本發(fā)明涉及生物分析化學(xué)、納米生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一種基于時間分辨熒光免疫分析技術(shù)的斜帶石斑魚生長激素特異性定量檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：石斑魚是海洋珊瑚礁魚類，屬鮨科(serranidae)，石斑魚屬(epinephelus)，有30多種。斜帶石斑魚是我國南方及東南亞一帶重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類，肉質(zhì)鮮美，市場價值高。石斑魚的生長主要通過生長激素（growthhormon，gh）調(diào)節(jié)。魚類gh為不含糖基的蛋白質(zhì)，由垂體遠端的嗜酸性細胞合成分泌，為一級結(jié)構(gòu)中含有兩個二硫鍵的單鏈。同一目魚類中，gh氨基酸組成同源性約為80%。斜帶石斑魚生長激素的cdna全長為615bp，編碼204個氨基酸，成熟肽含有187個氨基酸。魚類gh參與營養(yǎng)物質(zhì)的能量代謝，在魚類生長、繁殖及滲透壓調(diào)節(jié)等方面起到重要作用。檢測斜帶石斑魚gh大多采用放射免疫分析、酶免疫分析、westernblot等方法，但放射免疫分析會造成放射性污染，且試劑盒保存時間短。酶聯(lián)免疫分析為定性或半定量方法。westernblot操作繁瑣，耗時長，通量小。時間分辨熒光免疫分析技術(shù)（trfia）是繼放射免疫后標(biāo)記物發(fā)展起來的一種技術(shù)，已成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床生化檢驗中一項重要的分析手段。trfia利用鑭系熒光配合物作為熒光標(biāo)記物標(biāo)記配體或受體，發(fā)生免疫反應(yīng)后，根據(jù)時間分辨熒光儀測到的最后產(chǎn)物中的熒光強度和相對熒光強度的比值，推測反應(yīng)體系中分析物的濃度，達到定量分析的目的。利用鑭系稀土離子熒光壽命長的特點，在每個激發(fā)光脈沖過后，通過時間延緩期，讓短壽命的熒光衰變掉后，再記錄稀土螯合物的熒光強度，幾乎可以完全消除背景熒光的干擾，提高靈敏度。trfia具有操作簡便、儲存時間長、無放射性污染、試劑盒穩(wěn)定性好、檢測不受樣品本底熒光干擾、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。非常適合定量要求高，重復(fù)性好、需批量處理的檢測樣品。目前trfia技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種臨床檢測項目中，但運用該技術(shù)檢測斜帶石斑魚gh尚無文獻報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種基于時間分辨熒光免疫分析技術(shù)的斜帶石斑魚生長激素特異性定量檢測試劑盒。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：一種斜帶石斑魚生長激素特異性單鏈單克隆抗體，所述抗體的核苷酸序列如seqidno：1所示，氨基酸序列如seqidno：2所示。斜帶石斑魚生長激素特異性單鏈單克隆抗體的制備方法為：將重組斜帶石斑魚gh蛋白免疫新西蘭大耳兔，提取兔血淋巴細胞rna，反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建噬菌體單鏈單克隆抗體庫，使用重組斜帶石斑魚gh蛋白篩選特異性單鏈抗體，并轉(zhuǎn)入pet32a+質(zhì)粒中進行表達純化。一種基于時間分辨熒光免疫分析技術(shù)的斜帶石斑魚生長激素特異性定量檢測試劑盒，所述試劑盒包括包被了斜帶石斑魚生長激素特異性單鏈單克隆抗體的微孔反應(yīng)板，重組斜帶石斑魚生長激素蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，銪標(biāo)記的斜帶石斑魚生長激素特異性單鏈單克隆抗體，所述斜帶石斑魚生長激素特異性單鏈單克隆抗體的核苷酸序列如seqidno：1所示，氨基酸序列如seqidno：2所示。所述銪標(biāo)記的斜帶石斑魚生長激素特異性單鏈單克隆抗體的制備方法為，將斜帶石斑魚生長激素特異性單鏈單克隆抗體進行eu3+標(biāo)記，抗體與eu3+標(biāo)記物的質(zhì)量比例為6:1。