本發(fā)明涉及一種含羥基修飾的n,n-二甲氨基的陽(yáng)離子聚合物及其制備方法和應(yīng)用，屬于功能性聚合物技術(shù)。

技術(shù)背景

sirna是一種能夠特異性下調(diào)基因表達(dá)的短鏈核酸。理論上，通過(guò)合理設(shè)計(jì)，sirna可以沉默體內(nèi)任何基因，人們可以利用這項(xiàng)生物技術(shù)從根本上解決很多困擾人類的疑難疾病，如乙肝、癌癥、皮膚病等。盡管，sirna具有極其廣闊的臨床治療潛力，但是sirna離臨床應(yīng)用還有很大一段距離。作為外源性分子，sirna在遞送問(wèn)題上存在很多的難以克服的障礙。首先，sirna是帶有負(fù)電荷的外源性生物大分子，它很難直接被細(xì)胞攝取，而且體內(nèi)給藥后sirna會(huì)很快被體內(nèi)的免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除。因此，sirna需要借助輔助載體將其遞送到特定組織的細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)其沉默目標(biāo)基因的治療目的。針對(duì)sirna直接給藥方式的諸多不足，sirna遞送載體的研究已成為熱點(diǎn)。

陽(yáng)離子聚合物是一類重要的sirna遞送載體，它能和sirna在水溶液中通過(guò)靜電作用相互結(jié)合形成穩(wěn)定納米粒子，同時(shí)具有制備簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)。2008年，世界上第一個(gè)基于陽(yáng)離子聚合物的sirna藥物(calaa-01)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。盡管，陽(yáng)離子聚合物能夠有效的遞送sirna，但是其正電性會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用。目前，人們的普遍做法是在聚陽(yáng)離子上鍵接peg或者采用層層包裹的方式來(lái)提高陽(yáng)離子聚合物的生物相容性。但盡管如此，陽(yáng)離子聚合物為載體的生物相容性仍難以滿足臨床應(yīng)用的要求，需要開發(fā)降低陽(yáng)離子聚合物毒性的有效方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了有效的降低陽(yáng)離子聚合物的毒性，促進(jìn)臨床推廣應(yīng)用，我們結(jié)合醇類物質(zhì)在生物機(jī)體中的高相容性特點(diǎn)，制備出一種含羥基修飾的n,n-二甲氨基的陽(yáng)離子聚合物，以期實(shí)現(xiàn)dna、sirna等生物分子的高效遞送并有效提高陽(yáng)離子聚合物的生物相容性。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的：

一種含羥基修飾的n,n-二甲氨基的陽(yáng)離子聚合物，其羥基修飾的n,n-二甲氨基是n，n，n-二甲基乙基-2-羥基-丙基硫醚(以下簡(jiǎn)稱hdma)，陽(yáng)離子聚合物為均聚物或共聚物；所述的陽(yáng)離子聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量為5000-40000。

所述的陽(yáng)離子聚合物，其陽(yáng)離子聚合物為均聚物，即其中鍵接hdma的結(jié)構(gòu)單元的總質(zhì)量占陽(yáng)離子聚合物質(zhì)量的100％。

所述的陽(yáng)離子聚合物，其陽(yáng)離子聚合物為共聚物，其中鍵接hdma的結(jié)構(gòu)單元的總質(zhì)量占陽(yáng)離子聚合物質(zhì)量的10％～90％。

所述的陽(yáng)離子聚合物，其所述的共聚物，為含有疏水性結(jié)構(gòu)單元的兩親性共聚物，疏水性結(jié)構(gòu)單元的總質(zhì)量占陽(yáng)離子聚合物質(zhì)量的10％～60％。

所述的陽(yáng)離子聚合物，其所述的共聚物，為帶有hdma的結(jié)構(gòu)單元的均聚物(phdma)與非離子親水性聚合物(b)和疏水段(r)組成的兩親性三嵌段共聚物；其中，phdma嵌段的相對(duì)分子質(zhì)量為2000～10000，非離子親水性聚合物b的相對(duì)分子質(zhì)量為2000-10000，疏水段r的相對(duì)分子質(zhì)量為2000～20000；phdma嵌段在三嵌段共聚物中的質(zhì)量百分含量為10％～70％。

