本發(fā)明還涉及以此方式獲得的微藻分離蛋白。
背景技術(shù)：
：所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，小球藻是一種潛在的食物來源，因?yàn)樗鼈兏缓鞍踪|(zhì)和其他必需營(yíng)養(yǎng)素。它們被描述為包含45％的蛋白質(zhì)、20％的脂肪、20％的碳水化合物、5％的纖維素和10％的礦物質(zhì)和維生素。鑒于其豐度和氨基酸譜，微藻蛋白因此被認(rèn)為是大豆蛋白或豌豆蛋白的替代性食物來源。蛋白部分也可以被開發(fā)為化妝品行業(yè)、或甚至醫(yī)藥行業(yè)中的功能劑。然而，由于在所述部分中存在不希望的化合物(例如葉綠素)而導(dǎo)致包含它們的食物組合物的顏色、味道和結(jié)構(gòu)方面發(fā)生不希望的變化，所以在微藻蛋白的食品應(yīng)用方面的發(fā)展尚不顯著。為了增加其在食品應(yīng)用中的潛力，并且也為了增加其商業(yè)價(jià)值，因此必須在不影響它們的分子結(jié)構(gòu)的前提下從微藻中提取這些蛋白。“軟”提取技術(shù)將因此需要分離具有高溶解度和良好技術(shù)和功能特性的蛋白質(zhì)，但是微藻細(xì)胞壁的剛性，尤其綠色微藻的剛性，根本上與這一點(diǎn)矛盾，這是因?yàn)樗茐牧思?xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的提取和完整性。因此，與其相反，常規(guī)地“硬”的物理或化學(xué)條件被用來破壞微藻細(xì)胞壁。因此，許多研究提出了堿溶類型、通過有機(jī)溶劑型或高壓勻漿類型提取的技術(shù)。然而，在這些技術(shù)選擇中，蛋白質(zhì)的變性未認(rèn)為是麻煩的，這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)的這些方法開發(fā)，是出于分析的目的，或意在提供用于酶消化的底物，從而產(chǎn)生水解蛋白。然而，保存細(xì)胞組分完整性的有效崩解方法具有不僅最大化產(chǎn)率，而且最大化提取的產(chǎn)物的質(zhì)量的責(zé)任。換言之，用于優(yōu)化崩解壁的方法必須例如避免：-目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)污染，-使用過高的破裂能；后者可能導(dǎo)致感興趣的細(xì)胞內(nèi)分子的不可逆變性或降解。此外，對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)而言，對(duì)于選擇的方法，重要的是可轉(zhuǎn)換值這一規(guī)模。最后，這一細(xì)胞崩解步驟的引入必須是容易的，并且必須對(duì)隨后的方法/處理步驟不具有負(fù)面影響。所有這些限制影響崩解方法的效率并且由于同樣原因影響其能量消耗。這就是為什么珠磨機(jī)技術(shù)是優(yōu)選的，因?yàn)樗徽J(rèn)為對(duì)于按其天然形式釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)是有效的。在珠磨機(jī)中，將細(xì)胞與小球形顆粒一起以懸浮液狀態(tài)攪動(dòng)。細(xì)胞的破碎是由珠間剪切力、碾磨以及與珠的碰撞引起的。例如，專利US5330913中給出了一種適合的珠磨機(jī)的描述。這些珠使細(xì)胞破裂以從中釋放細(xì)胞內(nèi)容物。然后以“水包油”乳液形式獲得粒徑小于起源細(xì)胞的懸浮液。通常霧化此乳液并且消除水，然而留下包含由細(xì)胞碎片、間質(zhì)可溶性化合物和油組成的異質(zhì)混合物的干燥粉末。在使用這些細(xì)胞崩解技術(shù)時(shí)難以解決的是單獨(dú)地分離細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物(以便排除膜碎片、糖、纖維和脂肪)，并且尤其是保存蛋白負(fù)載的質(zhì)量。