本發(fā)明涉及蛋清提取技術領域，具體涉及一種從雞蛋中提取卵轉鐵蛋白來制備凍干粉的方法。
背景技術：
卵轉鐵蛋白是單一肽鏈的蛋白質，是人體內一種重要的鐵元素載體，許多疾病都與人血清中轉鐵蛋白的含量變化有關，如缺鐵性貧血、急性肝炎及蛋白質缺乏等。卵轉鐵蛋白是一種能轉運fe3+的鐵結合蛋白，是一種非血紅素結合鐵的β-球蛋白，一個分子能可逆地結合兩個fe3+，同時結合兩個co32-或hco3-，陰離子的結合與fe3+的結合是協(xié)同的。有研究表明，酪氨酸殘基在轉鐵蛋白與鐵的結合過程起著關鍵的作用，轉鐵蛋白分子在結合鐵離子前后結構是不完全相同：未結合鐵離子時，轉鐵蛋白的分子呈較開放、疏散結構；結合了鐵離子后，轉鐵蛋白的配體同鐵離子之間相互作用使得整個分子結構變得更加緊密。
卵轉鐵蛋白(ovotransferrin,ovt)以前稱作卵伴白蛋白，是一種糖蛋白，卵轉鐵蛋白約占雞蛋總蛋白質含量的12%，具有抗菌、抗病毒、免疫調節(jié)、抗癌和抗氧化等作用。其能夠能促進人體對鐵及營養(yǎng)物質的吸收，有防止貧血的作用。對大腸桿菌等的抑制作用與血清中的轉鐵蛋白相同，同時對假單胞桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、李氏桿菌及衣原體等也有抑制作用，其抗病毒的性能優(yōu)于乳鐵蛋白和血清轉鐵蛋白，另外，對嬰兒急性腸炎有很好的療效。因此，從來源豐富的雞蛋中提取卵轉鐵蛋白，將其開發(fā)為天然的防腐劑和抗菌劑應用于各類食品，或作為功能性成分添加到各類食品，或制成天然抗菌藥物或高效補鐵劑，以及用于化妝品中增強抗衰老功效，其應用和開發(fā)前景十分廣闊。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對現(xiàn)有的技術問題，提供一種從雞蛋中提取卵轉鐵蛋白來制備凍干粉的方法，以便提高雞蛋中提取卵轉鐵蛋白的能力，以應用于各類食品。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：一種從雞蛋中提取卵轉鐵蛋白來制備凍干粉的方法，其特征在于，其包括以下步驟：
（1）制備蛋清稀釋液：將新鮮雞蛋洗凈，置于2-3℃下冷藏3-6h，然后將冷藏的雞蛋進行分離蛋黃與蛋清，取蛋清液，在蛋清液中加入等于蛋清體積的水進行稀釋，得到蛋清稀釋液，并置于3℃的冰箱中冷藏至少一小時；
（2）分離卵粘蛋白：在蛋清稀釋液中加入3mol/l的hcl調節(jié)ph至5.8，并用300-450r/min的攪拌機進行攪拌5h，使得卵粘蛋白沉淀，之后利用離心機離心，去除沉淀，得到上清液；
（3）調節(jié)ph：將步驟（2）得到的上清液中加入2mol/l的naoh溶液，調節(jié)ph至7.5，并用600-800r/min的攪拌機攪拌0.5-1h，然后，置于3℃的冰箱中冷置2h，之后用離心機離心，去除沉淀，得到上清液；
（4）硫酸銨沉淀：在所述步驟（3）的上清液中加入40%飽和度的硫酸銨，在4℃下靜置2h，然后利用5000r/min的離心機離心30min；然后，取上清液再加入85%飽和度的硫酸銨，在4℃下靜置1h，然后利用5500r/min的離心機離心20min；沉淀用蒸餾水溶解、透析脫鹽；透析的蛋清液用3mol/l的naoh溶液調節(jié)ph至8.2，然后在離心20min，取上清液；
（5）利用q-sepharosefastflow離子交換柱，用ph為8.2的hcl緩沖液平衡離子交換柱，然后，將步驟（4）得到的上清液以2.5ml/min的流速加入離子交換柱中，然后分別用含0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.05mol/l、0.1mol/l的nacl溶液以1ml/min的流速進行分步洗脫，并收集含有卵轉鐵蛋白的洗脫液；
（6）將卵轉鐵蛋白的洗脫液進行濃縮、真空冷凍干燥，研磨處理，即制得卵轉鐵蛋白凍干粉。
進一步，作為優(yōu)選，在所述的步驟（4）與步驟（5）之間還設置有微濾步驟，所述的微濾步驟為采用濾膜去除所述的步驟（4）得到的上清液中的30-80微米范圍的雜質，微濾時的操作壓力為0.1mpa。
進一步，作為優(yōu)選，所述的微濾步驟之后還設置有超濾步驟，超濾步驟采用0.01-0.02微米的超濾膜進行超濾處理，超濾時的操作壓力為0.2mpa。