所述的陽(yáng)離子聚合物，其所述的兩親性三嵌段共聚物的非離子親水性聚合物b段選自聚乙二醇(peg)、聚羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯或磷酸膽堿。

所述的陽(yáng)離子聚合物，其所述的共聚物是peg-r-phdma型嵌段共聚物，結(jié)構(gòu)式如下：

其中，phdma是聚甲基丙烯酸(n，n，n-二甲基乙基-2-羥基-丙基硫醚)酯，na是其結(jié)構(gòu)單元數(shù)，是8-41的整數(shù)；n是聚乙二醇的結(jié)構(gòu)單元數(shù)，是45-227的整數(shù)；疏水段r是酯類單體或烯類單體的均聚物或共聚物，酯類單體選自己內(nèi)酯、已交酯、丙交酯、4-(乙二醇縮酮)-己內(nèi)酯，烯類單體選自甲基丙烯酸-2-(3，5-二惡烷-4-(2，4，6-三甲氧基苯))丙酯、甲基丙烯酸(二異丙基氨基)乙酯。

本發(fā)明的含羥基修飾的n,n-二甲氨基的陽(yáng)離子聚合物的制備方法，以烯類聚合物為疏水段：將單羥基peg溶解于二氯甲烷，加入小分子鏈轉(zhuǎn)移劑s-1-十二烷基-s′-(α，α″-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯(ctam)，隨后加入二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶，室溫條件下反應(yīng)后濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到大分子引發(fā)劑peg-ctam；在反應(yīng)器中加入大分子引發(fā)劑，用二甲基亞砜溶解后，加入疏水性的烯類單體，30-80℃下反應(yīng)24小時(shí)后，加入甲基丙烯酸縮水甘油醚，30-80℃下反應(yīng)24小時(shí)，濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到含環(huán)氧乙烷側(cè)基的嵌段共聚物；將所得共聚物溶于四氫呋喃中，加入n,n-二甲氨基乙硫醇，室溫反應(yīng)過(guò)夜；濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到以烯類聚合物為疏水段的三嵌段共聚物。

本發(fā)明的含羥基修飾的n,n-二甲氨基的陽(yáng)離子聚合物的制備方法，其特征是可降解聚酯為疏水段：將單羥基peg加入反應(yīng)器中，然后在反應(yīng)器中加入酯類單體，加入催化劑辛酸亞錫，100-130℃下反應(yīng)過(guò)夜，將產(chǎn)物用二氯甲烷溶解，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥得到peg-r聚合物；將peg-r溶解于二氯甲烷，加入小分子鏈轉(zhuǎn)移劑ctam，隨后加入二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶，室溫條件下反應(yīng)過(guò)夜，濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到大分子引發(fā)劑peg-r-ctam；將peg-r-ctam和甲基丙烯酸縮水甘油醚加入反應(yīng)器中，然后加入dmso，30℃下反應(yīng)24小時(shí)后濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到含環(huán)氧乙烷側(cè)基的嵌段共聚物；將所得嵌段共聚物溶于四氫呋喃中，加入n,n-二甲氨基乙硫醇，室溫反應(yīng)過(guò)夜后濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到以可降解聚酯為疏水段的三嵌段共聚物。

