本發(fā)明涉及重組酶硫酸乙酰肝素3-o磺基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)方法及其在合成硫酸乙酰肝素中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

硫酸乙酰肝素(hs)是一類廣泛存在于細(xì)胞表面的糖胺聚糖，參與一系列生物反應(yīng)，如血液凝固、傷口愈合、胚胎發(fā)育等。它與肝素的結(jié)構(gòu)相似，都是由重復(fù)的雙糖單位組成。硫酸乙酰肝素是由葡萄糖胺和葡萄糖醛酸相互交替增加到鏈的非還原端形成。隨后，通過一系列的反應(yīng)進(jìn)行修飾，包括n-脫乙酰、n-硫酸化、c5異構(gòu)化與不同位置和程度的硫酸化。由于這些反應(yīng)的不完全性，合成的多糖也具有不同的結(jié)構(gòu)和功能。而hs與不同的蛋白相互作用取就是決于多糖鏈上o-硫酸化位點與程度。近年來有研究表明，hs及其衍生物在參與病毒感染中發(fā)揮著重要作用。尤其是3-o硫酸化的hs能與抗凝血酶，hsv-1糖蛋白d，纖維細(xì)胞生長因子等結(jié)合，發(fā)揮特定功能。

硫酸乙酰肝素3-o磺基轉(zhuǎn)移酶1(3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1)是硫酸乙酰肝素生物合成中的關(guān)鍵酶。它能將硫酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到葡萄糖胺的3-o位上。3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1的表達(dá)與應(yīng)用對于體外合成硫酸乙酰肝素及其功能研究具有重要意義。而目前，國內(nèi)外關(guān)于3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1高效外源表達(dá)的報道還十分有限，相關(guān)研究也并未深入展開。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種有效可行的方法，通過構(gòu)建基因工程，獲得重組酶硫酸乙酰肝素3-o磺基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，并將其應(yīng)用于硫酸乙酰肝素的合成中。

為實現(xiàn)第一個發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

重組酶硫酸乙酰肝素3-o磺基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)方法，其特征在于，利用wistar大鼠腦組織來源的rna為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1的互補(bǔ)脫氧核糖核酸序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化并切除信號肽；優(yōu)化后的片段與pet-28a質(zhì)粒連接，導(dǎo)入宿主菌大腸桿菌bl21(de3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

具體地，有如下步驟：

(1)實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)：根據(jù)已報道的褐家鼠3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1基因(genbank登錄號：no.nm_053391.1)設(shè)計了一對特異性引物，在引物中加入限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和hindⅲ兩個酶切位點；以wistar大鼠大腦總核糖核酸為模板，利用實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)技術(shù)擴(kuò)增得到3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1基因片段；將pcr得到的片段與pmd-19-t載體連接，并導(dǎo)入大腸桿菌dh5α感受態(tài)中，用藍(lán)白斑篩選與菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行驗證；

(2)密碼子優(yōu)化：對序列進(jìn)行稀有密碼子分析，同時進(jìn)行密碼子優(yōu)化；

(3)表達(dá)：密碼子優(yōu)化后的基因連接在pet-28a載體，利用熱轉(zhuǎn)法將質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)宿主大腸桿菌bl21(de3)中；抗性篩選后，利用異丙基硫代半乳糖苷(iptg)進(jìn)行誘導(dǎo)，使目的蛋白表達(dá)；對誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，破碎液作為總蛋白樣品，離心取上清與沉淀分別作為可溶性與非可溶性蛋白樣品，進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳(sds-page)。

為實現(xiàn)第二個發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案如下：

重組酶硫酸乙酰肝素3-o磺基轉(zhuǎn)移酶在合成硫酸乙酰肝素中的應(yīng)用，其特征在于，得到表達(dá)后，使用鎳親和柱進(jìn)行純化去除雜蛋白；并利用透析法對包涵體進(jìn)行復(fù)性；通過3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸再生系統(tǒng)，對復(fù)性后蛋白進(jìn)行酶活檢測，并應(yīng)用于底物n-脫乙酰/硫酸化的heparosan(nsnah)的硫酸化修飾中。

具體地，有如下步驟：

(4)復(fù)性：對于無生物活性的包涵體，必須經(jīng)復(fù)性使其正確折疊為可溶性蛋白。本實驗采取透析方式進(jìn)行復(fù)性。主要方法是將包涵體溶解于變性液中，并裝入透析袋。透析液初始為含6m尿素的變性液，而后以0.8ml/min的速度加入1.5l復(fù)性液；