重組斜帶石斑魚生長激素蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為：用含50mmtris-hcl、0.9%nacl、0.02%bsa、0.05%nan3、0.05%tween-20，ph7.8的緩沖液，將重組斜帶石斑魚gh蛋白配制成0ng/ml、0.244ng/ml、0.977ng/ml、3.906ng/ml、15.625ng/ml、62.6ng/ml、250ng/ml系列濃度的校準(zhǔn)溶液，按每份500ul配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。本發(fā)明提供的基于時間分辨熒光免疫分析技術(shù)和異源性抗體的羅非魚生長激素定量檢測試劑盒還包括分析緩沖液、洗滌液、增強液。優(yōu)選地，所述分析緩沖液為50mmtris-hcl、0.9%nacl、0.02%bsa、0.05%nan3、0.05%tween-20，ph7.8的緩沖液。優(yōu)選地，所述洗滌液（25×）由1.25mtris-hcl、22.5%nacl、5%tween-20、0.625%nan3，ph7.8的分析緩沖液組成。優(yōu)選地，斜帶石斑魚生長激素特異性單鏈單克隆抗體包被96孔微孔板的方法為：用包被緩沖液稀釋斜帶石斑魚生長激素特異性單鏈單克隆抗體至適當(dāng)濃度，4℃過夜包被至96孔微孔板，用封閉緩沖液封閉過夜，棄去封閉液，拍干保存；其中包被緩沖液為：ph8.0的50mmtris-hcl緩沖液；封閉緩沖液為含有0.05%nan3、1%bsa，15%蔗糖的ph7.8的50mmtris-hcl緩沖液。本發(fā)明的測定方法為：往包被了斜帶石斑魚生長激素特異性單鏈單克隆抗體的96孔微孔反應(yīng)板中加入100μl系列濃度梯度稀釋的gh標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣品，25℃反應(yīng)1h，用洗滌液洗板6次，拍干，再加入100μl1:200倍稀釋的銪標(biāo)記的斜帶石斑魚生長激素特異性單鏈單克隆抗體，25℃震蕩孵育反應(yīng)1h，用洗滌液洗板6次，拍干，最后加入200ul每孔的增強液，室溫振搖5min后，在時間分辨熒光檢測儀上按照所編程序測定。本發(fā)明的試劑盒的特別適合的檢測對象為魚血清、組織細胞裂解液或細胞孵育液，定量檢測溶液中的斜帶石斑魚生長激素含量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明建立了夾心法測定樣品中的斜帶石斑魚生長激素水平，測試靈敏度可以達到0.131ng/ml，為石斑魚生長激素的研究提供了有效的檢測手段。附圖說明圖1是pcr擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖；從圖1可見pcr擴增了一段長約582bp的序列。圖2為質(zhì)粒構(gòu)建酶切分析圖，酶切后相應(yīng)大小處有條帶。圖3為重組斜帶石斑魚gh蛋白表達純化及westernblot驗證；重組gh純化，m：marker、1：菌體裂解、2：破碎上清、3：包涵體、4-6：200mm咪唑洗脫。純化得到約23.24kd的目的蛋白。his抗體驗證，在相應(yīng)大小處有條帶。圖4為多克隆抗體效價驗證；a圖為m：marker、重組gh蛋白上樣量從1-3分別為100ng、50ng、10ng。b圖為斜帶石斑魚垂體裂解蛋白10μl（1/10個斜帶石斑魚垂體，魚體重約為800g）。圖5是3f7號克隆的測序結(jié)果及預(yù)測氨基酸序列；下劃線部分為linker序列。圖6是斜帶石斑魚gh特異性單鏈單克隆抗體表達和純化；m：marker、n：未誘導(dǎo)對照、1：菌體裂解、2：破碎上清、3：包涵體、4：200mm咪唑洗脫。純化得到約52kd的目的蛋白。圖7是斜帶石斑魚gh標(biāo)準(zhǔn)曲線；a圖：系列濃度梯度稀釋的gh標(biāo)準(zhǔn)品和血清稀釋（1:2/4/8）的曲線基本平行，b圖：使用梯度稀釋的重組斜帶石斑魚somatolactin蛋白（gp-sl）及prolactin蛋白（gp-prl）、重組羅非魚tshβ蛋白（ti-tshβ）進行測定，結(jié)果表明重組斜帶石斑魚somatolactin蛋白、prolactin蛋白及重組羅非魚tshβ蛋白稀釋曲線不與標(biāo)準(zhǔn)曲線平行且測定值較低，說明無交叉反應(yīng)。