在四爿藻屬的微藻的情況下，安雅施文茨法伊爾(AnjaSchwenzfeier)等人(生物資源技術(shù)(BioresourceTechnology)，2011，102，9121-9127)提出了保證分離蛋白質(zhì)的溶解度和氨基酸譜質(zhì)量的方法，其中污染物(例如染色物質(zhì))被除去，該方法包括以下步驟：-用珠磨機(jī)進(jìn)行細(xì)胞崩解，-將磨碎的微藻懸浮液離心，-上清液的透析，-穿過離子交換樹脂，-洗脫物的透析，-脫色，然后-洗滌和再懸浮。然而，這種實(shí)驗(yàn)室方法(用于處理24g的生物質(zhì))不能放大到工業(yè)規(guī)模，其中而將珠磨機(jī)方法用于回收完整生物質(zhì)。已經(jīng)提出了替代解決方案，完全地改變了用于釋放微藻細(xì)胞內(nèi)容物的技術(shù)，例如脈沖場(chǎng)電處理。這是因?yàn)樯锛?xì)胞暴露于高強(qiáng)度脈沖電場(chǎng)會(huì)改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。外源場(chǎng)引起細(xì)胞膜的充電。在充足的跨膜電壓(0.5V-1V)下，磷脂的分子排列改變，這導(dǎo)致細(xì)胞膜失去其屏障作用，使得它可滲透。取決于使用的條件，這一細(xì)胞膜透化會(huì)是可逆的或不可逆的。然而，為了有效提取細(xì)胞內(nèi)化合物，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員建議造成細(xì)胞膜的不可逆的透化，由此導(dǎo)致其崩解。然后，細(xì)胞膜的這一破裂促進(jìn)釋放細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，并且在使用補(bǔ)充性溶劑提取技術(shù)的情況下，也促進(jìn)溶劑滲透進(jìn)入細(xì)胞。盡管是有前景的，但是不幸地，這一技術(shù)并不能外推至工業(yè)規(guī)模以處理在1m3至200m3的反應(yīng)器中產(chǎn)生的生物質(zhì)。其結(jié)果是，對(duì)于提供用于弱化微藻細(xì)胞壁的技術(shù)仍存在未滿足的需求，該技術(shù)能夠釋放細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物，而不崩解細(xì)胞或削弱其組分的質(zhì)量。本申請(qǐng)人公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種需要可以通過將用于微藻細(xì)胞的熱透化的方法與離心和膜分離(微孔過濾，超濾)的步驟加以組合得到滿足。因此，本申請(qǐng)人公司反對(duì)一個(gè)技術(shù)偏見，該技術(shù)偏見認(rèn)為，用于細(xì)胞破碎的熱方法，就像由機(jī)械崩解引起的剪切力，是用于降解或變性源自微藻的產(chǎn)物的替代的技術(shù)(里奇蒙(Richmond)，1986，微藻大量培養(yǎng)手冊(cè)(HandbookofMicroalgalMassCulture)，CRC出版有限公司(CRCPress,Inc)-莫利納格里馬(MolinaGrima)等人，2003，微藻生物質(zhì)和代謝物的回收：方法選項(xiàng)和經(jīng)濟(jì)學(xué)(Recoveryofmicroalgalbiomassandmetabolites:processoptionsandeconomics)，生物技術(shù)進(jìn)步(Biotechnol.Adv.)20:491-515)。此外，一旦釋放自細(xì)胞內(nèi)區(qū)室，可以容易地通過離心和膜分離進(jìn)行分子的回收，只要由本申請(qǐng)人公司開發(fā)的熱處理并不導(dǎo)致細(xì)胞壁的崩解。