本發(fā)明通常涉及包含一個或多個熱不穩(wěn)定的部分的化合物，包含所述化合物的組合物，制備所述化合物和組合物的方法以及使用所述化合物和組合物的方法。
發(fā)明背景
可以在溫和條件下被去除的分子部分對于寬范圍的化合物的合成和作用是重要的。因此，科學(xué)家已經(jīng)進行了針對此類化合物的發(fā)現(xiàn)和使用的大量研究，包括針對復(fù)雜的合成方法中使用的保護基團的工作。
例如，標(biāo)題為“作為核苷-氨基保護基團的5-戊烯?；糠?、4-戊烯?；?受保護的核苷酸合成子及相關(guān)寡核苷酸合成”的USP5,614,622，在1997年3月25日公布。專利的討論的發(fā)明據(jù)稱涉及下述：“本發(fā)明提供合成寡核苷酸的新方法，其允許在比現(xiàn)有方法更溫和的條件下進行寡核苷酸的脫保護。本發(fā)明還提供了核苷堿基保護基團以及具有此類堿基保護基團的核苷合成子，所述核苷堿基保護基團在寡核苷酸合成條件下是穩(wěn)定的，但其可以在比現(xiàn)有保護基團更溫和的條件下被去除?！闭f明書摘要。
另一實例，標(biāo)題為“熱不穩(wěn)定的磷保護基團、相關(guān)中間體及使用方法”的USP 6,762,298，在2004年7月13日公布。專利的討論的發(fā)明據(jù)稱涉及下述：“本發(fā)明提供熱脫保護寡核苷酸的核苷間磷鍵合的方法，所述方法包括在基本中性pH下，在流體介質(zhì)中加熱受保護的寡核苷酸，以便使寡核苷酸脫保護。本發(fā)明還提供了使用上述熱脫保護方法合成寡核苷酸的方法，以及并入根據(jù)本發(fā)明使用的熱不穩(wěn)定保護基團的新的寡核苷酸和中間體?！闭f明書摘要。
另一實例，標(biāo)題為“熱不穩(wěn)定的羥基保護基團及使用方法”的USP 7,355,037，在2008年4月8日公布。專利的討論的發(fā)明據(jù)稱涉及下述：“提供了式R--O—Pg的羥基-受保護的醇，其中Pg為下式的保護基團：
其中Y、Z、W、R1、R1a、R2、R2a、R3、R3a、R4、R4a、a、b、c、d、e和f在本文進行定義，以及R為核苷基、具有2至約300個核苷的寡核苷酸基或者具有2至約300個核苷的寡聚物。還提供了脫保護方法，其包括在從羥基-受保護的醇有效熱裂解羥基-保護基團的溫度下，加熱所述羥基-受保護的醇。“說明書摘要。
另一實例，標(biāo)題為“熱引發(fā)核酸擴增的化學(xué)修飾的核苷5'-三磷酸”的USP 8,133,669，在2012年3月13日公布。專利的討論的發(fā)明據(jù)稱涉及下述：“本文提供了用于核酸復(fù)制的方法和組合物。這些方法涉及在核酸復(fù)制反應(yīng)中使用3'-取代的核苷5'-三磷酸或3'-取代的終止引物。在某些方面，該方法通過使用在核酸復(fù)制中提供實用性的3'-取代的NTP和/或3'-取代的終止引物來實現(xiàn)。在優(yōu)選的實施方案中，用特定的熱不穩(wěn)定的化學(xué)基團，如醚、酯或碳酸酯取代NTP和/或引物的3'-位。”說明書摘要。
盡管已經(jīng)對可以在溫和條件下去除的分子部分進行了研究，但本領(lǐng)域仍需要新的分子部分以及相關(guān)的組合物和方法。
發(fā)明概述
在一方面，本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)XO-CH2-SM-B-A的化合物。取代基X為H、酸不穩(wěn)定的保護基團、固體載體、-P(O-R1)NR2R3、-P(O)(OH)H、-P(O)(OR1)H、-P(O)(OH)2、-P(O)(OH)O-P(O)(OH)OP(O)(OH)2或它們的鹽。取代基R1為CNE、烷基或雜烷基，以及R2和R3獨立地為烷基。取代基SM為不是天然呋喃糖基的糖部分或其類似物，B為堿基部分或其類似物，以及A為與結(jié)構(gòu)–C(O)OR4的堿基部分之上或之內(nèi)的氮連接的部分，其中R4為叔烷基。
附圖簡述
圖1為用于合成聚合物(例如，DNA寡聚物)的儀器的示意圖。
發(fā)明詳述
本發(fā)明通常涉及包含一個或多個熱不穩(wěn)定的保護基團的化合物，包含所述化合物的組合物，制備所述化合物和組合物的方法以及使用所述化合物和組合物的方法。
“連接物”通常為使用親電或親核官能團在兩端終止的烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基。此類官能團的非限制性實例包括：-C(O)-、-C(O)N(H)-、-C(O)N(R21)-、-C(O)O-、-N(R22)-、-O-、-S-，其中R21和R22獨立地為烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。連接物的非限制性實例包括：-C(O)CH2OC6H5OCH2C(O)-；-C(O)-(CH2)n-C(O)，其中n為0、1、2、3、4或5；-C(O)-(CH2)n-N(H)-，其中n為1、2、3、4或5；-C(O)-(CH2)n-O-，其中n為1、2、3、4或5；以及-N(H)-(CH2)n-N(H)-，其中n為1、2、3、4或5。
“標(biāo)簽”為能夠被檢測(例如，光學(xué)地、電子地、磁力地和化學(xué)地)的部分。標(biāo)簽類別的非限制性實例包括：熒光染料；熒光淬滅分子；用于金屬配位的螯合劑；膜溶性劑(例如，膽固醇)；嵌入劑(例如，吖啶)；DNA小溝結(jié)合劑；以及疊氮化物和炔烴(例如，點擊化學(xué))。
熒光染料類型的非限制性實例包括：吖啶染料；花菁染料(例如，SYBR green)；熒光酮染料(例如，熒光素)；噁嗪染料(例如，尼羅藍、尼羅紅)；菲啶染料；和羅丹明染料(例如，德克薩斯紅(Texas Red))。熒光染料的非限制性實例包括：FAM；TET；Alexa Fluor 488；CAL Fluor Gold 540；HEX；CAL Fluor Orange 560；Quasar 470；5-TAMRA；CA L Fluor Red 590；Cy3；T(Rox)；CAL Fluor Red 610；CAL Fluor Red 635；T(JOE)；Cy5；Quasar 670；Quasar 705。
熒光淬滅分子的非限制性實例包括：BHQ-1；BHQ-2；DABCYL；Pulsar 650。
“固體載體”為固相聚合物合成中使用的材料。通常，將單體與固體載體直接地或通過連接物共價結(jié)合，以及通過隨后添加其它單體使聚合物鏈在該固體載體上生長。寡核苷酸合成在非膨潤性或低膨潤性的固體載體上進行地最好。寡核苷酸合成最常用的固體載體為可控孔度玻璃(CPG)和聚苯乙烯(例如，多孔的聚苯乙烯)。
“含磷部分”為包含至少一個磷原子的化學(xué)基團。含磷部分的非限制性實例包括：-P(OR23)NR24R25；-P(＝O)(OR23)NR24R25；-P(OH)2；-P(OR23)OH；-P(O)(OR23)OH；-P(O)(OH)2；-P(O)(OH)OP(O)(OH)2；-P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2；-P(S)(OH)2；以及前述化合物的鹽。R23為烷基(例如，-CH3)、取代的烷基(例如，-CH2CH2-EWG，其中“EWG”為吸電子基團，如-CN或-Ph-NO2)、雜烷基、取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基。R24和R25獨立地為烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基；或組合以形成環(huán)狀、稠合、稠合環(huán)狀或雜環(huán)狀環(huán)。
對于磷試劑的討論，參見：Beaucage,S.L.；Caruthers M.H.(1981)."Deoxynucleoside phosphoramidites—A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis".Tetrahedron Letters 22:1859–1862；Lin,K.-Y.,Matteucci,M.D.(1998)."A cytosine analog capable of clamp-like binding to a guanine in helical nucleic acids".J.Amer.Chem.Soc.120(33):8531–8532；Nielsen,J.；Marugg,J.E.；Taagaard,M.；Van Boom,J.H.；Dahl,O.(1986)."Polymer-supported synthesis of deoxyoligonucleotides using in situ prepared deoxynucleoside2-cyanoethyl phosphoramidites".Rec.Trav.Chim.Pays-Bas 105(1):33–34；Nielsen,J.；Taagaard,M.；Marugg,J.E.；Van Boom,J.H.；Dahl,O.(1986)."Application of 2-cyanoethyl N,N,N',N'-tetraisopropylphosphorodiamidite for in situ preparation of deoxyribonucleoside phosphoramidites and their use in polymer-supported synthesis of oligodeoxyribonucleotides".Nucl.Acids Res.14(18):7391–7403；Nielsen,J.；Marugg,J.E.；Van Boom,J.H.；Honnens,J.；Taagaard,M.；Dahl,O.(1986)."Thermal instability of some alkyl phosphorodiamidites".J.Chem Res.Synopses(1):26–27；Nielsen,J.；Dahl,O.(1987)."Improved synthesis of 2-cyanoethyl N,N,N',N'-tetraisopropylphosphorodiamidite(iPr2N)2POCH2CH2CN)".Nucl.Acids Res.15(8):3626；Beaucage,S.L.(2001)."2-Cyanoethyl Tetraisopropylphosphorodiamidite".e-EROS Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis；Sinha,N.D.；Biernat,J.；Koester,H.(1983)."β-Cyanoethyl N,N-dialkylamino/N-morpholinomonochloro phosphoamidites,new phosphitylating agents facilitating ease of deprotection and work-up of synthesized oligonucleotides".Tetrahedron Lett.24(52):5843–5846；Marugg,J.E.；Burik,A.；Tromp,M.；Van der Marel,G.A.；Van Boom,J.H.(1986)."A new and versatile approach to the preparation of valuable deoxynucleoside 3'-phosphite intermediates".Tetrahedron Lett.24(20):2271–22274；Guzaev,A.P.；Manoharan,M.(2001)."2-Benzamidoethyl group-a novel type of phosphate protecting group for oligonucleotide synthesis".J.Amer.Chem.Soc.123(5):783–793；Sproat,B.；Colonna,F.；Mullah,B.；Tsou,D.；Andrus,A.；Hampel,A.；Vinayak,R.(1995年2月)."An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides".Nucleosides&Nucleotides 14(1&2):255–273；Stutz,A.；Hobartner,C.；Pitsch,S.(2000年9月)."Novel fluoride-labile nucleobase-protecting groups for the synthesis of3'(2')-O-amino-acylated RNA sequences".Helv.Chim.Acta 83(9):2477–2503；Welz,R.；Muller,S.