本發(fā)明的含羥基修飾的n,n-二甲氨基的陽(yáng)離子聚合物應(yīng)用于負(fù)載dna、sirna或多肽、蛋白類生物藥物，用于藥物遞送。

具體詳細(xì)說(shuō)明如下：

一種含羥基修飾的n,n-二甲氨基的陽(yáng)離子聚合物，所述的羥基修飾的n,n-二甲氨基是n，n，n-二甲基乙基-2-羥基-丙基硫醚(本發(fā)明中縮寫為hdma)，所述的陽(yáng)離子聚合物可以是均聚物或共聚物，其中鍵接hdma的結(jié)構(gòu)單元的總質(zhì)量占陽(yáng)離子聚合物質(zhì)量的10％～100％，所述的陽(yáng)離子聚合物的相對(duì)分子量為5000-40000。

hdma的結(jié)構(gòu)如式1所示：

式1中x為鍵接hdma與大分子主鏈的基團(tuán)，可以是酯基、醚鍵、酰胺等基團(tuán)，優(yōu)選酯基。

hdma可以通過(guò)n,n-二甲氨基乙硫醇與環(huán)氧基團(tuán)間的開環(huán)加成反應(yīng)而形成。

hdma側(cè)基作為一種陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)單元，可以通過(guò)靜電吸附負(fù)載dna、sirna、多肽及蛋白等負(fù)電性的物質(zhì)，起到吸附負(fù)載或分離的作用。其特征還在于羥基的存在，會(huì)降低陽(yáng)離子的毒性。

所述的陽(yáng)離子聚合物，特征是一種由鍵接hdma的結(jié)構(gòu)單元組成的均聚物，即鍵接hdma的結(jié)構(gòu)單元的總質(zhì)量占陽(yáng)離子聚合物質(zhì)量的100％。

所述的陽(yáng)離子聚合物，特征是一種共聚物，是鍵接hdma的結(jié)構(gòu)單元與其它結(jié)構(gòu)單元形成的共聚物，可以是無(wú)規(guī)共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物、星形共聚物等；其中鍵接hdma的結(jié)構(gòu)單元的總質(zhì)量占陽(yáng)離子聚合物質(zhì)量的10％～90％，

所述的共聚物，特征是含有疏水性結(jié)構(gòu)單元的兩親性共聚物，疏水性結(jié)構(gòu)單元的總質(zhì)量占陽(yáng)離子聚合物質(zhì)量的10％～60％。

所述的共聚物進(jìn)一步優(yōu)選兩親性三嵌段共聚物，是帶有hdma側(cè)基的陽(yáng)離子聚合物(phdma)與非離子親水性聚合物(b)和疏水段(r)組成的兩親性三嵌段共聚物；其中，phdma嵌段的相對(duì)分子量為2000-10000，嵌段b的相對(duì)分子量為2000-10000，疏水段r的相對(duì)分子量為2000-20000；phdma嵌段在三嵌段共聚物中的質(zhì)量百分含量為10％-70％。

上述的非離子親水性聚合物(b)選自聚乙二醇(peg)、聚羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯、磷酸膽堿。

所述的兩親性三嵌段共聚物，進(jìn)一步優(yōu)選peg-r-phdma型嵌段共聚物。具體地，peg-r-phdma可以是式2所示的結(jié)構(gòu)，其中，phdma是聚甲基丙烯酸(n，n，n-二甲基乙基-2-羥基-丙基硫醚)酯。

式2中n是聚乙二醇的結(jié)構(gòu)單元數(shù)，是45-227的整數(shù)；na是聚甲基丙烯酸(n，n，n-二甲基乙基-2-羥基-丙基硫醚)酯的結(jié)構(gòu)單元數(shù)，是8-41的整數(shù)。

上述共聚物中的疏水段r，選擇可降解聚酯類疏水性聚合物或烯類單體的聚合物；優(yōu)選己內(nèi)酯(cl)、已交酯(ga)丙交酯(la)、4-(乙二醇縮酮)-己內(nèi)酯(bmcl)、甲基丙烯酸-2-(3，5-二惡烷-4-(2，4，6-三甲氧基苯))丙酯(ttma)、甲基丙烯酸(二異丙基氨基)乙酯(dpa)的均聚物或共聚物。

