本發(fā)明涉及生物治療與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
水蛭素是迄今發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的天然凝血酶特異性抑制劑，最初從醫(yī)用水蛭唾液腺中分離得到，由65～66個(gè)氨基酸組成，可直接與凝血酶以l：l(摩爾比)的方式結(jié)合形成非共價(jià)復(fù)合物，從而使凝血酶失去裂解纖維蛋白原的能力，抑制血栓的形成。天然水蛭素存在十種以上變體，主要有簡(jiǎn)稱為hv1、hv2、hv3三種同源性很高的異構(gòu)體(hirudinvariant)。
目前，國外已有兩個(gè)重組水蛭素產(chǎn)品批準(zhǔn)上市：1.desirudin(商品名：revasc，瑞士novartis產(chǎn)品)；2.lepirudin(商品名：refludan，英國pharmion及美國berlexlaboratories產(chǎn)品)。兩者結(jié)構(gòu)上僅在n-端存在微小差異，desirudin為val1-val2，而lepirudin為leu1-tyr2。desirudin用于手術(shù)時(shí)深度靜脈血栓(dvt)的預(yù)防與治療，lepirudin用于肝素誘導(dǎo)的血小板減少性疾病病人的抗凝治療。此外，水蛭素在防治不穩(wěn)定性心絞痛、彌散性血管內(nèi)凝血、腦凝血、血栓靜脈炎及冠狀動(dòng)脈血栓等方面都具有巨大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。
在多種惡性腫瘤患者中存在著血液高凝狀態(tài)，如肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等。惡性腫瘤患者血液中的高凝狀態(tài)，不僅能促進(jìn)體內(nèi)血栓形成，而且與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲以及轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。凝血功能變化可引起腫瘤細(xì)胞表型和活性改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、纖維結(jié)合蛋白(fibrinectin)以及vonwillebrandfactor(vwf)的黏附，從而使腫瘤細(xì)胞在局部增殖、浸潤(rùn)甚至向其他部位轉(zhuǎn)移。血栓性疾病是僅次于腫瘤轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤患者第二大致死因素。對(duì)血栓形成高危的腫瘤患者及早進(jìn)行藥物性干預(yù)，對(duì)于延長(zhǎng)患者生存期、降低死亡率有重要意義。研究表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發(fā)揮作用。重組水蛭素通過其抗凝作用，抑制纖維蛋白的形成，能防止腫瘤細(xì)胞與血纖維蛋白或血小板凝集，使nk細(xì)胞或其他細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞的活性得以發(fā)揮。已證明水蛭素治療可發(fā)揮療效的腫瘤有纖維肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤和白血病等。水蛭素還可配合化療和放療，通過促進(jìn)腫瘤中的血流改善乏氧狀態(tài)而增強(qiáng)療效。
動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究表明，靜脈或皮下注射水蛭素均無明顯毒副作用，半致死劑量遠(yuǎn)大于治療所需劑量，機(jī)體易接受，免疫性弱，不影響血小板、纖維蛋白原水平和血紅蛋白含量，不易通過血腦脊液屏障。無論急性、亞急性的毒性試驗(yàn)，水蛭素對(duì)呼吸、血壓、心率均不影響。
水蛭素作為一種高效、直接、特異的凝血酶抑制劑，具有很強(qiáng)的抗凝、抗血栓以及抗炎等多種藥理活性。與肝素等傳統(tǒng)的抗凝藥物相比，其治療劑量小、療效高、不會(huì)引起過敏反應(yīng)。水蛭素有抗原性，但其抗體沒有害，反而延長(zhǎng)消除半衰期，是一種少見的正效果抗體。因此水蛭素的應(yīng)用將會(huì)不斷得到開拓和推廣，重組水蛭素將會(huì)成為新一代的抗凝、抗栓和抗腫瘤新藥。
水蛭素的缺陷之一是臨床應(yīng)用存在一定的出血危險(xiǎn)。水蛭素可導(dǎo)致凝血相關(guān)參數(shù)，如活化部分凝血活酶時(shí)間(aptt)、凝血酶時(shí)間(tt)和凝血酶原時(shí)間(pt)等明顯升高，從而可能引起全身或系統(tǒng)性出血風(fēng)險(xiǎn)。為此，國內(nèi)吳祖澤等通過在水蛭素的氨基末端連接上可被凝血因子?a(f?a)和ⅹa(fⅹa)識(shí)別并裂解的寡肽。當(dāng)體內(nèi)凝血系統(tǒng)被激活發(fā)生血栓時(shí)，利用血栓發(fā)生過程中引發(fā)的生物化學(xué)變化的特點(diǎn)，使氨基末端被封閉的水蛭素重新回復(fù)為水蛭素原形，在可能發(fā)生或已發(fā)生的血栓的局部發(fā)揮特異性抗凝作用，從而降低出血副作用，成為一類新型、安全、有效的抗凝劑。