(2002年1月)."5-(Benzylmercapto)-1H-tetrazole as activator for 2'-O-TBDMS phosphoramidite building blocks in RNA synthesis".Tetrahedron Letters43(5):795–797；Vargeese,C.；Carter,J.；Yegge,J.；Krivjansky,S.；Settle,A.；Kropp,E.；Peterson,K.；Pieken,W.(1998).Nucl.Acids Res.26(4):1046–1050；Gacs-Baitz,E.；Sipos,F.；Egyed,O.；Sagi,G.(2009)."Synthesis and structural study of variously oxidized diastereomeric5'-dimethoxytrityl-thymidine-3'-O-[O-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl]-p hosphoramidite derivatives.Comparison of the effects of the P＝O,P＝S,and P＝Se functions on the NMR spectral and chromatographic properties.".Chirality 21(7):663–673；M.J.；Ogilvie,K.K.(1980)."Phosphoramidate analogs of diribonucleoside monophosphates.".Tetrahedron Lett.21(43):4153–4154；Wilk,A.；Uznanski,B.；Stec,W.J.(1991)."Assignment of absolute configuration at phosphorus in dithymidylyl(3',5')phosphormorpholidates and-phosphormorpholidothioates.".Nucleosides&Nucleotides 10(1-3):319–322。將前述參考文獻為了所有目的據(jù)此通過引用并入本文件中。
“保護基團”為在合成操作期間通常用于掩蔽反應(yīng)性官能團的化學(xué)部分。保護基團的非限制性類別包括：酸不穩(wěn)定的保護基團；堿不穩(wěn)定的保護基團；還原不穩(wěn)定的保護基團；對光不穩(wěn)定的保護基團；以及熱不穩(wěn)定的保護基團。
酸不穩(wěn)定的保護基團的非限制性實例包括：三苯甲基；單甲氧基三苯甲基；4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)；β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)；甲氧基甲基醚(MOM)；甲硫基甲基醚；四氫吡喃基(THP)；4-甲氧基四氫吡喃-4-基；四氫呋喃基(THF)；叔丁氧基羰基(Boc)；硅醚(例如，三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三異丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)。硅醚也為氟化物離子不穩(wěn)定的。
堿不穩(wěn)定的保護基團的非限制性實例包括：苯甲?；推渌蓟人狨?鹽)衍生物；乙?；推渌榛人狨?鹽)衍生物；烷基-或芳基氧基乙酸酯(鹽)；三鹵代乙酸酯(鹽)；二鹵代乙酸酯(鹽)；酰氧基甲基醚；芴基甲基氧基羰基(FMOC)；氰乙基；取代的烷基，如–CH2CH2-EWG，其中“EWG”為吸電子基團，如–PhNO2或–C(O)-；氰乙基氧基羰基。還原不穩(wěn)定的保護基團的非限制性實例包括：芐基和取代的類似物；芐氧基羰基(Z)；烯丙氧基羰基。對光不穩(wěn)定的保護基團的非限制性實例包括：鄰硝基芐基醚和取代的衍生物；鄰硝基芐基氨基甲酸酯。熱不穩(wěn)定的保護基團的非限制性實例包括：叔丁氧基乙基醚(羥基)；4-氧代烷基酯；3-?；被?；4-羧基丙基酯的酰胺和酯；5-烷硫基烷基酯。
“烷基”為具有通式CnH2n+1的化學(xué)部分。烷基通常為下述類別：低級烷基；高級烷基；環(huán)烷基；以及支鏈烷基。低級烷基具有6個或更少的碳原子。非限制性實例包括：甲基；乙基；丙基；丁基；和戊基。高級烷基具有7個或更多個碳原子。非限制性實例包括：庚基；辛基；壬基。環(huán)烷基為形成環(huán)結(jié)構(gòu)的烷基，并且為式CnH2n-1。非限制性實例包括：環(huán)丙基；環(huán)丁基；環(huán)戊基；和環(huán)己基。支鏈烷基為其中一個或多個氫原子被烷基取代的烷基鏈(即，直鏈的)。非限制性實例包括：異丙基；仲丁基；和叔丁基。
“雜烷基”為其中一個或多個碳原子被雜原子(例如，O、S、NH)替換的烷基。非限制性實例包括：-CH2OCH3；-CH2CH2OCH3；-NC4H8O(嗎啉代)。
“取代的烷基”為其中一個或多個氫原子被官能團替換的烷基。官能團的非限制性實例包括下述：其中R26、R27和R28獨立地為烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基：-OH；-SH；-NH2；-OCH3；-OCH2CH3；-SCH3；-NHR26；-NR27R28；-NO2；-CN；-CO2H；-C(O)OR29；-OC(O)OR29；-C(O)NH2；-C(O)NHR26；-C(O)NR26R27；-OC(O)NHR26；-OC(O)NR26R27；-NHC(O)NHR26；-NHC(O)NR26R27，其中R26、R27、R28和R29獨立地為烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；-F；-Cl；-Br；-I；-Ar，其中“Ar”為芳基；-Ar-X，其中“Ar-X”為取代的芳基；-HAr，其中“-HAr”為雜芳基；以及-HAr-X，其中“-HAr-X”為取代的雜芳基。
“取代的雜烷基”為其中一個或多個氫原子被官能團替換的雜烷基，其中R30、R31、R32和R33獨立地為烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基：-OH；-SH；-NH2；-OCH3；-OCH2CH3；-SCH3；-NHR30；-NR31R32；-NO2；-CN；-CO2H；-C(O)OR33；-OC(O)OR33；-C(O)NH2；-C(O)NHR30；-C(O)NR31R32；-OC(O)NHR31；-OC(O)NR31R32；-NHC(O)NHR31；-NHC(O)NR31R32；-F；-Cl；-Br；-I。
“芳基”為以下結(jié)構(gòu)：
“取代的芳基”為以下結(jié)構(gòu)：
其中R34、R35、R36、R37和R38獨立地選自H、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基；-OH；-SH；-NH2；-OCH3；-OCH2CH3；-SCH3；-NHR39；-NR40R41；-NO2；-CN；-CO2H；-C(O)OR42；-OC(O)OR42；-C(O)NH2；-C(O)NHR39；-C(O)NR40R41；-OC(O)NHR39；-OC(O)NR40R41；-NHC(O)NHR39；-NHC(O)NR40R41；-F；-Cl；-Br；-I；其中R39、R40、R41和R42獨立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基；條件是R34、R35、R36、R37和R38中的至少一個不是H。
“雜芳基”為芳香族雜環(huán)。雜芳基的非限制性實例包括：
其中R39選自烷基、取代的烷基、芳基和取代的芳基。
“取代的雜芳基”為具有一個或多個選自以下的取代基的雜芳基：H、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基；-OH；-SH；-NH2；-OCH3；-OCH2CH3；-SCH3；-NHR43；-NR44R45；-NO2；-CN；-CO2H；-C(O)OR46；-OC(O)OR46；-C(O)NH2；-C(O)NHR43；-C(O)NR44R45；-OC(O)NHR43；-OC(O)NR44R45；-NHC(O)NHR43；-NHC(O)NR44R45；-F；-Cl；-Br；-I；其中R43、R44、R45和R46獨立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基。
本發(fā)明的化合物為結(jié)構(gòu)XO-CH2-SM-B-A。取代基“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽。“SM”為糖部分或糖部分的類似物?！癇”為核堿基部分或核堿基部分的類似物?！癆”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基。
對于核苷合成的討論，參見：Vorbrüggen,H.；Ruh-Polenz,C.Org.React.2000,55,1；Diekmann,E.；Friedrich,K.；Fritz,H.-G.J.Prakt.Chem.1993,335,415；Fischer,E.；Helferich,B.Chem.Ber.1914,47,210；Miyaki,M.；Shimizu,B.Chem.Pharm.Bull.1970,18,1446；Kazimierczuk,Z.；Cottam,H.B.；Revankar,G.R.；Robins,R.K.J.Am.Chem.Soc.1984,106,6379；Wittenburg,E.Z.Chem.1964,4,303；Choi,W-B.；Wilson,L.J.；Yeola,S.；Liotta,D.C.；Schinazi,R.F.J.Am.Chem.Soc.1991,113,9377；Vorbrüggen,H.；Niedballa,U.；Krolikiewicz,K.；Bennua,B.；G.In Chemistry and Biology of Nucleosides and Nucleotides；Harmon,R.E.,Robins,R.K.,Townsend,L.B.,Eds.；Academic:New York,1978；p.251；Prystas,M.；F.Collect.Czech.Chem.Commun.1964,29,121；Niedballa,U.；Vorbrüggen,H.J.Org.Chem.1974,39,3668；Itoh,T.；Melik-Ohanjanian,R.G.；Ishikawa,I.；Kawahara,N.；Mizuno,Y.；Honma,Y.；Hozumi,M.；Ogura,H.Chem.Pharm.Bull.1989,37,3184；Vorbrüggen,H.；Bennua,B.Tetrahedron Lett.1978,1339；Vorbrüggen,H.；Bennua,B.Chem.Ber.1981,114,1279；Sugiura,Y.；Furuya,S.；Furukawa,Y.Chem.Pharm.Bull.1988,36,3253；Kawasaki,A.M.；Wotring,L.L.；Townsend,L.B.J.Med.Chem.1990,33,3170；Nair,V.；Purdy,D.F.Heterocycles 1993,36,421；Hanrahan,J.R.；Hutchinson,D.W.J.Biotechnol.1992,23,193；Martin,O.R.Tetrahedron Lett.1985,26,2055；Langer,S.H.；Connell,S.；Wender,I.J.Org.Chem.1958,23,50；Patil,V.D.；Wise,D.S.；Townsend,L.B.J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1 1980,1853；Vorbrüggen,H.；Krolikiewicz,K.；Bennua,B.Chem.Ber.1981,114,1234。將前述參考文獻為了所有目的據(jù)此通過引用并入本文件中。
糖部分通常為戊呋喃糖基部分。此類部分的非限制性實例包括(其中，顯示了化合物的XOCH2-、B和A)：
其中上文結(jié)構(gòu)1和結(jié)構(gòu)2的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基；以及Z為H、OH或OR3，其中R3為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
糖部分的類似物通常為天然呋喃糖基部分的似物。
此類部分的非限制性實例包括：
