本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種外周血nk細(xì)胞(naturalkillercell)體外高效擴(kuò)增方法的培養(yǎng)。

背景技術(shù)：

nk細(xì)胞即自然殺傷細(xì)，1975年被發(fā)現(xiàn)，屬于非吞噬淋巴細(xì)胞，胞漿富含穿孔素和顆粒酶，具有識(shí)別和溶解腫瘤細(xì)胞的功能。其主要來(lái)源于骨髓cd34⁺的淋巴細(xì)胞，主要存在于外周血，占外周血淋巴細(xì)胞的5％-15％，在脾臟，肝臟，虹膜，淋巴結(jié)均有表達(dá)。nk細(xì)胞的表型為cd3^-cd56⁺，有兩種亞型cd56^bright和cd56^dim；cd56^brightnk細(xì)胞主要功能是分泌細(xì)胞因子，cd56^dimnk細(xì)胞有細(xì)胞毒性，占外周血nk細(xì)胞的90％。nk細(xì)胞主要通過(guò)天然的細(xì)胞毒作用，adcc效應(yīng)及分泌免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子作用誘導(dǎo)殺傷腫瘤細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞，分泌的一些細(xì)胞因子還可以調(diào)節(jié)t細(xì)胞，b細(xì)胞，dc細(xì)胞，m細(xì)胞的功能和分化。在機(jī)體免疫監(jiān)視，對(duì)抗病原體侵襲和防止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。nk細(xì)胞的作用機(jī)制：1.直接通過(guò)細(xì)胞胞吐作用釋放穿孔素和顆粒酶，活化caspase途徑進(jìn)而誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡；2.表達(dá)fas(cd95)配體與trail分子，誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生凋亡；3.細(xì)胞因子介導(dǎo)的殺傷細(xì)胞作用；4.adcc作用。與t細(xì)胞相比，nk細(xì)胞識(shí)別抗原沒(méi)有mhc限制，可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞和外來(lái)病原體；同時(shí)nk細(xì)胞還分泌一些調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子。近些年，臨床上將nk細(xì)胞用于免疫治療的例子在不斷增多，導(dǎo)致對(duì)nk細(xì)胞的需求也越來(lái)越大。

目前，體外擴(kuò)增nk系統(tǒng)主要通過(guò)以下三種方法：1采用飼養(yǎng)細(xì)胞(基因修飾)的方法培養(yǎng)pbmc中的nk細(xì)胞；2是采用免疫磁珠的方法從pbmc中將nk細(xì)胞分離出來(lái)再培養(yǎng)；3單純的細(xì)胞因子組合刺激pbmc中nk細(xì)胞的擴(kuò)增。采用飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)nk細(xì)胞可以獲得高純度大量的nk細(xì)胞，但引入了人源細(xì)胞，存在安全隱患；采用免疫磁珠的方法可以快速的獲得少量nk細(xì)胞，但只能用于nk細(xì)胞研究，量少不適用于臨床，且成本高，操作復(fù)雜；現(xiàn)有的細(xì)胞因子組合刺激pbmc中nk細(xì)胞的擴(kuò)增的方法僅能使nk細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)在150倍左右，nk細(xì)胞純度在60％左右，且數(shù)量和純度上都無(wú)法滿足治療性的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種外周血nk細(xì)胞體外高效擴(kuò)增方法，即無(wú)需對(duì)nk細(xì)胞進(jìn)行磁珠純化，也不需飼養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)使用本發(fā)明的細(xì)胞因子組合就可以得到大量高效的nk細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單，完全可以滿足臨床需要。

本發(fā)明所提供的外周血nk細(xì)胞體外高效擴(kuò)增方法，是將外周血單核淋巴細(xì)胞接種到預(yù)先用cd16單抗，cd56單抗和cd3單抗進(jìn)行包被的培養(yǎng)容器中，并在培養(yǎng)過(guò)程中添加細(xì)胞因子il-15再次活化nk細(xì)胞。