本發(fā)明涉及一種用于熱透化小球藻屬微藻生物質(zhì)的方法，該方法以從微藻生物質(zhì)中回收尤其富含肽和多肽并且富含寡糖的可溶性部分的方式進(jìn)行。更確切地，根據(jù)本發(fā)明所述的方法是一種用于從小球藻屬微藻生物質(zhì)制備分離蛋白的方法，該方法包括以下步驟：-提供一種由發(fā)酵產(chǎn)生的微藻生物質(zhì)，-任選地，洗滌該生物質(zhì)，以便消除間質(zhì)可溶性化合物，-在50℃和150℃之間，優(yōu)選在100℃和150℃之間的溫度下將該生物質(zhì)熱透化，持續(xù)時(shí)間在10秒和5分鐘之間，優(yōu)選持續(xù)時(shí)間在10秒和1分鐘之間，-將以此方式透化的生物質(zhì)通過選自下組的固液分離技術(shù)進(jìn)行消除，該組由以下各項(xiàng)組成：正向過濾或切向過濾、絮凝和離心，更具體地，多級(jí)離心，以獲得可溶性部分，-任選地，將以此方式獲得的可溶性部分通過微孔過濾進(jìn)行回收和澄清，以便從中除去殘余不溶性物質(zhì)，-在具有小于5kDa，優(yōu)選在1kDa和5kDa之間的截止閾值的膜上對(duì)該可溶性部分(澄清的或未澄清的，取決于是否分別進(jìn)行了前述回收和澄清的步驟)進(jìn)行超濾，以便獲得可溶性分離蛋白，然后-將所述分離蛋白蒸發(fā)、巴氏滅菌并霧化。微藻的選擇優(yōu)選地，小球藻屬微藻選自由普通小球藻、根腐小球藻和原殼小球藻組成的組，并且更具體地是原殼小球藻。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該菌株為原殼小球藻(菌株UTEX250-美國(guó)得克薩斯大學(xué)奧斯汀分校藻類培養(yǎng)物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin-USA))。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，該菌株為耐熱性小球藻(菌株UTEX1663-美國(guó)得克薩斯大學(xué)奧斯汀分校藻類培養(yǎng)物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin-USA))。在異養(yǎng)條件下并且在不存在光的情況下進(jìn)行培養(yǎng)通常導(dǎo)致產(chǎn)生具有按干細(xì)胞的重量計(jì)，45％至70％的蛋白含量(通過測(cè)量氮含量N×6.25進(jìn)行評(píng)估)的小球藻生物質(zhì)。如將在下文示例，分兩個(gè)步驟進(jìn)行這一培養(yǎng)：-在包含葡萄糖和酵母提取物的培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，在28℃下，伴隨攪動(dòng)，持續(xù)72h，然后-自身在葡萄糖和酵母提取物中持續(xù)多于36h，在28℃下，伴隨攪動(dòng)并且在用氨水調(diào)節(jié)的pH6.5下，進(jìn)行用于產(chǎn)生生物質(zhì)的培養(yǎng)，這生成具有按干細(xì)胞的重量計(jì)，52％的級(jí)別的蛋白含量(用Nx6.25進(jìn)行評(píng)估)的大約80g/l的生物質(zhì)。然后通過固液分離，通過正面過濾或切向過濾、或通過另外為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任一方式收集生物質(zhì)。任選地，本申請(qǐng)人公司然后推薦以這樣一種方式洗滌生物質(zhì)，該方式是關(guān)于通過生物質(zhì)的一系列的濃縮(通過離心)/稀釋來消除間質(zhì)可溶性化合物。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“間質(zhì)可溶性化合物”旨在意指發(fā)酵培養(yǎng)基中的所有可溶性有機(jī)污染物，例如水溶性化合物，例如鹽、殘余葡萄糖、具有2或3的聚合度(或DP)的寡糖、或肽。