其中上文結(jié)構(gòu)3和結(jié)構(gòu)4的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基；以及Z為H、OH或OR3，其中R3為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中上文結(jié)構(gòu)5和結(jié)構(gòu)6的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基；以及Z為H、OH或OR3，其中R3為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)7和結(jié)構(gòu)8的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基；以及Z為H、OH或OR3，其中R3為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中上文結(jié)構(gòu)9和結(jié)構(gòu)10的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；以及Z為H、OH或OR3，其中R3為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中上文結(jié)構(gòu)11和結(jié)構(gòu)12的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1,其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基；以及Z為H、OH或OR3，其中R3為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)13和結(jié)構(gòu)14的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基；以及Z為H、OH或OR3，其中R3為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)15和結(jié)構(gòu)16的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基；以及Z為H、OH或OR3，其中R3為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)17和結(jié)構(gòu)18的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基；以及R4和R5獨立地為H、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)19和結(jié)構(gòu)20的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；以及Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)21和結(jié)構(gòu)22的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；以及Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)23和結(jié)構(gòu)24的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；以及Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)25和結(jié)構(gòu)26的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；以及Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)27和結(jié)構(gòu)28的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；以及Z為H、OH或OR3，其中R3為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)29和結(jié)構(gòu)30的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；以及Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)31和結(jié)構(gòu)32的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；以及Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)31和結(jié)構(gòu)32的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；以及Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)33和結(jié)構(gòu)34的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基；“R6”為烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基；“m”和“o”獨立地為0、1或2。
其中結(jié)構(gòu)35和結(jié)構(gòu)36的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基；“R6”為烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)37和結(jié)構(gòu)38的取代基為：“X”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；“X1”為H、保護基團、在氧與固體載體之間任選地包含連接物的固體載體、含磷部分或它們的鹽；Y為OH或OR2，其中R2為保護基團、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基；“R6”為烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。
其中結(jié)構(gòu)39的取代基為：“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；R7為H、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基、取代的芳基或保護基團；R8為OH、鹵化物、OR9、NR10R11，其中R9為烷基、取代的烷基、芳基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基，以及其中R10和R11獨立地為H、烷基、取代的烷基、芳基、雜烷基、取代的雜烷基、芳基或取代的芳基。
核堿基部分的非限制性實例包括：
其中上文結(jié)構(gòu)40和結(jié)構(gòu)41中的取代基“A”為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
其中上文結(jié)構(gòu)42和結(jié)構(gòu)43中的取代基“A”為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
其中上文結(jié)構(gòu)44和結(jié)構(gòu)45中的取代基“A”為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
其中上文結(jié)構(gòu)46和結(jié)構(gòu)47中的取代基“A”為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
核堿基類似物部分的非限制性實例包括：
其中“A”為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；其中“M”為N或CR13，其中R13為H、鹵素、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15獨立地為H或烷基；以及其中R12為H、鹵素、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15獨立地為H或烷基。
其中上文結(jié)構(gòu)50和結(jié)構(gòu)51中的取代基為：“A”為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；其中“M”為N或CR13，其中R13為H、鹵素、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15獨立地為H或烷基；以及其中R12為H、鹵素、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15獨立地為H或烷基。
其中上文結(jié)構(gòu)52和結(jié)構(gòu)53中的取代基為：“A”為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；以及其中R12為H、鹵素、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15獨立地為H或烷基。
其中上文結(jié)構(gòu)54和結(jié)構(gòu)55中的取代基為：“A”為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；以及其中R12為H、鹵素、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15獨立地為H或烷基。
其中上文結(jié)構(gòu)56和結(jié)構(gòu)57的取代基為：“A”為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；以及其中“M”、“D”和“E”獨立地為N或CR13，其中R13為H、鹵素、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15獨立地為H或烷基。
其中結(jié)構(gòu)58和結(jié)構(gòu)59中的取代基為：“A”為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；以及其中“M”、“D”和“E”獨立地為N或CR13，其中R13為H、鹵素、烷基、取代的烷基、雜烷基、取代的雜烷基、苯基、取代的苯基、烯基、炔基、OH、SH或NR14R15，其中R14和R15獨立地為H或烷基。
對于核苷類似物的討論，參見：Merino,P.(編輯)(2013)Chemical Synthesis of Nucleotide Analogues,Pedro Marino,Wiley Publishers；USP 7,427,672；Prakash,T等人.J.Med.Chem.2010,53,1636-1650。將前述參考文獻為了所有目的據(jù)此通過引用并入本文件中。
部分“A”為結(jié)構(gòu)–C(O)R1，其中R1為叔烷基。叔烷基為其中碳原子與三個基團(即，-CR16R17R18)共價結(jié)合的叔烷基，其中R16、R17和R18獨立地選自烷基、取代的烷基、雜烷基和取代的雜烷基。通常，取代基R16、R17和R18以與中心碳原子直接結(jié)合的CH2或CH3(例如，-C(CH3)2(CH2CH3)終止。叔烷基的非限制性實例包括：-C(CH3)3；-C(CH3)2(CH2CH3)；-C(CH3)(CH2CH3)(CH2CH2CH3)；-C(R19)(R20)-連接物-標(biāo)簽；和-C(R19)(R20)-連接物-[固體載體]，其中R19和R20獨立地選自–CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3和CH(CH3)2。
–C(R19)(R20)-連接物-標(biāo)簽的非限制性實例包括：
其中上文結(jié)構(gòu)60中的取代基為：R19和R20獨立地選自–CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3和CH(CH3)2。
其中上文結(jié)構(gòu)61中的取代基為：R19和R20獨立地選自–CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3和CH(CH3)2。