水蛭素的另一缺陷是半衰期短。水蛭素在體內(nèi)無降解，以活性成分經(jīng)腎臟排泄，水蛭素從血漿消除較快。研究表明，水蛭素的抗凝作用完全取決于其血漿水平，因?yàn)槠洳粌H在血液轉(zhuǎn)運(yùn)，而且作用部位也僅在血循環(huán)系統(tǒng)。水蛭素給藥方式主要為注射給藥，維持藥效時(shí)間僅一個(gè)多小時(shí)，難以滿足慢性高凝狀態(tài)疾病患者長(zhǎng)期抗凝治療的需要，給需要長(zhǎng)期抗凝的患者帶來很大的痛苦和不便，因此臨床期待著更加方便有效的非注射給藥方法。此外，從天然水蛭組織中或基因工程發(fā)酵物中提取水蛭素，受到材料來源的限制，純化產(chǎn)物往往帶有雜蛋白的污染，不利于臨床經(jīng)靜脈使用。
為解決水蛭素注射劑易經(jīng)腎排泄半衰期短、對(duì)制備純度要求較高、經(jīng)常注射患者依從性差等問題，本發(fā)明因此而來。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞及其制備方法和用途，至少能夠解決上述問題之一。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞，過繼免疫細(xì)胞為人源免疫細(xì)胞，過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素包括信號(hào)肽和水蛭素。
重組水蛭素的氨基末端連接上信號(hào)肽，將其編碼基因利用基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)染過繼免疫細(xì)胞，回輸患者后，在腫瘤患者體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)重組水蛭素，發(fā)揮“微型細(xì)胞藥廠”的作用。如此，通過過繼免疫細(xì)胞作為載體細(xì)胞，可在體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)重組水蛭素，有效解決水蛭素半衰期短的弊端。
在一些實(shí)施方式中，信號(hào)肽為人源分泌信號(hào)肽，
在一些實(shí)施方式中，水蛭素為水蛭素異構(gòu)體、水蛭素突變體、水蛭素嵌合體、截短的水蛭肽、基因修飾的水蛭素或水蛭素融合蛋白。
在一些實(shí)施方式中，過繼免疫細(xì)胞為αβt、γδt、nkt、nk、dc、cik、car-t、car-nk、tcr-t中的一種或多種，上述的過繼免疫細(xì)胞為天然或人工培養(yǎng)的免疫細(xì)胞。
在一些實(shí)施方式中，水蛭素為水蛭素異構(gòu)體hv1，重組水蛭素的氨基酸序列為：seqidno.1，基因序列為：seqidno.2；
或者，水蛭素為水蛭素異構(gòu)體hv2，重組水蛭素的氨基酸序列為：seqidno.3，基因序列為：seqidno.4；
或者，水蛭素為水蛭素異構(gòu)體hv3，重組水蛭素的氨基酸序列為：seqidno.5，基因序列為：seqidno.6；
或者，水蛭素為水蛭素突變體，將野生型水蛭素(hv-3)肽鏈的ser32-asn33-gly34-lys35替換為arg32-gly33-asp34-ser35(rgds)，重組水蛭素的氨基酸序列為：seqidno.7，基因序列為：seqidno.8；
或者，水蛭素為水蛭素突變體，將野生型水蛭素(hv-3)肽鏈的ser32-asn33-gly34-lys35替換為arg32-gly33-asp34-met35(rgdm)，所述重組水蛭素的氨基酸序列為：seqidno.9，基因序列為：seqidno.10；
或者，水蛭素為水蛭素嵌合體，將野生型水蛭素hv-1和hv-3嵌合表達(dá)，所述重組水蛭素的氨基酸序列為：seqidno.11，基因序列為：seqidno.12。
或者，所述水蛭素為水蛭素融合蛋白，水蛭素氨基末端連接有可被凝血因子ⅹa識(shí)別并裂解的寡肽，所述重組水蛭素的氨基酸序列為：seqidno.13，基因序列為：seqidno.14；
或者，所述水蛭素為水蛭素嵌合體，將野生型水蛭素hv-1和hv-3嵌合表達(dá)，嵌合水蛭素氨基末端連接有可被凝血因子ⅹa識(shí)別并裂解的寡肽，所述重組水蛭素的氨基酸序列為：seqidno.15，基因序列為：seqidno.16；
或者，所述水蛭素為水蛭素突變體，將野生型水蛭素(hv-3)肽鏈的ser32-asn33-gly34-lys35替換為arg32-gly33-asp34-met35(rgdm)，水蛭素氨基末端連接有可被凝血因子ⅹa識(shí)別并裂解的寡肽，所述重組水蛭素的氨基酸序列為：seqidno.17，基因序列為：seqidno.18；