所述的peg-r-phdma型嵌段共聚物，疏水段r優(yōu)選ttma的均聚物(pttma)，分子量為2000-10000。

以烯類聚合物為疏水段的三嵌段共聚物的制備方法是：將聚乙二醇溶解于二氯甲烷，加入小分子鏈轉(zhuǎn)移劑s-1-十二烷基-s′-(α，α″-二甲基-α″-乙酸)三硫代碳酸酯(ctam)，隨后加入二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶，室溫條件下反應(yīng)后濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到大分子引發(fā)劑peg-ctam；在反應(yīng)器中加入大分子引發(fā)劑，用二甲基亞砜溶解后，加入疏水性的烯類單體，如ttma或dpa，30-80℃下反應(yīng)24小時(shí)后，加入甲基丙烯酸縮水甘油醚，30-80℃下反應(yīng)24小時(shí)，濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到含環(huán)氧乙烷側(cè)基的嵌段共聚物；將所得共聚物溶于四氫呋喃中，加入n,n-二甲氨基乙硫醇，室溫反應(yīng)過(guò)夜。濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到以烯類聚合物為疏水段的三嵌段共聚物。

以可降解聚酯為疏水段的三嵌段共聚物的制備方法是：將peg加入反應(yīng)器中，然后在反應(yīng)器中加入酯類單體，如cl或la，加入辛酸亞錫，100-130℃下反應(yīng)過(guò)夜，將產(chǎn)物用二氯甲烷溶解，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥得到peg-r聚合物；將peg-r溶解于二氯甲烷，加入小分子鏈轉(zhuǎn)移劑ctam，隨后加入二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶，室溫條件下反應(yīng)過(guò)夜，濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到大分子引發(fā)劑peg-r-ctam；將peg-r-ctam和甲基丙烯酸縮水甘油醚加入反應(yīng)器中，然后加入dmso，30℃下反應(yīng)24小時(shí)后濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到含環(huán)氧乙烷側(cè)基的嵌段共聚物；將所得嵌段共聚物溶于四氫呋喃中，加入n,n-二甲氨基乙硫醇，室溫反應(yīng)過(guò)夜后濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到以可降解聚酯為疏水段的三嵌段共聚物。

本發(fā)明中所述的共聚物帶有較強(qiáng)的正電荷，可用于負(fù)載dna、sirna或多肽、蛋白類生物藥物，用于藥物遞送。其中所述的兩親性共聚物，其在水溶液中自組裝形成平均粒徑小于200nm的聚陽(yáng)離子納米粒，表面羥基的存在可以明顯提高該聚陽(yáng)離子的生物相容性，細(xì)胞相容性較好且沒(méi)有溶血現(xiàn)象。所形成的納米粒負(fù)載dna、sirna或多肽、蛋白類生物藥物，內(nèi)核可以負(fù)載疏水性的化學(xué)藥物，用于藥物遞送。

研究表明，所形成的兩親性共聚物納米粒，負(fù)載sirna，在細(xì)胞水平和小鼠皮下注射都能夠產(chǎn)生較高的基因沉默效率，作為sirna載體，具有較好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1實(shí)施例1所制備的含環(huán)氧乙烷側(cè)基的嵌段共聚物的核磁共振氫譜圖，證明所合成的含環(huán)氧側(cè)基的前體聚合物結(jié)構(gòu)與所設(shè)計(jì)的相符。

圖2實(shí)施例1所制備的羥基修飾的陽(yáng)離子兩親性嵌段共聚物eta-1的核磁共振氫譜圖，證明其嵌段結(jié)構(gòu)中各嵌段基團(tuán)和分子量，與設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)相符，具體數(shù)據(jù)見表1。

圖3eta-1納米粒sirna負(fù)載凝膠電泳圖，證明納米粒能夠較好的負(fù)載sirna。

圖4eta-1納米粒電鏡照片。證明eta-1在水中能夠自組裝形成100nm一下的納米粒。

圖5負(fù)載sirna的eta-1納米粒電鏡照片。負(fù)載sirna后的eta-1納米粒仍呈球形，粒徑略有下降。

圖6負(fù)載sirna的eta-1納米粒的細(xì)胞毒性，可見，細(xì)胞活性都在80％以上，具有很好的生物相容性。

圖7eta-1溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果說(shuō)明該共聚物溶血量與pbs緩沖液相近，基本不產(chǎn)生溶血。