(5)酶活測定：復(fù)性結(jié)束后，10000rpm離心10min，取上清，即為復(fù)性成功的可溶性的目的蛋白。利用3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸再生系統(tǒng)進(jìn)行酶活測定。3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1的酶活定義為37℃，ph7.0的條件下1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物或1nmol硫酸基團(tuán)的酶量。酶活計算公式如下：

公式中各參數(shù)的意義：abst＝5和abst＝20分別是酶促反應(yīng)5min和20min時反應(yīng)體系的od400值，ε0摩爾消光系數(shù)數(shù)值為10.5×10^-3，rt為反應(yīng)時間，[3ost]為酶的濃度，1表示反應(yīng)體系的體積，1000表示μmol到nmol的單位轉(zhuǎn)換。

(6)3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1對nsnah的硫酸化修飾：反應(yīng)總體積為20ml，實驗組中依次加入20mgnsnah、8ml3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸、5ml芳香磺基轉(zhuǎn)移酶(ast-iv)、3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1蛋白5ml；將其于37℃溫浴5分鐘后，加入2ml3’-磷酸腺苷-5’-磷酸；反應(yīng)在37℃中進(jìn)行，每隔10分鐘測定實驗組與對照組在400nm處的吸光值，直到od值不再發(fā)生變化；將樣品煮沸5分鐘，過濾除蛋白后，進(jìn)行透析、濃縮并凍干。

本發(fā)明可有效地獲得重組酶硫酸乙酰肝素3-o磺基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，并成功用于合成硫酸乙酰肝素。

附圖說明

圖1為實施例一的3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1pcr擴(kuò)增凝膠電泳圖。

圖2為實施例一的3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1基因序列。

圖3為實施例一的3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1基因序列優(yōu)化前后的對比。

圖4為實施例一的3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1誘導(dǎo)表達(dá)后的對照電泳圖。

圖5為實施例二的3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1復(fù)性后的對照電泳圖。

圖6為實施例二中nsnah(a)與nsna3shp(b)的1h-nmr核磁共振圖譜對比圖。

具體實施方式

實施例一重組酶硫酸乙酰肝素3-o磺基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)

(1)實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)：根據(jù)已報道的褐家鼠3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1基因(genbank登錄號：no.nm_053391.1)設(shè)計了一對特異性引物，在引物中加入限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和hindⅲ兩個酶切位點。以wistar大鼠大腦總rna為模板，利用實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)技術(shù)擴(kuò)增得到3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1基因片段。將pcr得到的片段與pmd-19-t載體連接，并導(dǎo)入大腸桿菌dh5α感受態(tài)中，用藍(lán)白斑篩選與菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行驗證。結(jié)果如圖1(泳道1：標(biāo)記；泳道2、3：3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)dna片段)。

從圖中可以發(fā)現(xiàn)，在1000bp處存在明顯條帶，且該pcr產(chǎn)物與美國國家生物技術(shù)信息中心(ncbi)報道的褐家鼠3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1基因(936bp)長度基本一致。為進(jìn)一步確定pcr產(chǎn)物，將其交由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果見圖2。

利用軟件(dnaman)對比測序結(jié)果與褐家鼠3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1基因序列。可以發(fā)現(xiàn)，兩者同源性為99％，存在5個堿基的差異。

(2)密碼子優(yōu)化：對序列進(jìn)行稀有密碼子分析，同時委托蘇州泓迅生物科技有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化前后的序列對比如圖3。

(3)表達(dá)：密碼子優(yōu)化后的基因連接在pet-28a載體。利用熱轉(zhuǎn)法將質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)宿主大腸桿菌bl21(de3)中。抗性篩選后，利用異丙基硫代半乳糖苷(iptg)進(jìn)行誘導(dǎo)，使目的蛋白表達(dá)。對誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，破碎液作為總蛋白樣品，離心取上清與沉淀分別作為可溶性與非可溶性蛋白樣品，進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳(sds-page)。經(jīng)聚丙烯酰氨凝膠電泳(sds-page)鑒定，目的蛋白主要以包涵體形式存在于非可溶性蛋白樣品中。如圖4所示(m:標(biāo)記；泳道1:未經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌bl21(de3)/pet-28a-3ost-1細(xì)胞總蛋白；泳道2:經(jīng)1mmol/l異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)的大腸桿菌bl21(de3)/pet-28a-3ost-1細(xì)胞總蛋白；泳道3:經(jīng)1mmol/l異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)的大腸桿菌bl21(de3)/pet-28a-3ost-1的細(xì)胞破碎液上清中蛋白；泳道4:經(jīng)1mmol/l異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)的大腸桿菌bl21(de3)/pet-28a-3ost-1細(xì)胞破碎液沉淀中蛋白)。