其中上文結(jié)構(gòu)62中的取代基為：R19和R20獨立地選自–CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3和CH(CH3)2。
其中上文結(jié)構(gòu)63中的取代基為：R19和R20獨立地選自–CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3和CH(CH3)2。
-C(R19)(R20)-連接物-[固體載體]的非限制性實例包括：
其中上文結(jié)構(gòu)64和結(jié)構(gòu)65中的取代基為：R19和R20獨立地選自–CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3和CH(CH3)2；CPG為可控孔度玻璃；以及PS為聚苯乙烯。
在一個實例中，當(dāng)SM為以下結(jié)構(gòu)時，
其中上文結(jié)構(gòu)66的取代基為：Y為–OP(O-CNE)ONR51R52或–OP(O)(OH)H或它們的鹽，其中R51和R52獨立地選自烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，或者R51和R52一起形成雜環(huán)(例如，吡咯烷)，則X為酸不穩(wěn)定的保護基團或固體載體，Z為H或OR53，以及R53為羥基保護基團。
在另一實例中，當(dāng)SM為以下結(jié)構(gòu)時，
其中上文結(jié)構(gòu)67的取代基為：X為–P(O-CNE)(NR51R52)或–P(O)(OR53)H或它們的鹽，其中R51和R52獨立地選自烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，或者R51和R52一起形成雜環(huán)(例如，吡咯烷)，以及其中R53為烷基、取代的烷基、芳基或取代的烷基，則Y為酸不穩(wěn)定的羥基保護基團或固體載體，以及Z為H。
在另一實例中，當(dāng)SM為以下結(jié)構(gòu)時
其中上文結(jié)構(gòu)68的取代基為：X為–P(O)(OR53)H或–P(O)(OH)O[P(O)(O-)(O-)]nH或它們的鹽，其中R53為烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，其中n＝0、1或2，則Y為OH或OR54，其中R54為熱不穩(wěn)定的羥基保護基團，以及Z為H、-OH或OR54。
本發(fā)明的化合物的非限制性實例包括下述：
其中上文結(jié)構(gòu)69和結(jié)構(gòu)70的取代基為：“X”為–P(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2或它們的鹽，以及其中“Z”為-H或–OH。
其中上文結(jié)構(gòu)71和72的取代基為：“X”為–P(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2或它們的鹽，以及其中“Z”為-H或–OH。
其中上文結(jié)構(gòu)73和結(jié)構(gòu)74的取代基為：“X”為–P(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2或它們的鹽，以及其中“Z”為-H或–OH。
其中上文結(jié)構(gòu)75和結(jié)構(gòu)76的取代基為：“X”為–P(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)2、-P(O)(OH)OP(O)(OH)OP(O)(OH)2或它們的鹽，以及其中“Z”為-H或–OH。
本發(fā)明還涉及寡核苷酸及其鹽，其包括結(jié)構(gòu)–O-CH2-SM(-O-)B-A的一個或多個核苷酸或核苷酸類似物，其中“SM”為糖部分或糖部分的類似物；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，其中R60為叔烷基。
對于寡核苷酸合成的討論，參見：Ellington,A.和Pollard,J.D.2001.Introduction to the Synthesis and Purification of Oligonucleotides.Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry.00:A.3C.1–A.3C.22；Beaucage,S.L.和Reese,C.B.2009.Recent Advances in the Chemical Synthesis of RNA.Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry.38:2.16.1–2.16.31；Tsukamoto,M.和Hayakawa,Y.2005.“Strategies useful for the Chemical Synthesis of Oligonucleotides and Related Compounds.”Frontiers in Organic Chemistry,Bentham Science Publishers,第1卷。將前述參考文獻為了所有目的據(jù)此通過引用并入本文件中。
在一個方面，寡核苷酸為下述結(jié)構(gòu)：
其中上文結(jié)構(gòu)77的取代基為：PL1和PL2獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及Nu1和Nu2獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物，或寡核苷酸；“SM”為糖部分或糖部分的類似物；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，其中R60為叔烷基。
在另一方面，寡核苷酸為下述結(jié)構(gòu)(或它們的鹽)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)78和結(jié)構(gòu)79的取代基為：PL1和PL2獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及Nu1和Nu2獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物、或寡核苷酸；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR1，其中R1為叔烷基。
在另一方面，寡核苷酸為下述結(jié)構(gòu)(或它們的鹽)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)80和結(jié)構(gòu)81的取代基為：PL1和PL2獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及Nu1和Nu2獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物、或寡核苷酸(或它們的鹽)；
其中上文結(jié)構(gòu)82和結(jié)構(gòu)83的取代基為：PL1和PL2獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及Nu1和Nu2獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物、或寡核苷酸(或它們的鹽)；
其中上文結(jié)構(gòu)84和結(jié)構(gòu)85的取代基為：PL1和PL2獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及Nu1和Nu2獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物、或寡核苷酸(或它們的鹽)；
其中上文結(jié)構(gòu)86的取代基為：PL1和PL2獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及Nu1和Nu2獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物、或寡核苷酸(或它們的鹽)；
其中上文結(jié)構(gòu)87和結(jié)構(gòu)88的取代基為：PL1和PL2獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及Nu1和Nu2獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物、或寡核苷酸(或它們的鹽)。
其中上文結(jié)構(gòu)89和結(jié)構(gòu)90的取代基為：PL1和PL2獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及Nu1和Nu2獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物、或寡核苷酸(或它們的鹽)。
其中上文結(jié)構(gòu)91和結(jié)構(gòu)92的取代基為：PL1和PL2獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及Nu1和Nu2獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物、或寡核苷酸(或它們的鹽)。
其中上文結(jié)構(gòu)93的取代基為：PL1和PL2獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及Nu1和Nu2獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物、或寡核苷酸(或它們的鹽)。
在另一方面，寡核苷酸包含上文所示結(jié)構(gòu)的兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、或六個或更多個核苷酸或核苷酸類似物。
本發(fā)明還涉及某些治療性核苷酸、核苷酸類似物、核苷和核苷類似物。治療性核苷酸、核苷酸類似物、核苷或核苷類似物為可以被用于治療疾病(例如，HCV)的治療性核苷酸、核苷酸類似物、核苷或核苷類似物，其中化合物包含核苷酸、核苷酸類似物、核苷或核苷類似物以及一個或多個熱不穩(wěn)定的保護基團，其中熱不穩(wěn)定的保護基團中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
對于治療性核苷酸、核苷酸類似物、核苷和核苷類似物的討論，參見：Lars Petter Jordheim等人Nature Reviews Drug Discovery,447-464(2013)；Squires,K.Antivir.Ther.2001；6Suppl 3:1-14；USP 8,664,386；USP 8,658,617；USP 8,642,756；USP 8,633,309；USP 8,629,263；USP 8,618,076；USP 8,580,765；USP 8,569,478；USP 8,563,530；USP 8,551,973。將前述參考文獻為了所有目的據(jù)此通過引用并入本文件中。
在一個方面，治療性核苷酸、核苷酸類似物、核苷或核苷類似物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)94和結(jié)構(gòu)95的取代基為：A1、A2和A3獨立地為H或熱不穩(wěn)定的保護基團，以及其中熱不穩(wěn)定的保護基團中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)96和結(jié)構(gòu)97的取代基為：A1、A2和A3獨立地為H或熱不穩(wěn)定的保護基團，以及其中熱不穩(wěn)定的保護基團中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)98和結(jié)構(gòu)99的取代基為：A1、A2和A3獨立地為H或熱不穩(wěn)定的保護基團，以及其中熱不穩(wěn)定的保護基團中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)100和結(jié)構(gòu)101的取代基為：A1和A3獨立地為H或熱不穩(wěn)定的保護基團，以及其中熱不穩(wěn)定的保護基團中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)102和結(jié)構(gòu)103的取代基為：A1、A2和A3獨立地為H或熱不穩(wěn)定的保護基團，以及其中熱不穩(wěn)定的保護基團中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)104和結(jié)構(gòu)105的取代基為：A1、A2和A3獨立地為H或熱不穩(wěn)定的保護基團，以及其中熱不穩(wěn)定的保護基團中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)106和結(jié)構(gòu)107的取代基為：A3為H或熱不穩(wěn)定的保護基團，以及其中熱不穩(wěn)定的保護基團中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)108和結(jié)構(gòu)109的取代基為：A1、A2和A3獨立地為H或熱不穩(wěn)定的保護基團，以及其中熱不穩(wěn)定的保護基團中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及B為核堿基或核堿基類似物。