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實施例1重組斜帶石斑魚生長激素蛋白的表達純化一、斜帶石斑魚重組gh蛋白表達菌株的構(gòu)建（1）斜帶石斑魚gh成熟肽序列的擴增根據(jù)已發(fā)表的斜帶石斑魚gh基因的序列（genbankno.ay155226.1）及限制性內(nèi)切酶bamhi和hindiii的識別序列，設(shè)計合成一對特異性引物（invitrogen公司），上游引物為5’cggggtacccagccaatcacagacggcca3’共29bp，是在gh基因的成熟肽序列前添加了bamhi酶切識別位點，下游引物為5’cccaagcttctacagggtacagttggcct3’共29bp，是在gh基因成熟肽序列后添加了hindiii酶切識別位點。取斜帶石斑魚垂體，提取總rna，反轉(zhuǎn)錄為cdna，再作為模版進行pcr反應(yīng)，使用kodplasneo高保真pcr酶（toyobo）進行pcr，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；接著為35個循環(huán)，95℃變性15秒，65℃退火15秒，68℃延伸30秒；最后68℃延伸5分鐘。pcr擴增產(chǎn)物的電泳鑒定圖見圖1。從圖1可見pcr擴增了一段長約582bp的序列。（2）含斜帶石斑魚gh基因的大腸桿菌表達載體pqe30-gh的構(gòu)建pcr產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶bamhi和hindiii（neb）雙酶切后，酶切產(chǎn)物用e.z.n.a.?gelextractionkit回收，進行瓊脂糖凝膠電泳，分離純化約582bp的斜帶石斑魚gh基因片段；載體質(zhì)粒pqe30經(jīng)限制性內(nèi)切酶bamhi和hindiii雙酶切后分離純化3.6kb的大片段，與582bp的斜帶石斑魚gh基因片段按1:3混合，用nebt4連接酶16℃連接16小時后用標(biāo)準(zhǔn)氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌transjm109中，用lb平板篩選具ampicillin抗性的轉(zhuǎn)化子，用e.z.n.a.?plasmidminikit提取質(zhì)粒，篩選大小約4.2kb的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶bamhi和hindiii（neb）雙酶切重組質(zhì)粒，得到582bp和3.6kb的兩個片段，大小分別與斜帶石斑魚gh基因和表達載體pqe30大小相同，測序結(jié)果與預(yù)期相同，證明斜帶石斑魚gh基因已克隆入大腸桿菌表達載體pqe30中，重組質(zhì)粒命名為pqe30-gh。質(zhì)粒構(gòu)建酶切驗證圖見圖2，測序由invitrogen公司完成。（3）斜帶石斑魚生長激素基因大腸桿菌表達菌株m15-pqe30-gh的構(gòu)建將pqe30-gh質(zhì)粒用標(biāo)準(zhǔn)氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌m15中，用lb平板篩選具ampicillin和kanamycin抗性的轉(zhuǎn)化子，得到m15-pqe30-gh菌株。二、斜帶石斑魚重組gh蛋白的制備（1）挑取m15-pqe30-gh單菌落接種在10ml帶有ampicillin和kanamycin的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm/min培養(yǎng)16h。（2）將菌液按照1:100的比例接種到1l帶有ampicillin和kanamycin抗性的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm/min培養(yǎng)至od為0.5-0.6，加入iptg至終濃度為1mm，取10ml菌液作為未誘導(dǎo)的對照。誘導(dǎo)4h后，6000×g離心15min，收集菌體。（3）按培養(yǎng)基比bindingbuffer（不含尿素）為100:1的比例向菌體中加入bindingbuffer，重懸菌體，置于冰上，用超聲波細胞粉碎儀進行超聲破碎30min。用beckman冷凍超速離心機12000×g離心15min，上清為細胞內(nèi)可溶蛋白，沉淀為包涵體。（4）棄去上清，包涵體用含有8m尿素的bindingbuffer溶解。（5）各取1ml未誘導(dǎo)及誘導(dǎo)后的菌體，12000×g離心5min，棄去上清，加入50ulpbs作為樣品，上清和包涵體溶解液分別取20ul，加入20ul2×sds蛋白上樣緩沖液，沸水浴5min，進行sds-page，考馬斯亮藍染色10min，脫色液脫色至背景清晰。