從圖4可以看出，與對照相比，誘導(dǎo)后的總蛋白在29-44.3千道爾頓之間存在明顯的條帶加粗。利用軟件(dnaman)對融合蛋白大小進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)目的蛋白理論大小為37.3千道爾頓，而圖中加粗條帶經(jīng)軟件(un-scan-itgel6.1)分析，分子量為37.4千道爾頓，兩者基本相等。證明已成功表達(dá)了3ost-1蛋白。然而目的蛋白并沒有存在于細(xì)胞破碎后的上清中，而是存在于破碎后的沉淀中，說明目的蛋白是以不可溶的包涵體形式存在于細(xì)胞中。

實施例二在合成硫酸乙酰肝素中的應(yīng)用

(4)復(fù)性：對于無生物活性的包涵體，必須經(jīng)復(fù)性使其正確折疊為可溶性蛋白。本實驗采取透析方式進(jìn)行復(fù)性。主要方法是將包涵體溶解于變性液中，并裝入透析袋。透析液初始為含6mol/l尿素的變性液，而后以0.8ml/min的速度加入1.5l復(fù)性液，以達(dá)到逐漸降低透析液中尿素含量的目的。結(jié)果如圖5所示(m:標(biāo)記；泳道1:未經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌bl21(de3)/pet-28a-3ost-1細(xì)胞總蛋白；泳道2:經(jīng)1mmol/l異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)的大腸桿菌bl21(de3)/pet-28a-3ost-1細(xì)胞總蛋白；泳道3:經(jīng)1mmol/l異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)的大腸桿菌bl21(de3)/pet-28a-3ost-1的細(xì)胞破碎液上清中蛋白；泳道4:經(jīng)1mmol/l異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)的大腸桿菌bl21(de3)/pet-28a-3ost-1細(xì)胞破碎液沉淀中蛋白；泳道5:經(jīng)1mmol/l異丙基硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)的大腸桿菌bl21(de3)/pet-28a-3ost-1細(xì)胞破碎液沉淀復(fù)性后蛋白)。

圖5結(jié)果顯示，目的蛋白包涵體經(jīng)復(fù)性后，樣品中雜條帶較少，條帶位置正確。

(5)酶活測定：復(fù)性結(jié)束后，10000rpm離心10min，取上清，即為復(fù)性成功的可溶性的目的蛋白。利用3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸再生系統(tǒng)進(jìn)行酶活測定。3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1的酶活定義為37℃，ph7.0的條件下1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1nmol底物或1nmol硫酸基團(tuán)的酶量。酶活計算公式如下：

公式中各參數(shù)的意義：abst＝5和abst＝20分別是酶促反應(yīng)5min和20min時反應(yīng)體系的od400值，ε0摩爾消光系數(shù)數(shù)值為10.5×10^-3，rt為反應(yīng)時間，[3ost]為酶的濃度，1表示反應(yīng)體系的體積，1000表示μmol到nmol的單位轉(zhuǎn)換。

(6)3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1對nsnah的硫酸化修飾：反應(yīng)總體積為20ml，實驗組中依次加入20mgn-脫乙酰/硫酸化的heparosan(nsnah)、8ml3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸、5ml芳香磺基轉(zhuǎn)移酶(ast-iv)、3-o-硫酸轉(zhuǎn)移酶-1蛋白5ml，對照組中不加入nsnah，其他同實驗組。將兩個組分于37℃溫浴5分鐘后，加入2ml3’-磷酸腺苷-5’-磷酸。反應(yīng)在37℃中進(jìn)行，每隔10分鐘測定實驗組與對照組在400nm處的吸光值，直到od值不再發(fā)生變化。將樣品煮沸5分鐘，過濾除蛋白后，進(jìn)行透析、濃縮并凍干，用¹h-nmr進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖6所示(glcns3s:2,3-二硫酸化葡萄糖胺；glcnac:n-乙?；咸烟前?；glca:葡萄糖胺；glcns:3-硫酸化葡萄糖胺；ac:乙?；?。

結(jié)果顯示，nsnah經(jīng)修飾后，在3.43ppm處出現(xiàn)了明顯的2,3-二硫酸化葡萄糖胺(glcns3s)h2新峰，表明3-硫酸化-n-脫乙酰/硫酸化的heparosan(nsna3shp)已被成功制備。而5.50ppm處的2,3-二硫酸化葡萄糖胺(glcns3s)h1的峰與n-乙酰基葡萄糖胺(glcnac)h1非常接近，并不能明顯地從圖中分辨出。