在另一方面，治療性核苷酸、核苷酸類似物、核苷或核苷類似物為下述結(jié)構(gòu)之一：
本發(fā)明還涉及治療性寡核苷酸(或它們的鹽)。治療性寡核苷酸為可以被用于治療疾病(例如，CMV)的治療性寡核苷酸，其中化合物包含含有一個或多個熱不穩(wěn)定的保護基團的寡核苷酸(例如，福米韋生(Fomivirsen)、米泊美生(Mipomersen))。熱不穩(wěn)定的保護基團中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
治療性寡核苷酸通常為下述結(jié)構(gòu)(或它們的鹽)：
其中上文結(jié)構(gòu)116的取代基為：PL1和PL2獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及Nu1和Nu2獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物、或寡核苷酸(或它們的鹽)。“SM“為糖部分或糖部分的類似物；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物；“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，其中R60為叔烷基。
對于治療性寡核苷酸的討論，參見：Yogesh S.Sanghvi Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,4.1.1-4.1.22,2011年9月；Goodchild,J.Methods Mol.Biol.2011；764:1-15；USP 8,697,675。將前述參考文獻為了所有目的通過引用并入本文件中。
在另一方面，本發(fā)明涉及寡核苷酸-標(biāo)簽綴合物(或它們的鹽)。寡核苷酸-標(biāo)簽綴合物包含下述結(jié)構(gòu)中的一種或多種核苷酸或核苷酸類似物：
其中上文結(jié)構(gòu)117的取代基為：L1和L2獨立地為H、核苷酸、核苷酸類似物和標(biāo)簽，其中可以有將所述標(biāo)簽與其在核苷酸或核苷酸類似物之上的位置進行連接的連接基團；L3為H、-C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)或標(biāo)簽，其中可以有將所述標(biāo)簽與其在核苷酸或核苷酸類似物之上的位置進行連接的連接基團。如果標(biāo)簽不是L1、L2或L3，則其與寡核苷酸的另一核苷酸連接。“SM”為糖部分或糖部分的類似物；“B”為核堿基部分或核堿基部分的類似物。
對于寡核苷酸-標(biāo)簽綴合物的討論，參見USP 5,583,236；USP 8,530,634；Durrant,Ian等人.Methods in Molecular Biology,第31卷(1994),163-175。將前述參考文獻為了所有目的據(jù)此通過引用并入本文件中。
在另一方面，本發(fā)明涉及合成寡核苷酸(或它們的鹽)的方法。所述方法包括下述步驟：
1)將化合物與固體載體直接地或通過連接物偶聯(lián)，其中所述化合物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)118和結(jié)構(gòu)119的取代基為：“P1”為保護基團(例如，DMT)，“SM”為糖部分或糖部分的類似物，“B”為核堿基或核堿基類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)以提供下述結(jié)構(gòu)之一的固體載體化合物：
其中上文結(jié)構(gòu)120和結(jié)構(gòu)121的取代基為：L1為連接物或無化學(xué)實體，以及S1為固體載體；“P1”為保護基團(例如，DMT)，“B”為核堿基或核堿基類似物，“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
2)使固體載體化合物脫保護以提供下述結(jié)構(gòu)之一的脫保護的化合物：
其中上文結(jié)構(gòu)122和結(jié)構(gòu)123的取代基為：L1為連接物或無化學(xué)實體，以及S1為固體載體；“B”為核堿基或核堿基類似物，“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
3)使脫保護的化合物與包含含磷原子的部分的化合物反應(yīng)，其中所述化合物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)124和結(jié)構(gòu)125的取代基為：“PM”為含磷部分，“P1”為保護基團(例如，DMT)；“B”為核堿基或核堿基類似物；“SM”為糖部分或糖部分的類似物；以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，
以提供下述結(jié)構(gòu)之一的二核苷酸；
其中上文結(jié)構(gòu)126和結(jié)構(gòu)127的取代基為：“PM*”為反應(yīng)之后的含磷部分，L1為連接物或無化學(xué)實體，S1為固體載體，“P1”為保護基團(例如，DMT)，“B”為核堿基或核堿基類似物，“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
4)任選地，化學(xué)修飾含磷部分以提供下述結(jié)構(gòu)之一的修飾的二聚體：
其中上文結(jié)構(gòu)128和結(jié)構(gòu)129的取代基為：“PM**”為化學(xué)修飾的含磷部分，L1為連接物或無化學(xué)實體，S1為固體載體，“P1”為保護基團(例如，DMT)，“B”為核堿基或核堿基類似物，“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或-C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
5)任選地，脫保護二聚體或修飾的二聚體以提供下述結(jié)構(gòu)之一的脫保護的二聚體或修飾的二聚體：
其中上述結(jié)構(gòu)130、結(jié)構(gòu)131、結(jié)構(gòu)132和結(jié)構(gòu)133的取代基為：“PM*”為用以提供二聚體的反應(yīng)之后的含磷部分，“PM**”為化學(xué)修飾的含磷部分，L1為連接物或無化學(xué)實體，S1為固體載體，“B”為核堿基或核堿基類似物，“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
6)任選地，重復(fù)步驟“3”和“4”以提供下述結(jié)構(gòu)之一的寡聚物或修飾的寡聚物：
其中上文結(jié)構(gòu)134、結(jié)構(gòu)135、結(jié)構(gòu)136和結(jié)構(gòu)137的取代基為：“P1”為保護基團(例如，DMT)，“PM*”為用以提供寡聚物的反應(yīng)之后的含磷部分，“PM**”為化學(xué)修飾的含磷部分，“L1”為連接物或無化學(xué)實體，“S1”為固體載體，“B”為核堿基或核堿基類似物，“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60。其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；“n”為1至200(例如，1至25、1至50、1至75、1至100等)的整數(shù)；
7)使二聚體、修飾的二聚體、寡核苷酸或修飾的寡核苷酸脫保護，將其從固體載體去除，以及化學(xué)修飾PM*或PM**部分以提供下述結(jié)構(gòu)的化合物：
其中上文結(jié)構(gòu)138的取代基為：“Q”為O或S，以及其中“n”為1至200(例如，1至25、1至50、1至75、1至100等)的整數(shù)，其中至少一個“A1”為–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，“B”為核堿基或核堿基類似物，以及“SM”為糖部分或糖部分的類似物。
在一個實例中，上述方法的步驟“1”中的與固體載體偶聯(lián)的化合物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)139和結(jié)構(gòu)140的取代基為：“P1”為保護基團(例如，DMT)，“B”為核堿基或核堿基類似物，以及“A1”為–H或–C(O)OR4，其中R4為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)。
在另一實例中，上述方法的步驟“1”中的與固體載體偶聯(lián)的化合物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)139和結(jié)構(gòu)140的取代基為：“P1”為保護基團(例如，DMT)，以及“A1”為–H或–C(O)OR4，其中R4為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；或，
其中上文結(jié)構(gòu)141和結(jié)構(gòu)142的取代基為：“P1”為保護基團(例如，DMT)，以及“A1”為–H或–C(O)OR4，其中R4為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)。
在一個實例中，上述方法的步驟“2”中的脫保護的結(jié)構(gòu)為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)143和結(jié)構(gòu)144的取代基為：“B”為核堿基或核堿基類似物，“A1”為–H或–C(O)OR4，其中R4為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1為連接物或無化學(xué)實體，以及S1為固體載體。
在一個實例中，上述方法的步驟“2”中的脫保護的結(jié)構(gòu)為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)145和結(jié)構(gòu)146的取代基為：“P1”為保護基團(例如，DMT)，“A1”為–H或–C(O)OR4，其中R4為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體；或
其中上文結(jié)構(gòu)147和結(jié)構(gòu)148的取代基為：“P1”為保護基團(例如，DMT)，“A1”為–H或–C(O)OR4，其中R4為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體。
在一個實例中，上述方法的步驟“3”中的包含含磷原子的部分的化合物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)149和結(jié)構(gòu)150的取代基為：“P1”為保護基團(例如，DMT)，其中“A1”為–H或–C(O)OR4，其中R4為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，其中“B”為核堿基或核堿基類似物，以及“PM”為選自下述部分之一的含磷部分：
其中上文結(jié)構(gòu)151、結(jié)構(gòu)152、結(jié)構(gòu)153、結(jié)構(gòu)154和結(jié)構(gòu)155的取代基為：“P2”和“P3”獨立地為保護基團(例如，Bn、-CH2CH2SC(O)Ph)，以及其中“EWG”為吸電子基團(例如，-CN、-NO2)，以及其中R61和R62為烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基，或者和與磷原子結(jié)合的氮原子一起形成雜環(huán)(例如，吡咯烷、哌啶)。