然后將其間質(zhì)可溶性化合物的以此方式純化的生物質(zhì)優(yōu)先調(diào)節(jié)至按重量計(jì)15％和30％之間的干物質(zhì)，優(yōu)選調(diào)節(jié)至20％和30％之間的干物質(zhì)。生物質(zhì)的熱透化然后在50℃和150℃之間，優(yōu)選在100℃和150℃之間的溫度下進(jìn)行熱處理，持續(xù)時(shí)間在10秒和5分鐘之間，優(yōu)選持續(xù)時(shí)間在10秒和1分鐘之間。這一處理使能允許細(xì)胞內(nèi)組分?jǐn)U散進(jìn)反應(yīng)介質(zhì)。最后，在這些步驟結(jié)束時(shí)，允許溫度冷卻至0℃和10℃之間的最終溫度，優(yōu)選冷卻至4℃的級(jí)別的溫度。不希望受具體理論束縛，本申請(qǐng)人公司認(rèn)為，在這些操作條件下進(jìn)行的熱處理可以因此充當(dāng)細(xì)胞膜弱化方法，該方法允許自發(fā)釋放細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的可溶性組分，或甚至釋放細(xì)胞外基質(zhì)。除了離子物質(zhì)，有機(jī)物質(zhì)，例如糖(主要是DP1和DP2)，肽和多肽也從細(xì)胞排出。相反地，脂質(zhì)和疏水有機(jī)化合物保留在細(xì)胞中，由此清晰地證明，細(xì)胞被透化并且并未被溶化或破壞。因此，根據(jù)本發(fā)明所述的方法并未導(dǎo)致乳液形成，而是的確形成水性懸浮液。所有這些可溶性物質(zhì)通過透化膜的釋放類似于滲析型的自由擴(kuò)散的過程。因此，滯后時(shí)間是必需的，以允許在透化膜的熱處理后充分的擴(kuò)散。在文獻(xiàn)中，用于酵母細(xì)胞膜的脈沖場(chǎng)透化的方法(目的是從其提取蛋白)需要從4h至6h(日內(nèi)瓦(Ganeva)等人，2003，(AnalyticalBiochemistry)，315，77-84)。根據(jù)本發(fā)明，使用在10秒和5分鐘之間的遠(yuǎn)遠(yuǎn)更短的反應(yīng)時(shí)間。然后通過固液分離技術(shù)，通過正面或切向過濾、通過絮凝、通過離心或通過另外為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任一方式消除殘余生物質(zhì)，由此使能容易地回收已經(jīng)從其中去除微藻細(xì)胞的可溶性部分。在用于消除生物質(zhì)的此步驟之前，可能對(duì)透化的細(xì)胞進(jìn)行稀釋，以便提高此固液分離步驟的產(chǎn)率和質(zhì)量。所得可溶性部分最后基本上由蛋白(50％-80％w/w)和糖(5％-15％w/w)組成。膜分離用于回收可溶性蛋白的常規(guī)方法一般基于用三氯乙酸(10％重量/體積)或用硫酸銨沉淀所述蛋白的步驟。然而，通過沉淀發(fā)生的這些分離是非常破壞性的細(xì)胞破裂方法(通常是通過超聲處理或勻漿)的結(jié)果，盡管這些可能事實(shí)上增加提取率，尤其是生成變性的低溶解度蛋白。然后能僅借助通過化學(xué)手段(用氫氧化鈉裂解)、物理手段(高溫處理)或酶手段(蛋白水解酶)的其水解產(chǎn)物(至肽)，設(shè)想其重新功能化。恰恰相反，根據(jù)本發(fā)明所述的方法使可能釋放完整天然肽和多肽，其所有功能性仍可以表達(dá)。本發(fā)明的方法接下來導(dǎo)致通過膜分級(jí)來分離感興趣的蛋白。因此本申請(qǐng)人公司推薦分兩個(gè)步驟進(jìn)行該方法：-任選地，將以此方式獲得的可溶性部分通過微孔過濾進(jìn)行回收和澄清，以便從中除去殘余不溶性物質(zhì)，-在具有小于5kDa，優(yōu)選在1kDa和5kDa之間的截止閾值的膜上對(duì)該可溶性部分(澄清的或未澄清的，取決于是否分別進(jìn)行了前述回收和澄清的步驟)進(jìn)行超濾，以便獲得可溶性分離蛋白。