本發(fā)明的外周血nk細(xì)胞體外高效擴(kuò)增方法，其具體的操作步驟如下：

1)培養(yǎng)瓶的包被：

將溶有cd3單抗、cd16單抗和cd56單抗的pbs作為包被液，將包被液加入到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行包被；

所述的包被液中，cd3單抗、cd16單抗和cd56單抗的濃度范圍分別為；1ng～100ng/ml，1μg～20μg/ml，1μg～20μg/ml。cd3單抗、cd16單抗和cd56單抗的優(yōu)選濃度分別為10ng/ml，5μg/ml，5μg/ml。

包被的具體條件如下：4℃避光4-24小時(shí)或者室溫避光2-4個(gè)小時(shí)或者37℃避光1個(gè)小時(shí)；

2)細(xì)胞接種：用淋巴分離液從外周血中分離獲得人外周血單核細(xì)胞(pbmc)，將人外周血單核細(xì)胞接種到預(yù)先包被的培養(yǎng)瓶中，并添加10％的自體血漿和終濃度為500iu/ml的il-2，37℃，5％co2培養(yǎng)；

3)擴(kuò)大培養(yǎng)：接種后的細(xì)胞在培養(yǎng)到第3天時(shí)，補(bǔ)充培養(yǎng)基gt-t551h3和終濃度為200iu/ml的il-2，37℃，5％co2培養(yǎng)，

4)二次刺激：第五天補(bǔ)加補(bǔ)充培養(yǎng)基gt-t551h3，終濃度為200iu/ml的il-2和終濃度為50ng/ml的il-15對(duì)nk細(xì)胞進(jìn)行二次刺激；

5)擴(kuò)大培養(yǎng)：每隔2-3天補(bǔ)加培養(yǎng)基gt-t551h3和終濃度為200iu/ml的il-2；

6)收獲細(xì)胞：在培養(yǎng)的第17天，離心收集全部培養(yǎng)所得細(xì)胞。

本發(fā)明利用cd16單抗，cd56單抗在低濃度cd3單抗共刺激外周血中單個(gè)核細(xì)胞的nk細(xì)胞擴(kuò)增，在培養(yǎng)至第五天的時(shí)候加入il-15細(xì)胞因子，二次刺激nk細(xì)胞活化和增殖，此方法可以使nk細(xì)胞大量擴(kuò)增，增強(qiáng)其殺傷能力。本發(fā)明得到大量高純度的nk細(xì)胞，滿足臨床需求。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1-3與對(duì)比實(shí)施例1-3第5-17天細(xì)胞增殖曲線的結(jié)果圖；

圖2為實(shí)施例1-3與對(duì)比實(shí)施例1-3得到nk細(xì)胞比例結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所用的試劑和材料描述如下：

cd16單抗：鼠抗人cd16單克隆單抗，購(gòu)于beckmancoμlter公司

cd56單抗：鼠抗人cd56單克隆單抗，購(gòu)于biolegend公司

il-15：重組人白細(xì)胞介素15，購(gòu)于上海近岸公司

il-2：重組人白細(xì)胞介素2，購(gòu)于江蘇金絲利公司

gt-t551h3培養(yǎng)基：購(gòu)于taraka有限公司。

本發(fā)明方法的總體步驟如下：

1)培養(yǎng)瓶的包被：分別將cd16單抗25微克，cd56單抗25微克，cd3單抗50納克溶于5毫升的pbs后，加入到底面積為75平方厘米的培養(yǎng)瓶中，4℃避光4-24小時(shí)或者室溫避光2-4個(gè)小時(shí)或者37℃避光1個(gè)小時(shí)；

2)細(xì)胞接種：用淋巴分離液從外周血中分離獲得單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，取樣計(jì)數(shù)后，接種到預(yù)先包被的培養(yǎng)瓶中，添加10％的自體血漿,il-2濃度為200iu/ml；