進一步，作為優(yōu)選，所述的步驟（2）中利用離心機離心的轉速為6500r/min，離心時間為40min，所述的步驟（3）中利用離心機離心的轉速為8000r/min，離心時間為20min。
進一步，作為優(yōu)選，在超濾時，邊攪拌邊超濾，攪拌的速率為80r/min。
進一步，作為優(yōu)選，在所述的步驟（6）中，真空冷凍干燥的冷凍溫度為-40℃，冷凍時間為36h。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明采用硫酸銨鹽析和離子交換層析的方法對雞蛋清中的卵轉鐵蛋白進行分離，以期建立從蛋清中提取卵轉鐵蛋白的工藝，為其開發(fā)利用奠定基礎，其制備的凍干粉便于儲藏、運輸，也便于應用于天然的防腐劑和抗菌劑應用于各類食品，本發(fā)明的冷凍干粉也可以作為功能性成分添加到各類食品，或制成天然抗菌藥物或高效補鐵劑，以及用于化妝品中增強抗衰老功效，其應用前景十分廣闊。此外，其還可以用于制備對治療大腸桿菌、假單胞桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、李氏桿菌及衣原體等的治療藥物。
具體實施方式
下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
實施例一
一種從雞蛋中提取卵轉鐵蛋白來制備凍干粉的方法，其包括以下步驟：
（1）制備蛋清稀釋液：將新鮮雞蛋洗凈，置于2℃下冷藏4h，然后將冷藏的雞蛋進行分離蛋黃與蛋清，取蛋清液，在蛋清液中加入等于蛋清體積的水進行稀釋，得到蛋清稀釋液，并置于3℃的冰箱中冷藏3小時；
（2）分離卵粘蛋白：在蛋清稀釋液中加入3mol/l的hcl調節(jié)ph至5.8，并用300r/min的攪拌機進行攪拌5h，使得卵粘蛋白沉淀，之后利用離心機離心，離心機離心的轉速為6500r/min，離心時間為40min，去除沉淀，得到上清液；
（3）調節(jié)ph：將步驟（2）得到的上清液中加入2mol/l的naoh溶液，調節(jié)ph至7.5，并用600r/min的攪拌機攪拌0.6h，然后，置于3℃的冰箱中冷置2h，之后用離心機離心，離心機離心的轉速為8000r/min，離心時間為20min，去除沉淀，得到上清液；
（4）硫酸銨沉淀：在所述步驟（3）的上清液中加入40%飽和度的硫酸銨，在4℃下靜置2h，然后利用5000r/min的離心機離心30min；然后，取上清液再加入85%飽和度的硫酸銨，在4℃下靜置1h，然后利用5500r/min的離心機離心20min；沉淀用蒸餾水溶解、透析脫鹽；透析的蛋清液用3mol/l的naoh溶液調節(jié)ph至8.2，然后在離心20min，取上清液；
（5）利用q-sepharosefastflow離子交換柱，用ph為8.2的hcl緩沖液平衡離子交換柱，然后，將步驟（4）得到的上清液以2.5ml/min的流速加入離子交換柱中，然后分別用含0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.05mol/l、0.1mol/l的nacl溶液以1ml/min的流速進行分步洗脫，并收集含有卵轉鐵蛋白的洗脫液；
（6）將卵轉鐵蛋白的洗脫液進行濃縮、真空冷凍干燥，真空冷凍干燥的冷凍溫度為-40℃，冷凍時間為36h，之后研磨處理，即制得卵轉鐵蛋白凍干粉。
實施例二
一種從雞蛋中提取卵轉鐵蛋白來制備凍干粉的方法，其包括以下步驟：
（1）制備蛋清稀釋液：將新鮮雞蛋洗凈，置于3℃下冷藏6h，然后將冷藏的雞蛋進行分離蛋黃與蛋清，取蛋清液，在蛋清液中加入等于蛋清體積的水進行稀釋，得到蛋清稀釋液，并置于3℃的冰箱中冷藏2小時；
（2）分離卵粘蛋白：在蛋清稀釋液中加入3mol/l的hcl調節(jié)ph至5.8，并用350r/min的攪拌機進行攪拌5h，使得卵粘蛋白沉淀，之后利用離心機離心，離心機離心的轉速為6500r/min，離心時間為40min，去除沉淀，得到上清液；
（3）調節(jié)ph：將步驟（2）得到的上清液中加入2mol/l的naoh溶液，調節(jié)ph至7.5，并用800r/min的攪拌機攪拌1h，然后，置于3℃的冰箱中冷置2h，之后用離心機離心，離心機離心的轉速為8000r/min，離心時間為20min，去除沉淀，得到上清液；