或者，所述水蛭素為水蛭素異構(gòu)體hv1，水蛭素氨基末端連接有可被凝血因子ⅹa識(shí)別并裂解的寡肽，所述重組水蛭素的氨基酸序列為：seqidno.19，基因序列為：seqidno.20。
在一些實(shí)施方式中，重組水蛭素組成性表達(dá)或通過偶聯(lián)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
在一些實(shí)施方式中，過繼免疫細(xì)胞表達(dá)自殺基因/前藥系統(tǒng)。
目前已經(jīng)了解，水蛭素分子的氨基末端是其核心部分，含三對(duì)二硫鍵(cys6-cys14，cys16-cys28，cys32-cys39)，使氨基末端肽鏈繞迭成密集形核心環(huán)肽結(jié)構(gòu)，與凝血酶的催化活性位點(diǎn)結(jié)合；而羧基末端為一無規(guī)則伸展的鏈狀結(jié)構(gòu)，其中g(shù)ln49～gly54有空間和疏水作用，而asp55～pro60富含酸性氨基酸，帶有負(fù)電荷，易與凝血酶堿性的底物識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合。hv1/hv2的ser32-asp33-gly34-glu35或hv3的ser32-asn33-gly34-lys35為一突出于β-折疊間的loop結(jié)構(gòu)，構(gòu)象自由，對(duì)活性無明顯作用。研究發(fā)現(xiàn)，hv3的羧基末端(hv354-66)與凝血酶的結(jié)合能力比hv1的羧基末端(hv154-65)更強(qiáng)。根據(jù)水蛭素的以上特性，將野生型水蛭素hv3肽鏈的ser32-asn33-gly34-lys35替換為arg32-gly33-asp34-ser35(rgds)。rgd序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成，存在于多種細(xì)胞外基質(zhì)中，可與11種整合素特異性結(jié)合。該序列肽能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制包括纖維蛋白在內(nèi)的各種粘附蛋白與血小板的結(jié)合，可達(dá)到抑制血小板與纖維蛋白結(jié)合的目的。rgd修飾水蛭素(hv3-rgd)具有抗血小板聚集能力。
在一些實(shí)施方式中，過繼免疫細(xì)胞的膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面。方便檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)染效率、分離純化重組免疫細(xì)胞、體內(nèi)監(jiān)測(cè)過繼免疫細(xì)胞的增殖情況和在必要時(shí)通過相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)抗體靶向滅活過繼免疫細(xì)胞。
在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)分子為cd19的全長(zhǎng)或其截短片段，或cd20的全長(zhǎng)或其截短片段。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：體外培養(yǎng)人源免疫細(xì)胞，制備編碼重組水蛭素和膜型分子靶標(biāo)的基因載體，基因載體由信號(hào)肽序列-水蛭素序列和信號(hào)肽序列-靶標(biāo)分子序列-linker序列-跨膜段序列組合而成；將上述編碼重組水蛭素和靶標(biāo)分子的基因載體通過基因轉(zhuǎn)染過繼免疫細(xì)胞。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞的用途，表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞用于抗凝治療、抗栓治療、抗腫瘤治療，用于降血脂保健、抗凝保健、抗栓保健，用于手術(shù)時(shí)深度靜脈血栓的預(yù)防與治療，用于肝素誘導(dǎo)的血小板減少性疾病患者的抗凝治療，防治不穩(wěn)定性心絞痛、彌散性血管內(nèi)凝血、腦凝血、血栓靜脈炎及冠狀動(dòng)脈血栓，防治高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化。
本發(fā)明的有益效果為：
1、以過繼免疫細(xì)胞為載體，在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)重組水蛭素或經(jīng)過基因修飾的重組水蛭素，可解決水蛭素半衰期短的弊端，無需短時(shí)間內(nèi)反復(fù)給藥，更加適合需要長(zhǎng)期抗凝、抗栓的患者。
2、以過繼免疫細(xì)胞為載體，在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)重組水蛭素，可避免反復(fù)給藥引起過敏或誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。
