本發(fā)明屬于油脂提取領(lǐng)域，尤其是一種利用脈沖電場(chǎng)輔助提取微藻油脂的方法。
背景技術(shù)：
以微藻作為原料制備生物柴油的技術(shù)由微藻藻種的選育、微藻的培養(yǎng)、微藻的收獲、油脂提取及粗脂的轉(zhuǎn)酯化等幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)組成。其中油脂提取的成本較高是微藻柴油工藝工業(yè)化的主要瓶頸之一。濕法提脂的成本較低，但目前缺乏可工業(yè)化的微藻破壁技術(shù)以及可以替代氯仿甲醇的低毒溶劑。國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)微藻細(xì)胞破壁的各種方法進(jìn)行了研究，包括機(jī)械法中的反復(fù)凍融法、珠磨法、高壓均質(zhì)法、超聲法、微波法，化學(xué)法中的酸堿法、滲壓震擾法和生物法等，但這些方法在經(jīng)濟(jì)或技術(shù)上均存在工業(yè)化瓶頸。因此迫切需要尋找一種破壁效率高、成本低、綠色低毒且具有較好的工業(yè)化前景的微藻油脂提取技術(shù)。
脈沖電場(chǎng)技術(shù)(pulsedelectricfields,pef)是以較高的電場(chǎng)強(qiáng)度(10-50kv/cm)、較短的脈沖寬度（0-100μs）和較高的脈沖頻率（0-2000hz）對(duì)液體、半固體食品進(jìn)行處理，并且可以組成連續(xù)殺菌和無菌灌裝的生產(chǎn)線。
主要有以下兩種作用協(xié)同進(jìn)行。
1、脈沖電場(chǎng)產(chǎn)生磁場(chǎng)，這種脈沖電場(chǎng)和脈沖磁場(chǎng)交替作用，使細(xì)胞膜透性增加，振蕩加劇，膜強(qiáng)度減弱，因而膜被破壞，膜內(nèi)物質(zhì)容易流出，膜外物質(zhì)容易滲入，細(xì)胞膜的保護(hù)作用減弱甚至消失。
2、電離作用電極附近物質(zhì)電離產(chǎn)生的陰、陽離子與膜內(nèi)生命物質(zhì)作用，因而阻斷了膜內(nèi)正常生化反應(yīng)和新陳代謝過程等的進(jìn)行；同時(shí)，液體介質(zhì)電離產(chǎn)生臭氧的強(qiáng)烈氧化作用，能與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生一系列反應(yīng)。
脈沖電場(chǎng)法（pef）是食品加工領(lǐng)域中的一種新型非熱力殺菌技術(shù)，以其處理溫度低、時(shí)間短、能耗低、污染小等良好的應(yīng)用特性引起了國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注，工業(yè)化前景十分廣闊。截至目前，pef技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品工程領(lǐng)域的各個(gè)方面，包括食品的殺菌、干燥脫水、物質(zhì)提取等。因此考慮將pef技術(shù)應(yīng)用于微藻油脂提取制備生物柴油領(lǐng)域。
為此，有必要設(shè)計(jì)一種新型的微藻油脂提取辦法，能夠高效、低成本的提取油脂。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的主要目的是提供一種利用脈沖電場(chǎng)輔助提取微藻油脂的方法，用來克服現(xiàn)有微藻油脂提取方法成本高、難以工業(yè)化應(yīng)用的問題。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種利用脈沖電場(chǎng)輔助提取微藻油脂的方法，包括以下步驟：
步驟a：破壁步驟，所述破壁步驟系將一定濃度的微藻藻液泵入脈沖電場(chǎng)進(jìn)行破壁處理；
步驟b：離心步驟，所述離心步驟系對(duì)步驟a獲得的破壁后藻液進(jìn)行離心處理；
步驟c：提取步驟，所述提取步驟系取步驟b獲得的藻泥并向其中加入提取溶劑進(jìn)行提取反應(yīng)，提取時(shí)間為0.5-30h；
步驟d：萃取步驟，所述萃取步驟系向步驟c獲得的產(chǎn)物中加入蒸餾水并獲取含油脂有機(jī)相，待有機(jī)溶劑揮發(fā)殆盡，烘干后獲得粗油脂。通過該方法可以快速、低成本的對(duì)微藻油脂進(jìn)行提取。