在一個實例中，上述方法的步驟“5”中的脫保護的、修飾的二聚體為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中“A1”為-H或-C(O)OR4，以及其中R4為叔烷基(例如-C(O)OC(CH3)3)，以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物，以及其中“PM**”為例如選自下述部分之一的含磷部分：-P(O)(O-)；-P(S)(O-)；-P(O)(-CH2CH2-EWG)-；-P(S)(-CH2CH2-EWG)-，其中L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體。
在一個實例中，上述方法的步驟“7”中的寡聚物為下述結(jié)構(gòu)：
其中上文結(jié)構(gòu)158的取代基為：“A1”為–H或–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物，以及其中“Q”為O或S。
在另一方面，本發(fā)明涉及合成寡核苷酸(或它們的鹽)的方法。所述方法包括下述步驟：
1)將化合物與固體載體直接地或通過連接物偶聯(lián)，其中所述化合物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)159和結(jié)構(gòu)160的取代基為：“P1”和“P2”獨立地為保護基團，“B”為核堿基或核堿基類似物，以及“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)以提供下述結(jié)構(gòu)之一的固體載體結(jié)合的化合物：
其中上文結(jié)構(gòu)161和結(jié)構(gòu)162的取代基為：“P1”和“P2”獨立地為保護基團，“B”為核堿基或核堿基類似物，以及“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體；
2)使固體載體結(jié)合的化合物脫保護以提供下述結(jié)構(gòu)之一的脫保護的化合物：
其中上文結(jié)構(gòu)163和結(jié)構(gòu)164的取代基為：“P2”為保護基團，“B”為核堿基或核堿基類似物，“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體；
3)使脫保護的化合物與包含含磷原子的部分的化合物反應(yīng)，其中所述化合物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)165和結(jié)構(gòu)166的取代基為：“P1”和“P2”獨立地為保護基團，“B”為核堿基或核堿基類似物，以及“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體，“PM”為含磷部分，以提供下述結(jié)構(gòu)之一的二核苷酸：
其中上文結(jié)構(gòu)167和結(jié)構(gòu)168的取代基為：“P1”和“P2”獨立地為保護基團，“B”為核堿基或核堿基類似物，以及“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體，“PM*”為反應(yīng)之后的含磷部分；
4)任選地，化學(xué)修飾含磷部分以提供下述結(jié)構(gòu)之一的修飾的二聚體：
其中上文結(jié)構(gòu)169和結(jié)構(gòu)170的取代基為：“P1”和“P2”獨立地為保護基團，“B”為核堿基或核堿基類似物，以及“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體，“PM**”為化學(xué)修飾的含磷部分；
5)任選地，使二聚體或修飾的二聚體脫保護以提供下述結(jié)構(gòu)之一的脫保護的二聚體或修飾的二聚體：
其中上文結(jié)構(gòu)171、結(jié)構(gòu)172、結(jié)構(gòu)173和結(jié)構(gòu)174的取代基為：“P2”為保護基團，“B”為核堿基或核堿基類似物，以及“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體，“PM*”為偶聯(lián)反應(yīng)之后的含磷部分，“PM**”為化學(xué)修飾的含磷部分；
6)任選地重復(fù)步驟“3”和“4”以提供下述結(jié)構(gòu)之一的寡聚物或修飾的寡聚物：
其中上文結(jié)構(gòu)175、結(jié)構(gòu)176、結(jié)構(gòu)177和結(jié)構(gòu)178的取代基為：“P1”和“P2”獨立地為保護基團，“B”為核堿基或核堿基類似物，以及“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及“A1”為H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體，“PM*”為偶聯(lián)反應(yīng)之后的含磷部分，“PM**”為化學(xué)修飾的含磷部分，“n”為1至200(例如，1至25、1至50、1至75等)的整數(shù)；
7)使二聚體、修飾的二聚體、寡核苷酸或修飾的寡核苷酸脫保護，將其從固體載體去除，以及化學(xué)修飾“PM*”或“PM**”部分以提供下述結(jié)構(gòu)的化合物：
其中“n”為1至200(例如，1至25、1至50、1至75等)的整數(shù)，以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物，以及其中“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及其中至少一個“A1”為–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以及其中“Q”為O或S。
在一個實例中，上述方法的步驟“1”中的與固體載體偶聯(lián)的化合物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)180和結(jié)構(gòu)181的取代基為：“P1”和“P2”獨立地為保護基團，“B”為核堿基或核堿基類似物，以及“A1”為–H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)。
在另一實例中，上述方法的步驟“1”中的與固體載體偶聯(lián)的化合物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)182和結(jié)構(gòu)183的取代基為：“P1“和”P2“獨立地為保護基團，以及”A1“為–H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；或，
其中上文結(jié)構(gòu)184和結(jié)構(gòu)185的取代基為：“P1”和“P2”獨立地為保護基團，以及“A1”為–H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；或，
其中上文結(jié)構(gòu)186和結(jié)構(gòu)187的取代基為：“P1”和“P2”獨立地為保護基團，以及“A1”為–H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；或，
其中上文結(jié)構(gòu)188的取代基為：“P1”和“P2”獨立地為保護基團，以及“A1”為–H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)。
在一個實例中，上述方法的步驟“2”中的脫保護的結(jié)構(gòu)為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)189和結(jié)構(gòu)190的取代基為：“P2”為保護基團，以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物，以及其中“A1”為–H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1為連接物或無化學(xué)實體，以及S1為固體載體。
在一個實例中，上述方法的步驟“2”中的脫保護的結(jié)構(gòu)為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)191和結(jié)構(gòu)192的取代基為：“P2”為保護基團，以及其中“A1”為–H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體；或
其中上文結(jié)構(gòu)193和結(jié)構(gòu)194的取代基為：“P2”為保護基團，以及其中“A1”為–H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體；或
其中上文結(jié)構(gòu)195和結(jié)構(gòu)196的取代基為：“P2”為保護基團，以及其中“A1”為–H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體；或
其中上文結(jié)構(gòu)197的取代基為：“P2”為保護基團，以及其中“A1”為–H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中L1為連接物或無化學(xué)部分，以及S1為固體載體。
在一個實例中，上述方法的步驟“3”中的包含含磷原子的部分的化合物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)198和結(jié)構(gòu)199的取代基為：“P1”和“P2”獨立地為保護基團，以及其中“A1”為–H或–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物，以及其中“PM”為選自下述部分的含磷部分：
其中上文結(jié)構(gòu)200、結(jié)構(gòu)201、結(jié)構(gòu)202、結(jié)構(gòu)203和結(jié)構(gòu)204的取代基為：“P3”和“P4”獨立地為保護基團(例如，Bn、-CH2CH2SC(O)Ph)，以及其中“EWG”為吸電子基團(例如，-CN、-PhNO2)，以及其中R70和R71為烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基或和與磷原子結(jié)合的氮原子一起形成雜環(huán)(例如，吡咯烷、哌啶)。
在一個實例中，上述方法的步驟“5”中的脫保護的、修飾的二聚體為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)205和結(jié)構(gòu)206的取代基為：“P2”為保護基團，以及其中“A1”為–H或–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物，以及其中“PM**”為例如，選自下述部分之一的含磷部分：-P(O)(O-)；-P(S)(O-)；-P(O)(-CH2CH2-EWG)-；-P(S)(-CH2CH2-EWG)-，其中“EWG”為吸電子基團(例如，-CN、-NO2)。
在一個實例中，上述方法的步驟“7”中的寡聚物為下述結(jié)構(gòu)：
其中上文結(jié)構(gòu)207的取代基為：“A1”為–H或–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)，以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物，以及其中“Q”為O或S。
在另一方面，本發(fā)明涉及使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增DNA的方法。該方法涉及使用一種或多種在核堿基的環(huán)結(jié)構(gòu)之上或之內(nèi)的氮原子之上具有至少一個熱不穩(wěn)定的保護基團的三磷酸脫氧核苷酸，其中所述保護基團為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
對于PCR的討論，參見：USP 8,133,669；USP 4,683,195；USP 4,683,202；USP4,800,159；USP 4,965,188；USP 5,008,182；USP 5,176,995；USP 6,040,166；USP 6,197,563。將前述參考文獻為了所有目的據(jù)此通過引用并入本文件中。
在另一方面，本發(fā)明涉及使用PCR擴增DNA的方法，其中所述方法包括下述步驟：