3、表達(dá)重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞同時(shí)膜表達(dá)靶標(biāo)分子，可作為靶標(biāo)檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)染效率、分離純化重組免疫細(xì)胞、體內(nèi)監(jiān)測(cè)過繼免疫細(xì)胞的增殖情況和在必要時(shí)通過相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)抗體靶向滅活過繼免疫細(xì)胞，使本技術(shù)臨床使用更加安全可控。
4、表達(dá)重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞可靶向腫瘤局部表達(dá)，改善腫瘤患者高凝狀態(tài)，溶解微血栓，防止腫瘤轉(zhuǎn)移，促進(jìn)免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤內(nèi)部發(fā)揮殺傷功能，可單獨(dú)應(yīng)用或臨床配合化/放療使用。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的說明。
本發(fā)明的表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞，過繼免疫細(xì)胞為人源免疫細(xì)胞，過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素包括信號(hào)肽和水蛭素。信號(hào)肽為人源信號(hào)肽。信號(hào)肽可以為人酰胺化酶(apm)信號(hào)肽、人il-2信號(hào)肽、人il-21信號(hào)肽中的一種。
人酰胺化酶(pam)信號(hào)肽的氨基酸序列為：
magrvpsllvllvfpsscla，
基因序列為：
atggctggccgcgtccctagcctgctagttctccttgtttttccaagcagctgtttggct。
過繼免疫細(xì)胞膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面，過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素包括信號(hào)肽和水蛭素。水蛭素為水蛭素異構(gòu)體、水蛭素突變體、水蛭素嵌合體、截短的水蛭肽、基因修飾的水蛭素或水蛭素融合蛋白。
靶標(biāo)分子為cd19的全長(zhǎng)或其截短片段，或cd20的全長(zhǎng)或其截短片段。過繼免疫細(xì)胞為αβt、γδt、nkt、nk、dc、cik、car-t、car-nk、tcr-t中的天然或人工培養(yǎng)的免疫細(xì)胞。優(yōu)選的過繼免疫載體細(xì)胞為cik、nk、nkt或γδt細(xì)胞，可同時(shí)發(fā)揮腫瘤的非特異性細(xì)胞免疫治療作用。
過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素的水蛭素氨基末端連接有可被凝血因子識(shí)別并裂解的寡肽。凝血因子為?a(f?a)和ⅹa(fⅹa)。
上述的可被凝血因子識(shí)別并裂解的寡肽有多種，例如，epr(基因序列g(shù)aacctagg)、iegr(基因序列atcgaaggtcgt)、lgpr(基因序列ttgggtccaaga)、lekrlgpr(基因序列ctcgagaaaagattgggtccaaga)、lekriegr(基因序列ctcgagaaaagaatcgaaggtcgt)。
重組水蛭素可以組成性表達(dá)，也可以偶聯(lián)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)為四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、蛻皮激素(ecdysone)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、他克莫司(tacrolimus，fk506)/雷帕霉素(rapamycin)誘導(dǎo)系統(tǒng)或ru486誘導(dǎo)系統(tǒng)中的一種。