圖8負(fù)載sirna的eta-1納米粒的轉(zhuǎn)染效率圖，在氮磷比15以上時(shí)，基因沉默效果均高于市售轉(zhuǎn)染試劑lipo2000，具有很好的sirna遞送功能。

圖9負(fù)載sirna的eta-1納米粒在體內(nèi)肝臟的基因沉默效果圖。結(jié)果證明在2mg/kg劑量下，該載體能夠明顯沉默肝臟細(xì)胞內(nèi)的靶基因，呈現(xiàn)出較好的體內(nèi)基因遞送功效。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。需要指出的是，對(duì)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思前提下還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下面僅以三嵌段共聚物的制備為例。

實(shí)施例1：兩親性三嵌段陽(yáng)離子共聚物eta-1的合成

將2g分子量2000的聚乙二醇單甲醚(mpeg2k)溶解于二氯甲烷，加入0.5g小分子鏈轉(zhuǎn)移劑ctam(macromolecules2006,39,1724-1730)，隨后加入二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)和4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫條件下反應(yīng)后濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到大分子raft試劑peg2k-ctam；在反應(yīng)器中加入1g大分子引發(fā)劑，用二甲基亞砜(dmso)溶解后，加入3.85gttma，30-80℃下反應(yīng)24小時(shí)后，加入2g的甲基丙烯酸縮水甘油醚，30-80℃下反應(yīng)24小時(shí)，濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到含環(huán)氧乙烷側(cè)基的嵌段共聚物，其核磁譜圖如圖1。取3g所得聚合物溶于四氫呋喃中，加入0.8gn,n-二甲氨基乙硫醇，室溫反應(yīng)過(guò)夜。濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到peg-r-phdma型嵌段共聚物eta-1，其核磁譜圖如圖2。

實(shí)施例2-6

實(shí)施例2-6的合成方法與實(shí)施例1裝置及反應(yīng)條件相同，在此基礎(chǔ)上只改變單體種類、投料量以及投料比，即三嵌段陽(yáng)離子共聚物三段的分子量。所得聚合物具體分子量信息如表1.

表1實(shí)施例1-11所制備的共聚物的結(jié)構(gòu)信息

實(shí)施例7-8

按實(shí)施例1方法，所不同的是不用ttma單體，用peg2k-ctam直接引發(fā)甲基丙烯酸縮水甘油醚聚合，得到peg與聚甲基丙烯酸縮水甘油醚的嵌段共聚物，然后與-二甲氨基乙硫醇反應(yīng)，側(cè)基鍵接上hdma。通過(guò)改變mpeg分子量和甲基丙烯酸縮水甘油醚單體用量，得到不同嵌段比和不同分子量的peg-phdma嵌段共聚物，ea-1和ea-2，見表1。

實(shí)施例9

按實(shí)施例1方法，用相同摩爾數(shù)的甲醇取代mpeg，制備raft試劑ch3-ctam，用ch3-ctam引發(fā)ttma聚合、再引發(fā)甲基丙烯酸縮水甘油醚聚合，得到二嵌段共聚物，再用n,n-二甲氨基乙硫醇與所得無(wú)規(guī)共聚物上的環(huán)氧基開環(huán)加成反應(yīng)，即可得到ttma與甲基丙烯酸(n，n，n-二甲基乙基-2-羥基-丙基硫醚)酯兩親性嵌段共聚物pt-pa。

實(shí)施例10

按實(shí)施例9方法，用ch3-ctam同時(shí)引發(fā)ttma和甲基丙烯酸縮水甘油醚聚合，得到無(wú)規(guī)共聚物，再用n,n-二甲氨基乙硫醇與所得無(wú)規(guī)共聚物上的環(huán)氧基開環(huán)加成反應(yīng)，即可得到ttma與甲基丙烯酸(n，n，n-二甲基乙基-2-羥基-丙基硫醚)酯兩親性無(wú)規(guī)共聚物p(t/a)-1，其中ttma結(jié)構(gòu)單元的含量為10％，p(t/a)-1的相對(duì)分子質(zhì)量為35000。