3)擴(kuò)大培養(yǎng)：接種后的細(xì)胞在培養(yǎng)到第3天時(shí)，補(bǔ)充培養(yǎng)基gt-t551h3和終濃度為200iu/ml的il-2，37℃，5％co2培養(yǎng)，細(xì)胞濃度維持在5x10⁵cells/ml左右；

4)二次刺激：第五天補(bǔ)加補(bǔ)充培養(yǎng)基gt-t551h3，終濃度為200iu/ml的il-2和終濃度為50ng/ml的il-15對(duì)nk細(xì)胞進(jìn)行二次刺激；

5)擴(kuò)大培養(yǎng)/轉(zhuǎn)袋培養(yǎng)：以后每隔2-3天補(bǔ)加培養(yǎng)基gt-t551h3和終濃度為200iu/ml的il-2，細(xì)胞濃度維持在5x10⁵cells/ml左右；

6)收獲細(xì)胞：在培養(yǎng)的第17天，取1毫升的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式檢測(cè)，計(jì)算nk細(xì)胞的增殖倍數(shù)和純度。離心收集全部培養(yǎng)所得細(xì)胞。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1

1)培養(yǎng)瓶的包被：分別cd16單抗25微克，cd56單抗25微克，cd3單抗50納克溶于5毫升的pbs中充分溶解，加入到底面積為75平方厘米的培養(yǎng)瓶中，4℃避光過(guò)夜；

2)細(xì)胞接種：a外周血40ml，全血700g離心15min；b自體血漿制備：取上層血漿21ml，56℃，滅活30min，4℃，靜置15min，900g，離心15min,上清為自體血漿備用；c取中間白膜層(單個(gè)核細(xì)胞)大概5ml到15mlpbs中，稀釋混勻；d然后將稀釋的單核細(xì)胞緩慢的加到淋巴分離液的表面，使白膜層和籬笆分離液之間有清晰分層，淋巴分離液與單核細(xì)胞液的比例為3∶4，800g離心20mim；e洗滌pbmc，用巴斯德吸管將離心后中間白色的pbmc層吸出，在新的50ml離心管中加入30ml左右pbs清洗，1500rpm，8min；f細(xì)胞計(jì)數(shù)；g配制細(xì)胞懸液：用gt-t551h3培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，配制成細(xì)胞濃度為1x10⁶cells/ml的懸液20ml，混勻；h清洗培養(yǎng)瓶：取出包被過(guò)的培養(yǎng)瓶，棄包被液，6mlpbs洗一次，然后再用6ml培養(yǎng)基洗一次；i接種細(xì)胞：將20ml細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶，另外再加入2.2ml的自體血漿，終濃度10％。il-2(1000iu/ml)11μl，終濃度為500iu/ml，37℃，5％co2培養(yǎng)；

3)擴(kuò)大培養(yǎng)：接種后的細(xì)胞在培養(yǎng)到第3天時(shí)，補(bǔ)充培養(yǎng)基gt-t551h340ml和終濃度為200iu/ml的il-2，37℃，5％co2培養(yǎng)，細(xì)胞濃度維持在5x10⁵cells/ml左右；

4)二次刺激：第五天，平分轉(zhuǎn)入兩個(gè)透氣的細(xì)胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)添加培養(yǎng)基gt-t551h370ml，添加il-2(1000iu/ml)20μl，il-15(1μg/ml)5μl，37℃，5％co2培養(yǎng)；

5)擴(kuò)大培養(yǎng)：第七天，每袋添加培養(yǎng)基gt-t551h3300ml，il-2(1000iu/ml)80μl，37℃，5％co2培養(yǎng)；第九天，每袋添加培養(yǎng)基gt-t551h3350ml，il-2(1000iu/ml)150μl，37℃，5％co2培養(yǎng)；第十一天，每袋添加培養(yǎng)基gt-t551h3350ml，il-2(1000iu/ml)220μl，37℃，5％co2培養(yǎng)；第十三天，每袋添加培養(yǎng)基gt-t551h3500ml，il-2(1000iu/ml)320μl，37℃，5％co2培養(yǎng)；

