10～14倍重量的80～95％乙醇回流脫脂2～3次，每次回流1.5～3h；
步驟（2）中將殘?jiān)?0～16倍重量的蒸餾水加熱提取2～3次，每次提取2～3h，合并提取液，將提取液濃縮，濃縮液與原藥材的體積質(zhì)量比為1～3：1，加入95％乙醇醇沉至含醇量為80％，靜置12h，離心得收集沉淀；
步驟(3)、(7)中將沉淀依次用2～4倍重量的無水乙醇、丙酮分別洗滌；
步驟(4)中的沉淀以10～50倍重量的蒸餾水復(fù)溶，用截留相對(duì)分子量3500以上的透析袋透析24～72h。
步驟(5)中將多糖透析液通過jk008型、732型陽(yáng)離子交換樹脂，收集過柱液，然后用3倍柱體積的蒸餾水洗脫，流速為2bv/h。
步驟（6）將洗脫液濃縮，濃縮液與原藥材的體積質(zhì)量比為1～3：1，加入95％乙醇醇沉至含醇量為80％，靜置12h，離心得沉淀。
沉淀依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌，干燥，得脫蛋白和色素的麗蕾金線蘭多糖提取物。
本發(fā)明麗蕾金線蘭多糖提取物中單糖組成摩爾比為甘露糖：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖=0.15:0.06:0.78:0.38:0.10，多糖的含量以葡萄糖計(jì)，所述麗蕾金線蘭多糖提取物中總多糖的含量占提取物重量百分比的74％以上。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
本純化的麗蕾金線蘭多糖提取物經(jīng)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明能顯著延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，降低小鼠游泳后血清尿素氮、血清乳酸含量，提高小鼠在應(yīng)激狀態(tài)下的抗氧化能力，提高肝糖原和肌糖原含量，具有明顯的抗疲勞作用。
附圖說明
圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的麗蕾金線蘭多糖提取物的單糖衍生物的高效液相色譜（hplc）圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例1
取麗蕾金線蘭藥材2kg，用12倍重量80%的乙醇加熱回流提取3次，每次2h，過濾，將濾渣晾干，殘?jiān)?2倍重量的蒸餾水加熱提取3次，每次2h，過濾，合并提取液，將提取液濃縮，濃縮液與原藥材的體積質(zhì)量比為2：1，加入95%的乙醇至含醇量為80％，靜置12h，離心，收集沉淀，將沉淀用4倍量無水乙醇、丙酮分別洗滌，再將沉淀物干燥，即得麗蕾金線蘭粗多糖提取物。將麗蕾金線蘭粗多糖加水溶解，上清液用截留相對(duì)分子量為3500以上的透析袋透析48h，然后將透析液通過jk008型陽(yáng)離子交換樹脂，用3倍柱體積的蒸餾水洗脫，流速為2bv/h。收集水洗脫液，將洗脫液濃縮，濃縮液與原藥材的體積質(zhì)量比為2：1，加入95%的乙醇至含醇量為80%，靜置12h，離心，收集沉淀，沉淀依次用4倍量無水乙醇、丙酮分別洗滌，干燥，得脫蛋白和色素的麗蕾金線蘭多糖提取物。本發(fā)明麗蕾金線蘭多糖提取物中多糖的含量以葡萄糖計(jì)，所述多糖的含量占麗蕾金線蘭多糖提取物重量百分比為78.38％。
實(shí)施例2
取麗蕾金線蘭藥材2kg，用10倍量95%的乙醇加熱回流提取3次，每次2h，過濾，將濾渣晾干，殘?jiān)?0倍量的蒸餾水加熱提取3次，每次2h，過濾，合并提取液，將提取液濃縮，濃縮液與原藥材的體積質(zhì)量比為1：1，加入95%的乙醇至含醇量為80％，靜置12h，離心，收集沉淀，將沉淀用4倍量無水乙醇、丙酮洗滌，再將沉淀物干燥，即得麗蕾金線蘭粗多糖提取物。將麗蕾金線蘭粗多糖加水溶解，上清液用截留相對(duì)分子量為3500以上的透析袋透析48h，然后將透析液通過732型陽(yáng)離子交換樹脂，用3倍柱體積的蒸餾水洗脫，流速為2bv/h。收集水洗脫液，將洗脫液濃縮，濃縮液與原藥材的體積質(zhì)量比為1：1，加入95%的乙醇至含醇量為80%，靜置12h，離心，收集沉淀，沉淀依次用4倍量無水乙醇、丙酮洗滌，干燥，得脫蛋白和色素的麗蕾金線蘭多糖提取物。本發(fā)明麗蕾金線蘭多糖提取物中多糖的含量以葡萄糖計(jì)，所述多糖的含量占麗蕾金線蘭多糖提取物重量百分為74.42％。
實(shí)施例3麗蕾金線蘭多糖提取物（實(shí)施例1中提取物）的抗疲勞實(shí)驗(yàn)
取雄性icr小鼠，體重18-22g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、紅景天提取物組（陽(yáng)性藥物組）、組麗蕾金線蘭多糖提取物低劑量組、麗蕾金線蘭多糖提取物中劑量組、麗蕾金線蘭多糖提取物組，每組8只小鼠。連續(xù)給藥14d，末次給藥1h后，各組小鼠分別進(jìn)行負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)。在小鼠尾根部各負(fù)荷其體重10％的鉛絲作為重物，放入玻璃缸內(nèi)，水深35cm，水溫(25±0.5)℃，保證小鼠在水中不能用尾巴接觸箱底。當(dāng)小鼠頭部沉入水中，10s內(nèi)不能浮出水面的時(shí)間，此時(shí)間即為小鼠力竭游泳時(shí)間。在停止游泳休息20min后采血，按照試劑盒說明書測(cè)定小鼠血清尿素氮（bun）、乳酸（bla）含量；取小鼠肝臟和腓腸肌，按試劑盒說明書測(cè)定肝臟超氧化物歧化酶（sod）、丙二醛（mda）、肝糖原和腓腸肌肌糖原的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。
表1麗蕾金線蘭多糖提取物對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間、血清bun和ldh的影響（n=8，
注：*p<0.05，**p<0.01，與空白對(duì)照組比較
表2麗蕾金線蘭多糖提取物對(duì)小鼠肝臟sod、mda、肝糖原和肌糖原的影響（n=8，
注：*p<0.05，**p<0.01，與空白對(duì)照組比較
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由表1、表2可知，麗蕾金線蘭多糖提取物低劑量和高劑量能顯著延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，降低小鼠血清中的bun和ldh含量，提高肝組織中sod含量，降低肝組織中mda水平，增加肝糖原和肌糖原含量，由此表明，本發(fā)明中麗蕾金線蘭多糖提取物具有明顯的抗疲勞作用。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。