本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述微藻是經(jīng)過誘變馴化的小球藻、柵藻、新月藻、杜氏鹽藻藻種中的一種或幾種。該方法適用范圍廣泛。
本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：步驟a中進(jìn)行破壁處理時(shí)微藻濃度為1×107-1×108個(gè)/ml，電場(chǎng)強(qiáng)度為5-50kv/cm、頻率為10khz-200khz、脈寬為2-20μs、樣品通過脈沖電場(chǎng)的流速為3-15l/h、循環(huán)次數(shù)為1-5次。上述參數(shù)對(duì)破壁時(shí)候的破壁效率起到?jīng)Q定性作用。微藻的破壁效率指的是破壁后死細(xì)胞在總微藻細(xì)胞個(gè)數(shù)中的占比。該數(shù)據(jù)可以通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得。脈沖電場(chǎng)由高壓脈沖電源、示波器、處理室、電腦控制系統(tǒng)四部分構(gòu)成，所述脈沖電場(chǎng)參數(shù)指的是所設(shè)置的脈沖電場(chǎng)的電場(chǎng)強(qiáng)度、頻率、脈寬、樣品通過脈沖電場(chǎng)的流速、循環(huán)次數(shù)等參數(shù)。
本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：步驟b中離心速率為5000-8000r/min，離心時(shí)間為5-10min。
本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：步驟c中所用提取液為正己烷/異丙醇、正己烷/乙醇、正己烷/正丙醇、石油醚/乙醇、乙酸乙酯/甲醇、乙酸乙酯/乙醇復(fù)合體系中的一種。使用上述復(fù)合溶劑體系來代替現(xiàn)在常用的氯仿/甲醇，氯仿/甲醇毒性較強(qiáng)，而上述復(fù)合體系基本毒性較弱。
本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述步驟c中提取液中第一種溶液和第二種溶液的配比為體積比3:1、2:1、3:2、1:1、2:3和1:2中的一種。
本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：步驟c中提取液與步驟b中離心前藻液的體積比為1:3、1:2、1:1、2:1、3:1中一種。
本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：步驟c中提取反應(yīng)在搖床上進(jìn)行，搖床的轉(zhuǎn)速為100-200r/min。
本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：步驟d中加入蒸餾水的量與步驟c中產(chǎn)物的量的體積比為1:7、1:5、1:3中一種；有機(jī)層的烘干溫度為73-82℃。
本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：步驟d中通過離心使步驟c中產(chǎn)物分層，離心轉(zhuǎn)速為5000-8000r/min、離心時(shí)間為3-10min。
本發(fā)明的有益效果是：本方案構(gòu)建了一種利用脈沖電場(chǎng)輔助提取微藻油脂的方法，脈沖電場(chǎng)破壁微藻細(xì)胞具有破壁效率高、成本低，可工業(yè)化的優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，采用低毒溶劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的毒性較高的氯仿/甲醇，可以在保證提取效率的同時(shí)使提取過程更加環(huán)保，為微藻油脂提取提供了一種具有良好工業(yè)化前景的技術(shù)。
附圖說明