利用這些通路使可能純化其殘留的鹽和糖的可溶性肽和多肽。由此獲得可溶性蛋白的分離物，其具有按重量計(jì)大于90％的蛋白含量。從以下實(shí)例將更清楚地理解本發(fā)明，所述實(shí)例旨在是說明性的，并且是非限制性的。具體實(shí)施方式實(shí)例1：通過分批補(bǔ)料發(fā)酵進(jìn)行原殼小球藻的生產(chǎn)使用的藻種是原殼小球藻UTEX250。預(yù)培養(yǎng)：-在一個(gè)2l錐形瓶中的500ml的培養(yǎng)基；-該培養(yǎng)基的組成(以g/l計(jì))：表1孵育在以下條件下進(jìn)行：持續(xù)時(shí)間：72h；溫度：28℃；攪動(dòng)：110rpm(伊孚森莫特頓(InforsMultitron)孵育器)。然后將預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到30l賽多利斯(Sartorius)型發(fā)酵罐中。用于生物質(zhì)生產(chǎn)的培養(yǎng)：該培養(yǎng)基如下：表2在接種后將發(fā)酵罐的初始體積(Vi)調(diào)節(jié)至17L。達(dá)到大約20l-25l的最終體積。用于進(jìn)行發(fā)酵的參數(shù)如下：表3溫度28℃pH5.0-5.2，使用28％w/wNH3pO220％±5％(通過攪動(dòng)來維持)攪動(dòng)最小300rpm氣流速率15l/min當(dāng)殘余葡萄糖濃度下降至低于10g/l時(shí)，則引入處于在大約800g/l的濃縮溶液形式的葡萄糖，以維持發(fā)酵罐中的葡萄糖含量在0與20g/l之間。結(jié)果在40h時(shí)獲得包含52％的蛋白的80g/l的生物質(zhì)。實(shí)例2.原殼小球藻生物質(zhì)的熱透化和可溶性部分的回收根據(jù)實(shí)例1獲得的生物質(zhì)經(jīng)歷：-離心并且洗滌，以達(dá)到220g/l的干物質(zhì)含量并且達(dá)到多于90％的純度(用生物質(zhì)的干物質(zhì)與總干物質(zhì)的比率定義純度)，然后-通過UHT在135℃下大約十秒進(jìn)行熱處理。以此方式獲得的“部分溶解的”生物質(zhì)具有50％的肽和蛋白質(zhì)(表示為總氨基酸)，20％糖和15％脂質(zhì)的級(jí)別，對(duì)應(yīng)于相對(duì)于總初始生物質(zhì)，20％和50％之間的增溶度。然后通過離心分離，從可溶性部分將其分離。因此，“原始”水溶性物質(zhì)包含60％和75％之間的肽和蛋白(表示為總氨基酸，其中90％精氨酸和谷氨酸)，10％和25％之間的糖和小于1％的脂質(zhì)。在離心沉淀中，“耗盡的”的生物質(zhì)仍具有20％和35％之間的肽和蛋白(表示為總氨基酸)，25％至35％糖和最重要的在20％至25％之間的脂質(zhì)。然后將具有5％的干物質(zhì)含量和60％和75％之間的滴度的肽和蛋白(表示為總氨基酸)的微孔過濾滲透物“P1”在具有<5kDa截止閾值的膜上進(jìn)行超濾。以此方式獲得的超濾滲余物“R2”具有10％(5％至20％)干物質(zhì)，并且包含90％以上具有大于或等于5kDa的分子量的肽。具有小于3％的干物質(zhì)含量的滲透物“P2”，包含具有小于5kDa的分子量的肽和具有小于或等于2的DP的寡糖。然后尤其可以在反滲透膜(具有93％的NaCl排斥程度)上過濾這一滲透物“P2”，以獲得：O具有10％以上干物質(zhì)的滲余物“R3”，包含具有小于5kDa的分子量的肽和DP2的寡糖，例如蔗糖；O具有0.1％干物質(zhì)的滲透物“R3”，包含DP1的寡糖、鹽、游離氨基酸和有機(jī)酸。然后將分離蛋白“R2”：-用氫氧化鉀中和至pH7，-通過蒸發(fā)濃縮至35％干物質(zhì)(DM)，-進(jìn)行巴氏滅菌并-霧化。當(dāng)前第1頁1 2 3