表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞還表達(dá)自殺基因/前藥系統(tǒng)。自殺基因/前藥系統(tǒng)為單純皰疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊環(huán)鳥苷(hsv-tk/gcv)系統(tǒng)、帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(vzv-tk/ara-m)系統(tǒng)、胞嘧啶脫氨酶/5氟胞嘧啶(cd/5fc)系統(tǒng)、細(xì)胞色素p450微粒體酶cyp2b1/環(huán)磷酰胺(cyp2b1/cpa)系統(tǒng)；細(xì)胞色素p450cyp4b1/氨基蒽(cyp4b1/2aa)系統(tǒng)、脫氧胞苷激酶/阿糖胞苷(dck/ara-c)系統(tǒng)、烏苷-黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶/6-硫黃嘌呤(gpt/6tx)系統(tǒng)、硝基還原酶/cb1954(ntr/cb1954)系統(tǒng)、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脫氧核苷(pnp/6-mep-dr)系統(tǒng)、胸腺嘧啶磷酸化酶/5’-脫氧-5-氟尿嘧啶(tp/5’-dfur)系統(tǒng)、羧基肽酶g2/cmda系統(tǒng)(cpg2/cmda)、羧酸酯酶/cpt-11(ce/cpt-11)系統(tǒng)中的一種。
上述的表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：制備編碼重組水蛭素和膜型分子靶標(biāo)的基因載體，基因載體由信號(hào)肽序列-水蛭素序列和信號(hào)肽序列-靶標(biāo)分子序列-linker序列-跨膜段序列組合而成；將上述編碼重組水蛭素和靶標(biāo)分子的基因載體通過基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞。
基因工程技術(shù)為公知技術(shù)，所用基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)包括慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、睡美人轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。優(yōu)選的，采用睡美人轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染系統(tǒng)或電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。以瞬時(shí)表達(dá)載體，將重組水蛭素基因?qū)脒^繼免疫細(xì)胞，可使其外源基因表達(dá)量可控，避免過量表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。
編碼重組水蛭素和膜型分子靶標(biāo)的基因載體的結(jié)構(gòu)為：信號(hào)肽-重組水蛭素-ires-信號(hào)肽-靶標(biāo)分子-linker-跨膜段，或者，信號(hào)肽-靶標(biāo)分子-linker-跨膜段-p2a-信號(hào)肽-重組水蛭素。
上述的表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞用于抗凝治療、抗栓治療、抗腫瘤治療，用于降血脂保健、抗凝保健、抗栓保健，用于手術(shù)時(shí)深度靜脈血栓的預(yù)防與治療，用于肝素誘導(dǎo)的血小板減少性疾病患者的抗凝治療，防治不穩(wěn)定性心絞痛、彌散性血管內(nèi)凝血、腦凝血、血栓靜脈炎及冠狀動(dòng)脈血栓。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
實(shí)施例1
本實(shí)施例的表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞，其膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面，所述過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素包括信號(hào)肽和水蛭素。水蛭素為水蛭素異構(gòu)體hv1。過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為：信號(hào)肽-hv1，氨基酸序列為：seqidno.1，基因序列為：seqidno.2。
實(shí)施例2
本實(shí)施例的表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞，其膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面，所述過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素包括信號(hào)肽和水蛭素。水蛭素為水蛭素異構(gòu)體hv2，過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為：信號(hào)肽-hv2，氨基酸序列為：seqidno.3，基因序列為：seqidno.4
實(shí)施例3