m15-pqe30-gh在23.24kd處有條帶，而未誘導(dǎo)對照不出現(xiàn)此帶。包涵體蛋白用ge公司的鎳柱進行純化，用3kd超濾管（pall）脫鹽。使用碧云天的bca蛋白濃度測定試劑盒，按說明書方法操作，進行蛋白濃度的測定。將重組斜帶石斑魚生長激素蛋白采用免疫印跡（westernblot）方法進行免疫活性鑒定。一抗為his單克隆抗體（novagen公司）和抗gh兔多克隆抗體（實驗室制備），二抗為羊抗兔igg-hrp（博士德生物工程有限公司）。顯示抗his單克隆抗體和抗gh兔多克隆抗體均能識別我們用大腸桿菌表達的重組gh蛋白，證明得到的蛋白是重組斜帶石斑魚gh，蛋白表達純化及westernblot驗證見圖3。實施例2斜帶石斑魚gh特異性單鏈單克隆抗體的制備一、重組斜帶石斑魚生長激素兔多克隆抗體的制備及純化（1）從廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心購買新西蘭大耳兔3只（雄性，3-4月齡，體重2.5-3kg），將家兔編號為a/b/c，a/b注射斜帶石斑魚重組gh蛋白，c為對照注射等量的pbs與佐劑的混合物。每次注射取一定量純化的斜帶石斑魚重組gh蛋白用pbs稀釋，與等體積弗氏佐劑（sigam）混勻乳化，在家兔背部皮下多點注射，共免疫四次，除第一次用弗氏完全佐劑外，再次免疫均用弗氏不完全佐劑。（2）免疫方案：首次注射前，分別取2ml血液作為空白對照。四次免疫分別在第1天、第11天、第18天、第25天。其中第1天和第25天蛋白用量為500ug，第11天和第18天蛋白用量為200ug。（3）每次注射前取2ml血清采用免疫印跡（westernblot）方法進行抗體效價驗證，效價達到1:10000以上時，第34天禁食一天，在第35天通過頸動脈放血，離心取得血清，即兔抗gh多克隆抗體。用免疫印跡（westernblot）方法進行抗體效價驗證，一抗為制備的兔抗gh多克隆抗體，二抗為羊抗兔igg-hrp（博士德生物工程有限公司），抗體效價驗證結(jié)果如圖4，制備的gh多克隆抗體可做為之后篩選單鏈單克隆抗體的陽性對照。二、斜帶石斑魚gh單鏈單克隆初級抗體庫的構(gòu)建（1）采用ficoll密度梯度離心法分離兔外周血淋巴細胞，取得實施例2（一）中家兔抗凝血后，加入與血液等體積的d-hank’s溶液，混勻，小心將10ml血液稀釋液加到預(yù)先加入5ml淋巴細胞分離液（天津灝洋）的15ml離心管液面上，使用水平轉(zhuǎn)子500×g離心40min。離心后吸取單核細胞層的細胞，使用d-hank’s洗滌2次，提取rna，使用olligodt引物（life公司）進行反轉(zhuǎn)錄備用。（2）根據(jù)ncbi上兔igg序列，比對保守區(qū)，設(shè)計兔igg重鏈和輕鏈可變區(qū)基因片段（vh、vl）克隆引物，重鏈可變區(qū)上游引物：vhf1tccgggggtcgcct、vhf2tccgggggagrc、vhf3tccgggggt、vhf4gagtccggggg；重鏈可變區(qū)下游引物：vhr1tgargagayggtgacsaggg、vhr2gactgatggagccttaggtt；輕鏈可變區(qū)上游引物：vlf1gwkatgacccagactcca；輕鏈可變區(qū)下游引物：vlr1aggtgcaactggatcacc，引物由invitrogen公司合成。（3）克隆vh和vl基因片段，通過linker進行連接，組成單鏈抗體（scfv片段），linker編碼的一段富含gly的連接肽的序列為：sgggsgggggggsggggs，可將vh和vl肽段連接并且不會對兩個肽段的空間結(jié)構(gòu)有太大影響。（4）將scfv片段連接到pcantab5e載體上，電轉(zhuǎn)化到tg1宿主菌中，即為斜帶石斑魚gh單鏈單克隆初級抗體庫，噬菌體抗體庫構(gòu)建試劑盒購自北京寶科維食安公司。三、斜帶石斑魚gh單鏈單克隆抗體的篩選和表達純化（1）將純化后的重組斜帶石斑魚gh蛋白包被在5ml免疫管（nunc）中，對斜帶石斑魚gh單鏈單克隆初級抗體庫進行3輪篩選，得到斜帶石斑魚gh單鏈單克隆三級抗體庫。（2）將3級抗體庫的單克隆進行菌液pcr，陽性的菌落用phageelisa及scfvelisa篩選使用二抗分別為hrp-antim13antibody（ge公司）和hrp-antietagantibody（abcam公司），得到陽性最高的一個菌，將其編號為3f7，3f7號克隆的測序結(jié)果如圖5。（3）將3f7片段克隆到pet32a+載體上，命名為pet32-ghab-3f7，將其轉(zhuǎn)到bl21trxb菌株中進行表達，純化得到52kd的斜帶石斑魚gh特異性單鏈單克隆抗體，如圖6。