為了更清楚地說明本申請(qǐng)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本申請(qǐng)中記載的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的利用脈沖電場(chǎng)輔助提取微藻油脂的方法的示意圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供一種利用脈沖電場(chǎng)輔助提取微藻油脂的方法。以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
如圖1所示，本發(fā)明的技術(shù)方案是：構(gòu)建一種利用脈沖電場(chǎng)輔助提取微藻油脂的方法，包括1、脈沖電場(chǎng)處理系統(tǒng)；2、微藻藻液；3、泵；4、脈沖電場(chǎng)破壁后的微藻藻液；5、藻液離心并向離心后藻泥中添加油脂提取溶劑；6、搖床上進(jìn)行提取反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，加入一定量的蒸餾水離心分層，吸取含油脂有機(jī)相，待有機(jī)溶劑揮發(fā)殆盡，烘干后獲得粗油脂。
具體實(shí)施過程如下：一定濃度微藻藻液2通過蠕動(dòng)泵3進(jìn)入脈沖電場(chǎng)處理系統(tǒng)1中的處理室，設(shè)置脈沖電場(chǎng)參數(shù)進(jìn)行脈沖電場(chǎng)破壁處理，所得破壁后的微藻藻液4經(jīng)離心處理，向離心所得藻泥中加入提取溶劑5，將其放置于搖床6進(jìn)行提取反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，加入一定量的蒸餾水離心分層，吸取含油脂有機(jī)相，待有機(jī)溶劑揮發(fā)殆盡，于烘箱中烘干后獲得粗油脂。具體實(shí)施例中，所述微藻是經(jīng)過誘變馴化的小球藻、柵藻、新月藻、杜氏鹽藻等藻種中的一種或幾種。具體實(shí)施例中，脈沖電場(chǎng)處理微藻時(shí)，微藻濃度為1×107-1×108個(gè)/ml，電場(chǎng)強(qiáng)度為5-50kv/cm、頻率為10khz-200khz、脈寬為2-20μs、樣品通過脈沖電場(chǎng)的流速為3-15l/h、循環(huán)次數(shù)為1-5次。具體實(shí)施例中，所述油脂提取溶劑為正己烷/異丙醇、正己烷/乙醇、正己烷/正丙醇、石油醚/乙醇、乙酸乙酯/甲醇和乙酸乙酯/乙醇中的一種，溶劑間配比為3:1、2:1、3:2、1:1、2:3和1:2六個(gè)水平中的一個(gè)，溶劑與藻液比（液料比）為1:3、1:2、1:1、2:1、3:1五個(gè)水平中的一個(gè)，提取時(shí)間為0.5-30h。具體實(shí)施例中，所述離心所得藻泥，離心速率為5000-8000r/min,時(shí)間為5-10min。所述搖床轉(zhuǎn)速為100-200r/min。所述離心分層，離心速率為5000-8000r/min，時(shí)間為3-10min。所述加入一定量的蒸餾水離心分層，所加蒸餾水用量與所用溶劑的比為1:7、1:5、1:3三個(gè)水平中的一個(gè)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的較優(yōu)實(shí)施案例做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
（1）確定對(duì)小球藻破壁具有顯著影響的參數(shù)：通過活死細(xì)胞計(jì)數(shù)法確定出脈沖電場(chǎng)的電場(chǎng)強(qiáng)度、頻率、脈寬、樣品通過脈沖電場(chǎng)的流速、循環(huán)次數(shù)是影響脈沖電場(chǎng)對(duì)小球藻破壁效果的關(guān)鍵因素；
（2）獲得脈沖電場(chǎng)輔助微藻油脂提取的最佳條件：通過改變脈沖電場(chǎng)參數(shù)獲得小球藻（濃度為1.2×107個(gè)/ml）油脂提取率，得出小球藻油脂提取率最高時(shí)，脈沖電場(chǎng)的參數(shù)為場(chǎng)強(qiáng)20kv/cm，流速5.4l/h，頻率130hz，脈寬6μs，循環(huán)次數(shù)3次。