本實(shí)施例的表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞，其膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面，所述過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素包括信號(hào)肽和水蛭素。水蛭素為水蛭素異構(gòu)體hv3，過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為：信號(hào)肽-hv3，氨基酸序列為：seqidno.5，基因序列為：seqidno.6。
實(shí)施例4
本實(shí)施例的表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞，其膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面，所述過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素包括信號(hào)肽和水蛭素。水蛭素為水蛭素突變體，將野生型水蛭素hv3肽鏈的ser32-asn33-gly34-lys35替換為arg32-gly33-asp34-ser35(rgds)，過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為：信號(hào)肽-hv3-rgds，氨基酸序列為：seqidno.7，基因序列為：seqidno.8。
該重組水蛭素同時(shí)具有抗血小板凝聚能力。
實(shí)施例5
本實(shí)施例的表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞，其膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面，所述過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素包括信號(hào)肽和水蛭素。水蛭素為水蛭素突變體，將野生型水蛭素hv3肽鏈的ser32-asn33-gly34-lys35替換為arg32-gly33-asp34-met35(rgdm)，過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為：信號(hào)肽-hv3-rgdm，氨基酸序列為：seqidno.9，基因序列為：seqidno.10
該重組水蛭素同時(shí)具有抗血小板凝聚能力。
實(shí)施例6
本實(shí)施例的表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞，其膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面，所述過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素包括信號(hào)肽和水蛭素。水蛭素為水蛭素嵌合體，將野生型水蛭素hv1和hv3嵌合表達(dá)，所述重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為人酰胺化酶(pam)信號(hào)肽-水蛭素hv1-hv3嵌合體，其氨基酸序列為：seqidno.11，基因序列為：seqidno.12。
實(shí)施例7
本實(shí)施例的水蛭素為水蛭素融合蛋白，水蛭素氨基末端連接有可被凝血因子ⅹa識(shí)別并裂解的寡肽，所述重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為人酰胺化酶(pam)信號(hào)肽-epr-水蛭素hv1，氨基酸序列為：seqidno.13，基因序列為：seqidno.14。
寡肽epr還可以由同等功效的短肽序列替換。
本實(shí)施例的重組水蛭素具有可被凝血因子ⅹa識(shí)別并裂解的寡肽epr，這樣既封閉了水蛭素在正常組織中的活性，降低了全身出血的風(fēng)險(xiǎn)，又可使重組水蛭素在血栓形成部位釋放具有生物活性的水蛭素原形，達(dá)到抗凝和抗栓的雙效目的。
實(shí)施例8
本實(shí)施例的水蛭素為水蛭素嵌合體，將野生型水蛭素hv1和hv3嵌合表達(dá)，嵌合水蛭素氨基末端連接有可被凝血因子ⅹa識(shí)別并裂解的寡肽，所述重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為人酰胺化酶(pam)信號(hào)肽-epr-水蛭素hv1-hv3嵌合體，氨基酸序列為：seqidno.15，基因序列為：seqidno.16
寡肽epr還可以由同等功效的短肽序列替換。
本實(shí)施例的重組水蛭素具有可被凝血因子ⅹa識(shí)別并裂解的寡肽epr，這樣既封閉了水蛭素在正常組織中的活性，降低了全身出血的風(fēng)險(xiǎn)，又可使重組水蛭素在血栓形成部位釋放具有生物活性的水蛭素原形，達(dá)到抗凝和抗栓的雙效目的。
實(shí)施例9