6)收獲細(xì)胞：在培養(yǎng)的第17天，取1毫升的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式檢測(cè)，計(jì)算nk細(xì)胞的增殖倍數(shù)和純度。離心收集全部培養(yǎng)所得細(xì)胞。

檢測(cè)結(jié)果表明第17天nk細(xì)胞的純度為94.55％，細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)為455倍，最后收獲細(xì)胞量為9.1x10⁹個(gè)。

按照上述步驟，重復(fù)實(shí)驗(yàn)7次，pbmcs細(xì)胞增殖倍數(shù)的平均值為400倍，nk細(xì)胞比例占85％以上，最高比例達(dá)94.55％。

實(shí)施例2

為了驗(yàn)證較低和較高濃度細(xì)胞因子組合是否會(huì)影響nk細(xì)胞的增殖及其純度，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了兩組實(shí)施例，第一組實(shí)施例2中nk細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程cd3單抗，cd16單抗，cd56單抗?jié)舛炔煌c實(shí)施例1，實(shí)施例2中使用的為組合中的較低濃度，其中cd3單抗的終濃度為1ng/ml，cd16單抗的濃度為終5μg/ml，cd56單抗的終濃度為5μg/ml。第二組實(shí)施例3中nk細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程cd3單抗，cd16單抗，cd56單抗?jié)舛纫膊煌c實(shí)施例1，實(shí)施例3中使用的為組合中的較高濃度，實(shí)施例3中cd3單抗的濃度為100ng/ml，cd16單抗的濃度為20μg/ml，cd56單抗的濃度為20μg/ml。

對(duì)比例1

為了觀察本發(fā)明的nk細(xì)胞擴(kuò)增效果，設(shè)計(jì)了一下3組對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

對(duì)比例1按照專利nk細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞培養(yǎng)方法，專利號(hào)：201610905270.6的培養(yǎng)方法培養(yǎng)nk細(xì)胞。

對(duì)比例2

按照專利一種nk細(xì)胞的制備方法，專利號(hào)：201610633811.4，的培養(yǎng)方法培養(yǎng)nk細(xì)胞。

對(duì)比例3

按照專利一種體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法及其獲得的nk細(xì)胞，專利號(hào)：201610331306.4的培養(yǎng)方法培養(yǎng)nk細(xì)胞。

細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)

分別對(duì)實(shí)施例1-2和對(duì)比例1-3培養(yǎng)第5天，第9天，第13天和第17天的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)統(tǒng)計(jì)，繪制細(xì)胞增殖曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

結(jié)論：本發(fā)明實(shí)施例1的nk細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)相較實(shí)施例2,3和對(duì)比例1,3更高，細(xì)胞增殖更快。

nk細(xì)胞比例實(shí)驗(yàn)

分別對(duì)實(shí)施例1-2和對(duì)比例1-3培養(yǎng)的第17天的細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)nk細(xì)胞比例，結(jié)果見(jiàn)圖2。

結(jié)論：本發(fā)明實(shí)施例1的nk細(xì)胞比率較實(shí)施例2,3和對(duì)比例1-3的更高，nk細(xì)胞純度更好。

本發(fā)明所制備nk細(xì)胞在培養(yǎng)第17天時(shí)，純度達(dá)到85％以上，增殖倍數(shù)超過(guò)400倍，是單純細(xì)胞因子刺激擴(kuò)增倍數(shù)的200％以上；操作簡(jiǎn)單，沒(méi)有引入飼養(yǎng)細(xì)胞污染，且不需要對(duì)nk細(xì)胞進(jìn)行純化，節(jié)約成本，滿足臨床需求。

以上實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明詳細(xì)描述，但其只是作為范例，且不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何等同修改，替換，改進(jìn)等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。