（3）獲得無毒或低毒的小球藻油脂提取溶劑：通過油脂提取率，從正己烷/異丙醇、正己烷/乙醇、正己烷/正丙醇、石油醚/乙醇、乙酸乙酯/甲醇和乙酸乙酯/乙醇中篩選出正己烷/乙醇是替換氯仿/甲醇的最佳溶劑。
（4）溶劑投加方式優(yōu)化：通過油脂提取率，優(yōu)化出較優(yōu)的溶劑投加方式為60ml藻液經(jīng)8000r/min離心10min后，于藻泥中加入正己烷36ml，乙醇24ml，橫置于搖床上150rpm震蕩3h，反應(yīng)結(jié)束后向其中加入12ml蒸餾水，8000r/min離心5min使分層，吸取含油脂的正己烷相，待有機(jī)溶劑揮發(fā)殆盡，80℃烘干后獲得粗油脂。
實(shí)施例2
（1）確定對(duì)小球藻破壁具有顯著影響的參數(shù)：通過活死細(xì)胞計(jì)數(shù)法確定出脈沖電場(chǎng)的電場(chǎng)強(qiáng)度、頻率、脈寬、樣品通過脈沖電場(chǎng)的流速、循環(huán)次數(shù)是影響脈沖電場(chǎng)對(duì)小球藻破壁效果的關(guān)鍵因素；
（2）獲得脈沖電場(chǎng)輔助微藻油脂提取的最佳條件：通過改變脈沖電場(chǎng)參數(shù)獲得小球藻（濃度為1.6×107個(gè)/ml）油脂提取率，得出小球藻油脂提取率最高時(shí)，脈沖電場(chǎng)的參數(shù)為場(chǎng)強(qiáng)20kv/cm，流速4.2l/h，頻率150hz，脈寬10μs，循環(huán)次數(shù)3次。
（3）獲得無毒或低毒的小球藻油脂提取溶劑：通過油脂提取率，從正己烷/異丙醇、正己烷/乙醇、正己烷/正丙醇、石油醚/乙醇、乙酸乙酯/甲醇和乙酸乙酯/乙醇中篩選出正己烷/乙醇是替換氯仿/甲醇的最佳溶劑。
（4）溶劑投加方式優(yōu)化：通過油脂提取率，優(yōu)化出較優(yōu)的溶劑投加方式為40ml藻液經(jīng)8000r/min離心10min后，于藻泥中加入正己烷24ml，乙醇16ml，橫置于搖床上150rpm震蕩3h，反應(yīng)結(jié)束后向其中加入8ml蒸餾水，8000r/min離心5min使分層，吸取含油脂的正己烷相，待有機(jī)溶劑揮發(fā)殆盡，80℃烘干后獲得粗油脂。
實(shí)施例3
（1）確定對(duì)小球藻破壁具有顯著影響的參數(shù)：通過活死細(xì)胞計(jì)數(shù)法確定出脈沖電場(chǎng)的電場(chǎng)強(qiáng)度、頻率、脈寬、樣品通過脈沖電場(chǎng)的流速、循環(huán)次數(shù)是影響脈沖電場(chǎng)對(duì)小球藻破壁效果的關(guān)鍵因素；
（2）獲得脈沖電場(chǎng)輔助微藻油脂提取的最佳條件：通過改變脈沖電場(chǎng)參數(shù)獲得小球藻（濃度為2.3×107個(gè)/ml）油脂提取率，得出小球藻油脂提取率最高時(shí)，脈沖電場(chǎng)的參數(shù)為場(chǎng)強(qiáng)20kv/cm，流速4.2l/h，頻率150hz，脈寬10μs，循環(huán)次數(shù)3次。
（3）獲得無毒或低毒的小球藻油脂提取溶劑：通過油脂提取率，從正己烷/異丙醇、正己烷/乙醇、正己烷/正丙醇、石油醚/乙醇、乙酸乙酯/甲醇和乙酸乙酯/乙醇中篩選出正己烷/乙醇是替換氯仿/甲醇的最佳溶劑。
（4）溶劑投加方式優(yōu)化：通過油脂提取率，優(yōu)化出較優(yōu)的溶劑投加方式為30ml藻液經(jīng)8000r/min離心10min后，于藻泥中加入正己烷18ml，乙醇12ml，橫置于搖床上150rpm震蕩3h，反應(yīng)結(jié)束后向其中加入6ml蒸餾水，8000r/min離心5min使分層，吸取含油脂的正己烷相，待有機(jī)溶劑揮發(fā)殆盡，80℃烘干后獲得粗油脂。
本方案構(gòu)建了一種利用脈沖電場(chǎng)輔助提取微藻油脂的方法，脈沖電場(chǎng)破壁微藻細(xì)胞具有破壁效率高、成本低，可工業(yè)化的優(yōu)勢(shì)；同時(shí)，采用低毒溶劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的毒性較高的氯仿/甲醇，可以在保證提取效率的同時(shí)使提取過程更加環(huán)保，為微藻油脂提取提供了一種具有良好工業(yè)化前景的技術(shù)。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。