本實(shí)施例的表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞，其膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面。水蛭素為水蛭素突變體，將野生型水蛭素hv3肽鏈的ser32-asn33-gly34-lys35替換為arg32-gly33-asp34-met35(rgdm)，過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為：信號(hào)肽-寡肽epr-hv-3-rgds，氨基酸序列為：seqidno.17，基因序列為：seqidno.18。
寡肽epr還可以由同等功效的短肽序列替換。rgds可被同等功效的短肽序列替換。
本實(shí)施例的重組水蛭素具有可被凝血因子ⅹa識(shí)別并裂解的寡肽epr，這樣既封閉了水蛭素在正常組織中的活性，降低了全身出血的風(fēng)險(xiǎn)，又可使重組水蛭素在血栓形成部位釋放具有生物活性的水蛭素原形，達(dá)到抗凝和抗栓的雙效目的。
實(shí)施例10
本實(shí)施例的表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞，其膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面.水蛭素為水蛭素異構(gòu)體hv1，過繼免疫細(xì)胞表達(dá)的重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為：信號(hào)肽-寡肽epr-hv1-rgds，氨基酸序列為：seqidno.19，基因序列為：seqidno.20。
寡肽epr還可以由同等功效的短肽序列替換。水蛭素異構(gòu)體hv1可被hv2、hv3等其它水蛭素異構(gòu)體替換。
本實(shí)施例的重組水蛭素具有可被凝血因子ⅹa識(shí)別并裂解的寡肽epr，這樣既封閉了水蛭素在正常組織中的活性，降低了全身出血的風(fēng)險(xiǎn)，又可使epr-hv1在血栓形成部位釋放具有生物活性的水蛭素原形，達(dá)到抗凝和抗栓的雙效目的。
實(shí)施例11
制備實(shí)施例1～10任一表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞的方法，包括以下步驟：體外培養(yǎng)人源免疫細(xì)胞，制備編碼重組水蛭素和膜型分子靶標(biāo)的基因載體，基因載體由信號(hào)肽序列-水蛭素序列和信號(hào)肽序列-靶標(biāo)分子序列-linker序列-跨膜段序列組合而成；將上述編碼重組水蛭素和靶標(biāo)分子的基因載體通過基因轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞。
基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用睡美人轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。以瞬時(shí)表達(dá)載體，將重組水蛭素基因?qū)脒^繼免疫細(xì)胞，可使其外源基因表達(dá)量可控，避免過量表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。
編碼重組水蛭素和膜型分子靶標(biāo)的基因載體的結(jié)構(gòu)為：信號(hào)肽-水蛭素-ires-信號(hào)肽-靶標(biāo)分子-linker-跨膜段，或者，信號(hào)肽-靶標(biāo)分子-linker-跨膜段-p2a-信號(hào)肽-水蛭素。具體的，膜型分子靶標(biāo)結(jié)構(gòu)：gm-csfr信號(hào)肽-δcd20-linker-cd28跨膜段，δcd20為cd20的截短片段，linker的長(zhǎng)度為2～15個(gè)氨基酸。膜型分子靶標(biāo)的氨基酸序列為：seqidno.21，基因序列為：seqidno.22。
當(dāng)重組水蛭素的基因序列在過繼免疫細(xì)胞表達(dá)時(shí)，生成兩個(gè)氨基酸序列：信號(hào)肽-水蛭素為一個(gè)，信號(hào)肽-靶標(biāo)分子-linker-跨膜段為一個(gè)。
本實(shí)施例的過繼免疫細(xì)胞采用cik細(xì)胞。具體的，本實(shí)施例的表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞制備方法包括步驟s1～s3，具體如下。
s1、體外培養(yǎng)人源cik細(xì)胞，包括步驟a的外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)采集和步驟b的cik細(xì)胞培養(yǎng)。
a、pbmc的采集具有以下步驟：
a1、自患者體內(nèi)抽取外周血50-100ml；
a2、淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化pbmc；
a3、無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90％以上的pbmc。