將抗體透析并超濾濃縮備用。實施例3斜帶石斑魚gh時間分辨熒光免疫檢測試劑盒的制備（1）斜帶石斑魚gh特異性單鏈單克隆抗體包被96孔微孔反應(yīng)板:用包被緩沖液稀釋斜帶石斑魚gh特異性單鏈單克隆抗體至適當(dāng)濃度，4℃過夜包被至96孔微孔板，用封閉緩沖液封閉過夜，棄去封閉液，拍干保存。其中包被緩沖液為：ph8.0的50mmtris-hcl緩沖液；封閉緩沖液為含有0.05%nan3、1%bsa，15%蔗糖的ph7.8的50mmtris-hcl緩沖液。（2）純化后的斜帶石斑魚gh特異性單鏈單克隆抗體進行eu3+標(biāo)記，抗體與eu3+標(biāo)記物的比例為6:1（質(zhì)量比）為最佳比例。銪標(biāo)記斜帶石斑魚gh特異性單鏈單克隆抗體的制備步驟為：斜帶石斑魚gh特異性單鏈單克隆抗體的純化和濃縮：將1.2mg重組斜帶石斑魚gh蛋白加入0.5ml標(biāo)記緩沖液（50mmna2co3，ph9.0），混勻后，用millipore公司的離心柱進行濃縮，8500rpm離心5min，重復(fù)6次，棄去濾出液，將濾膜反轉(zhuǎn)離心收集重組蛋白，體積控制在200ul左右。斜帶石斑魚gh特異性單鏈單克隆抗體的標(biāo)記：將純化的重組蛋白加入0.2mgeu3+標(biāo)記試劑中（廣州達瑞公司），充分混勻，25℃震蕩20h。標(biāo)記蛋白的純化：用sephadexg-50層析柱（1×45cm，ge公司）分離純化，洗脫緩沖液（50mmtris-hcl，0.9%nacl，0.05%nan3，ph7.8）洗脫，收集流出液1ml/管，用bca法（碧云天公司）逐管測定蛋白濃度，用增強液稀釋1000-10000倍測定熒光強度。合并蛋白濃度最高的幾管，混勻并計算標(biāo)記率。確定稀釋度：合并后的銪標(biāo)記物，進行稀釋度摸索，選擇線性較好，靈敏度較高的稀釋度。分裝保存：向標(biāo)記物中加入高純度的bsa至終濃度為0.1%，將標(biāo)記物分為100ul/管，-20℃保存。（3）標(biāo)準(zhǔn)品制備步驟為：用含50mmtris-hcl、0.9%nacl、0.02%bsa、0.05%nan3、0.05%tween-20，ph7.8的緩沖液，將重組斜帶石斑魚gh蛋白配制成0ng/ml、0.244ng/ml、0.977ng/ml、3.906ng/ml、15.625ng/ml、62.6ng/ml、250ng/ml系列濃度的校準(zhǔn)溶液，按每份500ul配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。（4）試劑盒包含的溶液：分析緩沖液：50mmtris-hcl、0.9%nacl、0.02%bsa、0.05%nan3、0.05%tween-20，ph7.8的緩沖液。洗滌液母液（25×）：由1.25mtris-hcl、22.5%nacl、5%tween-20、0.625%nan3，ph7.8的分析緩沖液組成。增強液購于（廣州達瑞公司）。實施例4本發(fā)明的試劑盒的使用方法（1）樣品收集：取斜帶石斑魚血清或其他含gh待檢樣品100ul，2-8℃保存一周，長時間保存在-80℃。（2）試劑的準(zhǔn)備：洗滌液：將80ml洗滌液母液（25×）和1920ml去離子水混合，作為工作洗滌液。標(biāo)記物工作液：取標(biāo)記物，按1:200稀釋，作為銪標(biāo)重組蛋白標(biāo)記物工作液。gh蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：按上述標(biāo)準(zhǔn)品制備步驟制備濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品。（3）操作步驟：往包被了斜帶石斑魚gh特異性單鏈單克隆抗體的96孔微孔反應(yīng)板中加入100ul系列濃度梯度稀釋的gh標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣品，25℃反應(yīng)1h，用洗滌液洗板6次，拍干，再加入100μl1:200倍稀釋的銪標(biāo)記的斜帶石斑魚生長激素特異性單鏈單克隆抗體，25℃震蕩孵育反應(yīng)1h，用洗滌液洗板6次，拍干，最后加入200ul每孔的增強液，25℃振搖5min后，在時間分辨熒光檢測儀（如perkinelmervictorx5多功能酶標(biāo)儀）上按照所編程序測定。