1)提供包含靶DNA(即，待擴增的DNA)、DNA聚合酶、引物和三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)的反應(yīng)混合物，其中所述dNTP中的一種或多種為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)208和結(jié)構(gòu)209的取代基為：“TP”為三磷酸酯，“A1”為–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
其中上文結(jié)構(gòu)210和結(jié)構(gòu)211的取代基為：“TP”為三磷酸酯，“A1”為–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
其中上文結(jié)構(gòu)212和結(jié)構(gòu)213的取代基為：“TP”為三磷酸酯，“A1”為–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
其中上文結(jié)構(gòu)214的取代基為：“TP”為三磷酸酯，“A1”為–C(O)OR60，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；
2)將反應(yīng)混合物加熱(例如，94℃至98℃)一段時間(例如，一分鐘)以使靶DNA變性，從而提供單鏈DNA模板；
3)降低反應(yīng)混合物的反應(yīng)溫度(例如，50℃至65℃)，持續(xù)一段時間(例如，20至40秒)，這使引物退火至單鏈DNA模板以提供引物-模板復(fù)合物以及DNA聚合酶與所述引物-模板復(fù)合物的結(jié)合；
4)加熱所述反應(yīng)混合物(例如，75℃至80℃)，通過將所述dNTP添加至所述DNA模板使所述DNA聚合酶以5'至3'方向合成與所述靶DNA互補的DNA鏈；
5)將反應(yīng)混合物的溫度任選地保持在70℃至74℃以確保任何剩余的單鏈DNA的延伸。
在另一方面，本發(fā)明涉及使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增DNA的方法。該方法涉及使用一種或多種在引物的核堿基的環(huán)結(jié)構(gòu)之上或之內(nèi)的氮原子之上具有一個或多個熱不穩(wěn)定的保護基團的引物(即，靶向特定DNA序列的寡核苷酸)，其中所述保護基團為結(jié)構(gòu)–C(O)OR4，其中R4為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
在另一方面，本發(fā)明涉及使用PCR擴增DNA的方法，其中所述方法包括下述步驟：
1)提供包含靶DNA(即，待擴增的DNA)、DNA聚合酶、引物和三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)的反應(yīng)混合物，其中所述引物中的一種或多種為下述結(jié)構(gòu)：
其中上文結(jié)構(gòu)215的取代基為：“n”為1至50的整數(shù)，以及其中“B”為核堿基，以及其中“A”為H或結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，條件是至少一個“A”為熱不穩(wěn)定的保護基團；
2)將反應(yīng)混合物加熱(例如，94℃至98℃)一段時間(例如，一分鐘)以使靶DNA變性，從而提供單鏈DNA模板；
3)降低反應(yīng)混合物的反應(yīng)溫度(例如，50℃至65℃)，持續(xù)一段時間(例如，20至40秒)，這使引物退火至單鏈DNA模板以提供引物-模板復(fù)合物以及DNA聚合酶與所述引物-模板復(fù)合物的結(jié)合；
4)加熱所述反應(yīng)混合物(例如，75℃至80℃)，通過將所述dNTP添加至所述DNA模板使所述DNA聚合酶以5'至3'方向合成與所述靶DNA互補的DNA鏈；
5)將反應(yīng)混合物的溫度任選地保持在70℃至74℃以確保任何剩余的單鏈DNA的延伸。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備三磷酸核苷或三磷酸核苷類似物的方法，其中所述三磷酸核苷或三磷酸核苷類似物包含至少一個熱不穩(wěn)定的保護基團。所述方法包括以下步驟：
1)向包含核苷或核苷類似物的反應(yīng)混合物中添加單磷試劑，以及任選地縮合劑(例如，羰基二咪唑)，其中類似物為下述結(jié)構(gòu)：
其中上文結(jié)構(gòu)216的取代基為：Y為OP1，其中P1為保護基團或-H，Z為H或OP2，其中P2為保護基團或-H，B為核堿基或核堿基類似物，以及A為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，以提供下述結(jié)構(gòu)的單磷酸化中間體：
其中上文結(jié)構(gòu)217的取代基為：Y為OP1，其中P1為保護基團，Z為H或OP2，其中P2為保護基團，B為核堿基或核堿基類似物，以及A為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，“PM”為包含單個磷原子的部分；
2)將多磷試劑添加至磷酸化中間體以提供下述結(jié)構(gòu)的多磷酸化中間體：
其中上文結(jié)構(gòu)218的取代基為：Y為OP1，其中P1為保護基團，Z為H或OP2，其中P2為保護基團，B為核堿基或核堿基類似物，以及A為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)，“PP”為包含多個磷原子的部分；
3)水解所述多磷酸化中間體以及去除P1以提供下述結(jié)構(gòu)的三磷酸核苷或三磷酸核苷類似物：
其中上文結(jié)構(gòu)219的取代基為：Y為OP1，其中P1為保護基團，Z為H或OP2，其中P2為保護基團，B為核堿基或核堿基類似物，以及A為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
在一個實例中，上述方法的步驟“1”中的使用的單磷試劑選自下述：POCl3；以及，
在一個實例中，上述方法的步驟“1”中的核苷或核苷類似物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)221和結(jié)構(gòu)222的取代基為：P1為保護基團，以及A為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；
其中上文結(jié)構(gòu)223和結(jié)構(gòu)224的取代基為：P1為保護基團，以及A為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；
其中上文結(jié)構(gòu)225和結(jié)構(gòu)226的取代基為：P1為保護基團，以及A為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；
其中上文結(jié)構(gòu)227的取代基為：P1為保護基團，以及A為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
在一個實例中，上述方法的步驟“2”中的多磷試劑為下述結(jié)構(gòu)之一：(n-Bu3NH)2H2P2O7；和P2O74-。
在一個實例中，上述方法的步驟“2”中的多磷酸化中間體為下述結(jié)構(gòu)：
其中上文結(jié)構(gòu)228的取代基為：P1為保護基團，B為核堿基或核堿基類似物，以及A1為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
在一個實例中，上述方法的三磷酸核苷為下述之一：
其中上文結(jié)構(gòu)229、結(jié)構(gòu)230、結(jié)構(gòu)231和結(jié)構(gòu)232的取代基為：A1為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
對于三磷酸酯合成的討論，參見：Gregor S.Cremosnik,Alexandre Hofer和Henning J.Jessen Angew.Chem.Int.Ed.,2014,53,286；Malwina Strenkowska,Przemyslaw Wanat,Marcin Ziemniak,Jacek Jemielity和Joanna Kowalska Org.Lett.,2012,14,4782；Tobias Santner,Vanessa Siegmund,Andreas Marx和Ronald Micura Bioorganic&Medicinal Chemistry,2012,20,2416；Julianne Caton-Williams,Bilal Fiaz,Rudiona Hoxhaj,Matthew Smith和Zhen Huang Sci.China Chem.,2012,55,80；Gregor S.Cremosnik,Alexandre Hofer和Henning J.Jessen Angew.Chem.,2014,126,290；Qi Sun,Shanshan Gong,Jian Sun,Si Liu,Qiang Xiao和Shouzhi Pu J.Org.Chem.,2013,78,8417；Julianne Caton-Williams,Matthew Smith,Nicolas Carrasco和Zhen Huang Org.Lett.,2011,13,4156；Julianne caton-Williams,Lina Lin,Matthew Smith和Zhen Huang Chem Commun.,2011,47,8142-8144。將前述參考文獻為了所有目的據(jù)此通過引用并入本文件中。
在另一方面，本發(fā)明涉及治療疾病的方法，其中所述方法包括下述步驟：
1)向有需要的患者施用治療量的化合物，其中所述化合物包含核苷酸、核苷酸類似物、核苷或核苷類似物以及一個或多個熱不穩(wěn)定的保護基團，其中熱不穩(wěn)定的保護基團中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR8，以及其中R8為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；
2)將能量施加于所述患者的一個或多個區(qū)域，導(dǎo)致一個或多個區(qū)域的溫度增加以及所述核苷酸、核苷酸類似物、核苷或核苷類似物的隨后的熱脫保護；
從而治療所述疾病。
對于某些熱不穩(wěn)定的保護基團的討論，參見：Chmielewski,M.等人,New J.Chem.,2012,36,603-12.USP 8,133,669；USP 7,355,037；USP 6,762,298。將前述參考文獻為了所有目的據(jù)此通過引用并入本文件中。
在一個實例中，治療性化合物為下述結(jié)構(gòu)之一：
其中上文結(jié)構(gòu)233和結(jié)構(gòu)234的取代基為：“A1”、“A2”和“A3”獨立地為–H或熱不穩(wěn)定的保護基團，條件是A1、A2或A3中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)235和結(jié)構(gòu)236的取代基為：“A1”、“A2”和“A3”獨立地為–H或熱不穩(wěn)定的保護基團，條件是A1、A2或A3中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)237和結(jié)構(gòu)238的取代基為：“A1”、“A2”和“A3”獨立地為–H或熱不穩(wěn)定的保護基團，條件是A1、A2或A3中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)239和結(jié)構(gòu)240的取代基為：“A1”、“A2”和“A3”獨立地為–H或熱不穩(wěn)定的保護基團，條件是A1、A2或A3中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)241和結(jié)構(gòu)242的取代基為：“A1”、“A2”和“A3”獨立地為–H或熱不穩(wěn)定的保護基團，條件是A1、A2或A3中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)243和結(jié)構(gòu)244的取代基為：“A1”、“A2”和“A3”獨立地為–H或熱不穩(wěn)定的保護基團，條件是A1、A2或A3中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR4的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R4為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)245和結(jié)構(gòu)246的取代基為：“A3”為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物；