b、cik細(xì)胞的培養(yǎng)：
b1、將pbmc按1～2×106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)液中，加入1,000u/ml的重組人ifn-γ，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
b2、24h后加入50ng/ml的cd3單克隆抗體和300u/ml的重組人il-2，刺激cik細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；
注：此時(shí)也可同時(shí)加入100u/ml的重組人il-1α。
b3、每3天半量換液或擴(kuò)瓶一次，并補(bǔ)加重組人il-2300u/ml；
b4、在培養(yǎng)的第14d，收獲cik細(xì)胞。
其中，細(xì)胞培養(yǎng)基中還可添加5％～20％的自體血清。
s2、制備重組基因載體。
c、本實(shí)施列采用重組水蛭素異構(gòu)體hv1，重組水蛭素hv1的氨基酸序列為：seqidno.1，基因序列為：seqidno.2?；瘜W(xué)合成基因片段，n端添加nheⅰ限制性酶切位點(diǎn)，c端添加ecorⅰ限制性酶切位點(diǎn)。
d、本實(shí)施列采用靶標(biāo)分子結(jié)構(gòu)為：gm-csfr信號(hào)肽-δcd20-linker2-cd28跨膜段，其氨基酸序列為：seqidno.17，基因序列為seqidno.18。化學(xué)合成基因片段，n端添加bamhⅰ限制性酶切位點(diǎn)，c端添加notⅰ限制性酶切位點(diǎn)。
e、應(yīng)用基因工程技術(shù)制備編碼重組水蛭素和膜型分子靶標(biāo)的基因載體，將信號(hào)肽序列-重組水蛭素序列和信號(hào)肽序列-靶標(biāo)分子序列-linker序列-跨膜段序列兩段基因分別克隆入pires質(zhì)粒的兩個(gè)克隆位點(diǎn)。所用基因工程技術(shù)為公知技術(shù)，簡(jiǎn)述如下：
按照已有的方法建立標(biāo)準(zhǔn)的限制性內(nèi)切酶消化體系，然后利用nheⅰ和ecorⅰ處理pires質(zhì)粒，回收大片段；利用相同的限制性內(nèi)切酶nheⅰ和ecorⅰ處理并回收重組水蛭素異構(gòu)體hv1基因片段，然后與上述酶切好的載體pires大片段相連，構(gòu)建出重組水蛭素表達(dá)質(zhì)粒pires-hv1；轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α后，篩選出陽性克隆并擴(kuò)增。
純化pires-hv1質(zhì)粒，然后利用bamhⅰ和notⅰ處理pires-hv1質(zhì)粒，回收大片段；利用相同的限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和notⅰ處理并回收重組gm-csfr信號(hào)肽-δcd20-linker2-cd28跨膜段基因片段，然后與上述酶切好的pires-hv1載體大片段相連，構(gòu)建出同時(shí)表達(dá)重組水蛭素和膜型分子靶標(biāo)cd20的雙表達(dá)質(zhì)粒pires-hv1/cd20。轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α后，篩選出陽性克隆并擴(kuò)增，純化pires-hv1/cd20質(zhì)粒。
s3、純化經(jīng)步驟s2得到的pires-hv1/cd20重組質(zhì)粒，用該重組載體以質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染步驟s1得到的cik細(xì)胞，之后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)36h以上，得到表達(dá)重組水蛭素的cik細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)染率，根據(jù)臨床需要計(jì)算所需陽性細(xì)胞數(shù)量，回輸腫瘤患者。
該表達(dá)重組水蛭素的cik細(xì)胞，用于抗凝治療、抗栓治療、抗腫瘤治療，用于降血脂保健、抗凝保健、抗栓保健，用于手術(shù)時(shí)深度靜脈血栓的預(yù)防與治療，用于肝素誘導(dǎo)的血小板減少性疾病患者的抗凝治療，防治不穩(wěn)定性心絞痛、彌散性血管內(nèi)凝血、腦凝血、血栓靜脈炎及冠狀動(dòng)脈血栓，防治高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化。
以上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表
<110>何向鋒
<120>表達(dá)水蛭素的過繼免疫細(xì)胞及其制備方法和用途
<160>22
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