調(diào)整甲基丙烯酸縮水甘油醚單體的用量，或采用不同的共聚單體，即可得到不同組分的兩親性無(wú)規(guī)共聚物。

實(shí)施例11

按實(shí)施例10方法，不加入其它單體，用ch3-ctam直接引發(fā)甲基丙烯酸縮水甘油醚聚合，得到甲基丙烯酸(n，n，n-二甲基乙基-2-羥基-丙基硫醚)酯的均聚物pmhdma-25，分子量25000；調(diào)控單體與引發(fā)劑的比例，可得到不同分子量pmhdma。

實(shí)施例12含多羥基修飾的聚陽(yáng)離子的兩親性三嵌段共聚物eca-1的合成

將1gmpeg2k加入反應(yīng)器中，然后在反應(yīng)器中加入2gcl單體，最后加入兩滴辛酸亞錫，100-130℃下反應(yīng)過(guò)夜，將產(chǎn)物用二氯甲烷溶解，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥得到peg-pcl聚合物。將2gpeg2k-pcl溶解于二氯甲烷，加入0.5g小分子鏈轉(zhuǎn)移劑ctam，隨后加入二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)和4-二甲氨基吡啶(dmap)，室溫條件下反應(yīng)過(guò)夜，濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到大分子raft試劑peg2k-pcl-ctam。取1gpeg2k-pcl-ctam和2g的甲基丙烯酸縮水甘油醚加入反應(yīng)器中，然后加入10mldmso，30℃下反應(yīng)一段時(shí)間后濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到含環(huán)氧乙烷側(cè)基的嵌段共聚物。取3g所得聚合物溶于四氫呋喃中，加入0.8gn,n-二甲氨基乙硫醇，室溫反應(yīng)過(guò)夜后濃縮，在冰乙醚中沉淀，抽濾，真空干燥，得到羥基修飾的三嵌段陽(yáng)離子共聚物eca-1。

實(shí)施例13-18

合成方法與實(shí)施例7裝置及反應(yīng)條件相同，在此基礎(chǔ)上只改變單體種類、投料量以及投料比，即三嵌段陽(yáng)離子共聚物三段的分子量。所得聚合物具體結(jié)果信息如表2。

表2實(shí)施例12-18所制備的共聚物的結(jié)構(gòu)信息

實(shí)施例19：空白納米粒的制備

準(zhǔn)確稱取10mg的嵌段共聚物eta-1，溶于1ml的四氫呋喃，把嵌段共聚物溶液緩慢滴加到8ml攪拌的純凈水(也可以是pbs或生理鹽水)中，室溫?cái)嚢?h后，離心分離，清液為自組裝納米粒分散液，采用dls測(cè)試不同時(shí)間點(diǎn)納米粒溶液的粒徑和分布。以納米粒分散液中的含氮量為單位，將納米粒分散液稀釋得到1mm氮濃度的納米粒分散液，備用。

實(shí)施例20：sirna的負(fù)載

取一個(gè)1.5mlep管，向管中加入6ul的269ng/ul的sirna水溶液，取38.4ul的1mm氮濃度的eta-1納米粒分散液，然后加入355.60μl含dmem的水溶液，混合后靜置20ml獲得負(fù)載sirna的納米粒分散液。