（4）硫酸銨沉淀：在所述步驟（3）的上清液中加入40%飽和度的硫酸銨，在4℃下靜置2h，然后利用5000r/min的離心機離心30min；然后，取上清液再加入85%飽和度的硫酸銨，在4℃下靜置1h，然后利用5500r/min的離心機離心20min；沉淀用蒸餾水溶解、透析脫鹽；透析的蛋清液用3mol/l的naoh溶液調節(jié)ph至8.2，然后在離心20min，取上清液；
（5）微濾步驟，采用濾膜去除所述的步驟（4）得到的上清液中的30-80微米范圍的雜質，微濾時的操作壓力為0.1mpa，得到微濾液；
（6）利用q-sepharosefastflow離子交換柱，用ph為8.2的hcl緩沖液平衡離子交換柱，然后，將步驟（5）得到的微濾液以2.5ml/min的流速加入離子交換柱中，然后分別用含0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.05mol/l、0.1mol/l的nacl溶液以1ml/min的流速進行分步洗脫，并收集含有卵轉鐵蛋白的洗脫液；
（7）將卵轉鐵蛋白的洗脫液進行濃縮、真空冷凍干燥，真空冷凍干燥的冷凍溫度為-40℃，冷凍時間為36h，之后研磨處理，即制得卵轉鐵蛋白凍干粉。
實施例三
一種從雞蛋中提取卵轉鐵蛋白來制備凍干粉的方法，其包括以下步驟：
（1）制備蛋清稀釋液：將新鮮雞蛋洗凈，置于3℃下冷藏5h，然后將冷藏的雞蛋進行分離蛋黃與蛋清，取蛋清液，在蛋清液中加入等于蛋清體積的水進行稀釋，得到蛋清稀釋液，并置于3℃的冰箱中冷藏1小時；
（2）分離卵粘蛋白：在蛋清稀釋液中加入3mol/l的hcl調節(jié)ph至5.8，并用450r/min的攪拌機進行攪拌5h，使得卵粘蛋白沉淀，之后利用離心機離心，離心機離心的轉速為6500r/min，離心時間為40min，去除沉淀，得到上清液；
（3）調節(jié)ph：將步驟（2）得到的上清液中加入2mol/l的naoh溶液，調節(jié)ph至7.5，并用800r/min的攪拌機攪拌1h，然后，置于3℃的冰箱中冷置2h，之后用離心機離心，離心機離心的轉速為8000r/min，離心時間為20min，去除沉淀，得到上清液；
（4）硫酸銨沉淀：在所述步驟（3）的上清液中加入40%飽和度的硫酸銨，在4℃下靜置2h，然后利用5000r/min的離心機離心30min；然后，取上清液再加入85%飽和度的硫酸銨，在4℃下靜置1h，然后利用5500r/min的離心機離心20min；沉淀用蒸餾水溶解、透析脫鹽；透析的蛋清液用3mol/l的naoh溶液調節(jié)ph至8.2，然后在離心20min，取上清液；
（5）微濾步驟，采用濾膜去除所述的步驟（4）得到的上清液中的30-80微米范圍的雜質，微濾時的操作壓力為0.1mpa，得到微濾液；
（6）超濾步驟，超濾步驟采用0.01-0.02微米的超濾膜對步驟（5）得到的微濾液進行超濾處理，超濾時的操作壓力為0.2mpa，且要求在超濾時，邊攪拌邊超濾，攪拌的速率為80r/min，得到超濾液；
（7）利用q-sepharosefastflow離子交換柱，用ph為8.2的hcl緩沖液平衡離子交換柱，然后，將步驟（6）得到的超濾液以2.5ml/min的流速加入離子交換柱中，然后分別用含0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.05mol/l、0.1mol/l的nacl溶液以1ml/min的流速進行分步洗脫，并收集含有卵轉鐵蛋白的洗脫液；
（8）將卵轉鐵蛋白的洗脫液進行濃縮、真空冷凍干燥，真空冷凍干燥的冷凍溫度為-40℃，冷凍時間為36h，之后研磨處理，即制得卵轉鐵蛋白凍干粉。
本發(fā)明采用硫酸銨鹽析和離子交換層析的方法對雞蛋清中的卵轉鐵蛋白進行分離，以期建立從蛋清中提取卵轉鐵蛋白的工藝，為其開發(fā)利用奠定基礎，其制備的凍干粉便于儲藏、運輸，也便于應用于天然的防腐劑和抗菌劑應用于各類食品，本發(fā)明的冷凍干粉也可以作為功能性成分添加到各類食品，或制成天然抗菌藥物或高效補鐵劑，以及用于化妝品中增強抗衰老功效，其應用前景十分廣闊。此外，其還可以用于制備對治療大腸桿菌、假單胞桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、李氏桿菌及衣原體等的治療藥物。
盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。