實施例5本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)檢定按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造和檢定規(guī)程對通過實施例4中制備成的試劑盒進行檢定，結(jié)果如下：（1）準(zhǔn)確度：對系列濃度梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品與血清稀釋樣品（1:2/4/8）同時進行分析測定后，用雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型擬合，兩條曲線基本平行（圖7-a）。gh標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r=0.977。（2）分析靈敏度和線性范圍：將零參考標(biāo)準(zhǔn)品測量9次，計算其熒光值及標(biāo)準(zhǔn)差。以該點熒光測定平均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差所得的熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得出的濃度值為其靈敏度，經(jīng)測定本試劑盒靈敏度為0.131ng/ml。將抗原稀釋成不同濃度進行測定，測得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.131-250ng/ml。（3）精密度（cv%）：用本發(fā)明試劑盒對自制gh質(zhì)控品（預(yù)期濃度為35ng/ml）進行測定，各3個重復(fù)。結(jié)果本發(fā)明試劑盒的組內(nèi)變異系數(shù)cv%≤12.8，組間變異系數(shù)cv%≤10.4。表1組內(nèi)精密度測試結(jié)果（n=3）測定值gh（ng/ml）cv%gh（ng/ml）cv%gh（ng/ml）cv%質(zhì)控品34.95812.836.8757.830.0023.1表2組間精密度測試結(jié)果（三批，n=3*3）測定值gh（ng/ml）cv%質(zhì)控品33.94510.4（4）特異性：使用斜帶石斑魚重組somatolactin及prolactin蛋白以及重組羅非魚tshβ蛋白作為樣品用本試劑盒進行測定，結(jié)果表明稀釋曲線不與標(biāo)準(zhǔn)曲線平行且測定值低（圖7-b），說明無交叉反應(yīng)，如表3。表3gh試劑盒特異性檢測結(jié)果檢測項目somatolactinprolactintshβ樣品濃度（ng/ml）100010001000測定濃度（ng/ml）0.424.720.36以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所做的進一步詳細說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。sequencelisting<110>中山大學(xué)，中山大學(xué)深圳研究院<120>一種基于時間分辨熒光免疫分析技術(shù)的斜帶石斑魚生長激素特異性定量檢測試劑盒<130><160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>795<212>dna<213>ghab-3f7核苷酸序列<400>1atgtccgggggtcgcctggtaacgcctggaggatccctgacactcacctgcacagtctct60ggaatcgacctcaatacctactatatgagctgggtccgccaggctccaggaaaggggctg120gaatacatcggattcattgatactggtggtgccacatactacgcgacctgggcgaaaggc180cgattcaccatctccaaaacctcgaccacggtgaatctgaagatcaccagtccgacaacc240gaggacacggccacctatttctgtgccagagggggtactggtagtaatttgtggggccca300ggcaccctggtcaccgtctcctcagggcaacctaaggctccatcagtcggccaaggccac360ggtcaccgtctcctcagtggaggcggttcaggcggaggtggcggaggtggctctggcggt420ggcggatcggacattgagctcacccagtctccagatatgacccagactccagcctccgtg480gaggcagctgtgggaggcacagtcaccatcaagtgccaggccagtcagagcattggtagt540aatttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctattctaca600tccactctggcatctggggtctcatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacacttc660actctcaccatcggcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtcaaggcggt720tattataatagtggttggtacttggctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaaggt780gatccagttgcacct795<210>2<211>265<212>prt<213>ghab-3f7氨基酸序列<400>2metserglyglyargleuvalthrproglyglyserleuthrleuthr151015cysthrvalserglyileaspleuasnthrtyrtyrmetsertrpval202530argglnalaproglylysglyleuglutyrileglypheileaspthr354045glyglyalathrtyrtyralathrtrpalalysglyargphethrile505560serlysthrserthrthrvalasnleulysilethrserprothrthr65707580gluaspthralathrtyrphecysalaargglyglythrglyserasn859095leutrpglyproglythrleuvalthrvalserserglyglnprolys100105110alaproservalglyglnglyhisglyhisargleuleuserglygly115120125glyserglyglyglyglyglyglyglyserglyglyglyglyserasp130135140ilegluleuthrglnserproaspmetthrglnthrproalaserval145150155160glualaalavalglyglythrvalthrilelyscysglnalasergln165170175serileglyserasnleualatrptyrglnglnlysproglyglnpro180185190prolysleuleuiletyrserthrserthrleualaserglyvalser195200205serargphelysglyserglyserglythrhisphethrleuthrile210215220glyglyvalglncysaspaspalaalathrtyrtyrcysglnglygly225230235240tyrtyrasnserglytrptyrleualapheglyglyglythrgluval245250255valvallysglyaspprovalalapro260265<210>3<211>29<212>dna<213>gh上游引物<400>3cggggtacccagccaatcacagacggcca29<210>4<211>29<212>dna<213>gh下游引物<400>4cccaagcttctacagggtacagttggcct29<210>5<211>14<212>dna<213>vhf1<400>5tccgggggtcgcct14<210>6<211>12<212>dna<213>vhf2<400>6tccgggggagrc12<210>7<211>9<212>dna<213>vhf3<400>7tccgggggt9<210>8<211>11<212>dna<213>vhf4<400>8gagtccggggg11<210>9<211>20<212>dna<213>vhr1<400>9tgargagayggtgacsaggg20<210>10<211>20<212>dna<213>vhr2<400>10gactgatggagccttaggtt20<210>11<211>18<212>dna<213>vlf1<400>11gwkatgacccagactcca18<210>12<211>18<212>dna<213>vlr1<400>12aggtgcaactggatcacc18<210>13<211>18<212>prt<213>連接肽<400>13serglyglyglyserglyglyglyglyglyglyglyserglyglygly151015glyser當(dāng)前第1頁12