實(shí)施例21：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

在24孔板中接種hepg-2細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×10⁴細(xì)胞/孔，細(xì)胞為穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶蛋白(luciferase)的hepg-2細(xì)胞，培養(yǎng)基體積為0.5ml。培養(yǎng)18h后，細(xì)胞融合率達(dá)到50％。轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)基換成dmem培養(yǎng)基。將100μl實(shí)施例14制備的含1.0μgsirna的eta-1納米粒溶液加入至24孔板中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行孔。37℃及5％co2的條件下，將細(xì)胞培養(yǎng)4h，然后取出孔中液體，換為含2％fbs的dmem低糖培養(yǎng)基，0.5ml/孔。培養(yǎng)48h后，棄去孔中的液體，用pbs清洗2次，然后向每孔加入200μl基因裂解緩沖液，凍融1次，使細(xì)胞裂解完全。吹打完全后，吸出細(xì)胞裂解液至新的ep管，離心(12000rpm，30s)，將上清液吸出。向10μl上清液中加入50μl底物后，采用熒光計(jì)(synergyht,biotek,usa)測(cè)定相對(duì)發(fā)光單位。用bca(pierce,usa)試劑盒測(cè)定總蛋白的濃度。將未加入任何試劑的細(xì)胞所表達(dá)的熒光素酶蛋白作為基準(zhǔn)，載體組表達(dá)的熒光素酶蛋白量除以未加入任何試劑的細(xì)胞表達(dá)的熒光素酶蛋白量即可得到蛋白表達(dá)的相對(duì)抑制效率。

實(shí)施例22-實(shí)施例33

選擇不同的共聚物，按照實(shí)施例19方法制備納米粒，按照實(shí)施例20方法負(fù)載sirna，再按實(shí)施例21的操作方法在不同的細(xì)胞系上進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果如表3：

表3所制備的陽(yáng)離子聚合物的基因負(fù)載、細(xì)胞相容性和基因沉默效率

表中的基因沉默效率實(shí)驗(yàn)中，sirna劑量為50nm。

實(shí)施例30：毒性實(shí)驗(yàn)

在96孔板中接種1×10⁴個(gè)hepg-2細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基體積為100μl，5％co2，37℃條件下培養(yǎng)24h。加入50μl含0.2μgsirna的負(fù)載納米粒溶液，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔，孔中分別加入dmem培養(yǎng)基，mtt以及二甲基亞砜，對(duì)照孔中分別加入相同體積的復(fù)合物溶液，dmem培養(yǎng)基、mtt、以及二甲基亞砜，5％co2，37℃條件下培養(yǎng)48h。每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，繼續(xù)5％co2，37℃培養(yǎng)4h。棄去樣品孔內(nèi)上清液，向每孔中加入150μldmso，置于低速震蕩儀上振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔吸光值。計(jì)算各個(gè)樣品孔細(xì)胞相對(duì)活力，所得細(xì)胞活力均在80％以上。示例列于如表3。

實(shí)施例35：溶血實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)備2％紅細(xì)胞，自兔子心臟抽取血液5ml，加入0.2ml抗凝劑edta，用pbs洗滌、離心，除去表面的白細(xì)胞，至上清液不顯紅色，棄上清液后取1ml再加入50ml的pbs即得。將材料用pbs溶液調(diào)整濃度為50，30，20，15，10和5。每次使用紅細(xì)胞前，用pbs洗，直至上清液中無(wú)明顯紅色(略黃)，吸取底物200μl，稀釋至10ml使用。將0.5ml的材料與0.5ml的2％的紅細(xì)胞溶液混合，室溫條件下靜止3h，之后用10050r/min離心3min。取出100μl于96孔板上，用570nm的波長(zhǎng)檢測(cè)。分別以水和pbs作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。每個(gè)樣品2個(gè)平行。

溶血率(％)＝(樣品吸收-陰性對(duì)照吸收)/(陽(yáng)性對(duì)照吸收-陰性對(duì)照吸收)×100％。溶血率超過(guò)5％視為溶血。

實(shí)施例36：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

取雄性c57bl/6鼠(18-20g)，將制備好的含anti-apobsirna的eta-1納米粒分散液通過(guò)靜脈注射的方式注入到小鼠體內(nèi)。給藥劑量為1mg/kg。48h以后處死小鼠，取出肝臟，通過(guò)rt-pcr檢測(cè)小鼠的apob的含量。結(jié)果見附圖9。