其中上文結(jié)構(gòu)247和結(jié)構(gòu)248的取代基為：“A1”、“A2”和“A3”獨立地為–H或熱不穩(wěn)定的保護基團，條件是A1、A2或A3中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的熱不穩(wěn)定的保護基團，其中R60為叔烷基(例如，-C(O)OC(CH3)3)；以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物；
在一個實例中，使用下述方法中的一種或多種，將熱能施加于患者的一個或多個區(qū)域：微波相控陣(microwave phased array)或單次涂布器高熱療法(single applicator hyperthermia)，如USP 6,725,095、USP 6,807,446和USP 6,768,925中所討論的，將其為了所有目的通過引用并入本文件中。
在另一方面，本發(fā)明涉及治療疾病的方法，其中所述方法包括下述步驟：
1)向有需要的患者施用治療量的化合物，其中所述化合物包含寡核苷酸(或其鹽)以及一個或多個熱不穩(wěn)定的保護基團，其中熱不穩(wěn)定的保護基團中的至少一個為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，以及其中R60為叔烷基(例如，-C(CH3)3)；
2)將能量施加于所述患者的一個或多個區(qū)域，導(dǎo)致一個或多個區(qū)域的溫度增加以及寡核苷酸的隨后的熱脫保護；
從而治療疾病。
在一個實例中，治療性化合物為與結(jié)構(gòu)–C(O)OR8的一個或多個熱不穩(wěn)定的保護基團連接的福米韋生或米泊美生，其中R8為叔烷基(例如，-C(CH3)3)。
在一個實例中，使用下述方法中的一個或多個，將熱能施加于患者的一個或多個區(qū)域：微波相控陣或單次涂布器高熱療法，如USP 6,725,095、USP 6,807,446和USP 6,768,925中所討論，將其為了所有目的通過引用并入本文件中。
本發(fā)明還涉及使核苷、核苷類似物、核苷酸和核苷酸類似物脫保護的方法。受保護的化合物為結(jié)構(gòu)：XO-SM-B-A。取代基“X”為H、保護基團、固體載體、含磷部分或它們的鹽?！癝M”為糖部分或糖部分的類似物?！癇”為堿基部分的類似物的堿基部分。“A”為一個或多個連接于堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，其中R60為叔烷基。
脫保護方法包括在存在溶劑(例如，水)下加熱化合物。在某些實例中，溶劑的pH為6.0至9.0–例如，6.5至7.5、6.75至7.25、6.90至7.10，或大約7.0。在其它實例中，溶劑的pH大于7.0–例如，7.0至10.0、7.0至9.0或7.0至8.0。將化合物加熱到90℃至100℃的溫度范圍。通常，其范圍為91℃至99℃、92℃至97℃、93℃至95℃。在某些實例中，溫度為94℃。將溫度保持小于1小時的時段。通常，將其保持小于45分鐘或30分鐘。在某些實例中，將其保持小于20分鐘。
脫保護方法導(dǎo)致去除超過90％的–C(O)OR1保護基團。通常，其導(dǎo)致去除超過92.5％或95％的保護基團。在某些實例中，其導(dǎo)致去除超過97.5％或99％的保護基團。
脫保護方法還導(dǎo)致低于5％的化合物的降解。通常，其導(dǎo)致低于4％或3％的化合物的降解。在某些實例中，其導(dǎo)致低于2％或1％的化合物的降解。
在另一方法中，在存在溶劑下通過使用微波技術(shù)使化合物XO-SM-B-A脫保護。參見，例如，Culf等人,Oligonucleotides 18:81-92(2008)，和Kumar等人,Nucleic Acids Research,1997,第25卷,第24期,第5127-5129頁，將兩者通過引用并入本文件中。溶劑的pH通常大于6.0或者等于或大于7.0–例如，7.0至7.5、7.5至8.0、8.0至8.5、8.5至9.0。微波溫度中的溶劑的溫度通常低于55℃–例如，低于50℃、低于45℃、低于40℃、低于35℃或低于30℃。在某些實例中，氨或胺包括在脫保護的反應(yīng)混合物中。
胺的非限制性實例包括單烷基胺，如甲胺、乙胺、丙胺、乙醇胺；和二烷基胺，如二甲胺、二乙胺；以及其它胺，如DBU。在某些實例中，脫保護步驟耗費小于30分鐘完成超過90％。通常，脫保護步驟耗費小于25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘或5分鐘完成超過90％。
在另一方法中，在不存在溶劑下將化合物XO-SM-B-A脫保護。將化合物加熱至90℃至100℃的溫度范圍。通常，其范圍為91℃至97℃、92℃至96℃、93℃至95℃。在某些實例中，溫度為94℃。
將溫度保持小于1小時的時段。通常，將其保持小于45分鐘或30分鐘。在某些實例中，將其保持小于20分鐘。
無溶劑脫保護方法導(dǎo)致去除超過90％的–C(O)OR1保護基團。通常，其導(dǎo)致去除超過92.5％或95％的保護基團。在某些實例中，其導(dǎo)致去除超過97.5％或99％的保護基團。
無溶劑脫保護方法還導(dǎo)致低于5％的化合物的降解。通常，其導(dǎo)致低于4％或3％的化合物的降解。在某些實例中，其導(dǎo)致低于2％或1％的化合物的降解。
本發(fā)明還涉及使寡核苷酸或寡核苷酸類似物脫保護的方法。受保護的化合物為以下結(jié)構(gòu)：
其中上文結(jié)構(gòu)255的取代基為：“PL1”和“PL2”獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及其中“Nu1”和“Nu2”獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物、或寡核苷酸(或它們的鹽)，以及其中“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物，“A”為一個或多個連接于核堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，其中R60為叔烷基。
寡核苷酸、或寡核苷酸類似物脫保護方法包括在存在溶劑(例如，水)下加熱化合物。在某些實例中，溶劑的pH為6.0至9.0–例如，6.5至7.5、6.75至7.25、6.90至7.10或大約7.0。在其它實例中，溶劑的pH大于7.0–例如，7.0至10.0、7.0至9.0或7.0至8.0。將化合物加熱到90℃至100℃的溫度范圍。通常，其范圍為91℃至99℃、92℃至97℃、93℃至95℃。在某些實例中，溫度為94℃。在某些實例中，溫度為94℃。將溫度保持小于1小時的時段。通常，將其保持小于45分鐘或30分鐘。在某些實例中，將其保持小于20分鐘。
脫保護方法導(dǎo)致去除超過90％的寡核苷酸/類似物–C(O)OR1保護基團。通常，其導(dǎo)致去除超過92.5％或95％的保護基團。在某些實例中，其導(dǎo)致去除超過97.5％或99％的保護基團。
脫保護方法還導(dǎo)致低于5％的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的降解。通常，其導(dǎo)致低于4％或3％的化合物的降解。在某些實例中，其導(dǎo)致低于2％或1％的化合物的降解。
在另一方法中，在存在溶劑下通過使用微波技術(shù)，使包含結(jié)構(gòu)–C(O)OR60的保護基團的寡核苷酸脫保護，其中R60為叔烷基(例如，C(CH3)3)。參見，例如，Culf等人,Oligonucleotides 18:81-92(2008)，和Kumar等人,Nucleic Acids Research,1997,第25卷,第24期,第5127-5129頁，將兩者通過引用并入本文件中。溶劑的pH通常大于6.0或者等于或大于7.0–例如，7.0至7.5、7.5至8.0、8.0至8.5、8.5至9.0。微波溫度中的溶劑的溫度通常低于55℃–例如，低于50℃、低于45℃、低于40℃、低于35℃或低于30℃。在某些實例中，氨或胺包括在脫保護的反應(yīng)混合物中。
胺的非限制性實例包括單烷基胺，如甲胺、乙胺、丙胺、乙醇胺；和二烷基胺，如二甲胺、二乙胺；以及其它胺，如DBU。在某些實例中，脫保護步驟耗費小于30分鐘完成超過90％。通常，脫保護步驟耗費小于25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘或5分鐘完成超過90％。
在另一方法中，在不存在溶劑下，使以下化合物脫保護：
其中上文結(jié)構(gòu)256的取代基為：“PL1”和“PL2”獨立地為H或-P(O)(OH)O-或它們的類似物，以及其中“Nu1”和“Nu2”獨立地為沒有取代基、核苷或核苷類似物或寡核苷酸，以及其中“SM”為糖部分或糖部分的類似物，以及其中“B”為核堿基或核堿基類似物，“A”為一個或多個連接于核堿基部分之上或之內(nèi)的一個或多個氮原子的部分，以及為結(jié)構(gòu)–C(O)OR60，其中R60為叔烷基。將化合物加熱至90℃至100℃的溫度范圍。通常，其范圍為91℃至97℃、92℃至96℃、93℃至95℃。在某些實例中，溫度為94℃。將溫度保持小于1小時的時段。通常，將其保持小于45分鐘或30分鐘。在某些實例中，將其保持小于20分鐘。
寡核苷酸或類似物的無溶劑脫保護方法導(dǎo)致去除超過90％的–C(O)OR1保護基團。通常，其導(dǎo)致去除超過92.5％或95％的保護基團。在某些實例中，其導(dǎo)致去除超過97.5％或99％的保護基團。
無溶劑脫保護方法還導(dǎo)致低于5％的寡核苷酸或寡核苷酸類似物的降解。通常，其導(dǎo)致低于4％或3％的化合物的降解。在某些實例中，其導(dǎo)致低于2％或1％的化合物的降解。
本發(fā)明還涉及用于聚合物(例如，DNA寡核苷酸)合成的儀器。對于DNA合成儀的討論，參見：USP 5,368,823；USP 5,472,672；USP 5,529,756；USP 5,837,858。將前述參考文獻為了所有目的據(jù)此通過引用并入本文件中。
本發(fā)明的儀器通常包括含有用于合成主題聚合物的化合物的一個或多個儲器，其中儲器可操作地連接于允許各種試劑(例如，在液體介質(zhì)中)流向合成室(例如，包含固體載體的塔)的系統(tǒng)中。在儀器中存在誘導(dǎo)試劑流向(例如，氣體壓力)合成室的機制，其中進行聚合物合成中涉及的多種化學(xué)反應(yīng)。合成室包括控制其溫度的內(nèi)部或外部裝置(例如，微波設(shè)備或加熱夾套)。合成的聚合物通過控制液體流動的閥門離開合成室。計算機控制器通常用于控制來自儲器的化合物的流動、合成室的溫度以及來自儀器的聚合物的離去。
參考圖1，計算機控制裝置控制網(wǎng)絡(luò)化通道系統(tǒng)中的氣體壓力。氣體壓力引導(dǎo)DNA寡核苷酸合成中使用的各種化合物–“核苷A，儲器1”、“核苷C，儲器2”、“核苷G、儲器3”、“核苷T，儲器4”、“洗滌”、“試劑1，儲器”、“試劑2，儲器”、“試劑3，儲器”、“試劑4，儲器”、“脫保護，試劑1”和“脫保護，試劑2”–向包含固體載體的合成塔的流動?；瘜W(xué)品引入合成塔的精確順序由計算機控制裝置決定以產(chǎn)生受保護的、固體載體結(jié)合的DNA寡聚物?？刹僮鞯剡B接合成塔的溫度控制裝置調(diào)節(jié)塔的溫度以促進或?qū)崿F(xiàn)從寡核苷酸去除一種或多種類型的保護基團；在某些實例中，溫度控制裝置還促進或?qū)崿F(xiàn)從固體載體去除寡核苷酸，以提供目標(biāo)寡核苷酸。
在某些實例中，設(shè)計合成塔及相關(guān)溫度控制器以實現(xiàn)在中性條件(即，寡核苷酸合成中使用的液體介質(zhì)的pH為大約7.0)下從寡核苷酸去除一個或多個BOC基團。這通過以下完成：將與合成塔的固體載體連接的寡核苷酸加熱至91℃至99℃的溫度(或大約94℃)，持續(xù)5分鐘至20分鐘的時段。
在其它實例中，設(shè)計合成塔及相關(guān)溫度控制器以實現(xiàn)從固體載體去除寡核苷酸。這可以在以下情況下發(fā)生：叔烷基被用于將寡核苷酸與固體載體連接的情況下，或者叔烷基為寡核苷酸與固體載體之間的連接物的一部分的情況下。隨著BOC的去除，寡聚物從固體載體的裂解在中性條件下發(fā)生，以及涉及在91℃至99℃加熱固體載體化合物，持續(xù)5分鐘至20分鐘的時段。
實驗部分
在Biosearch 8750合成儀上用Cruachem DNA amidite進行DNA合成。
如下進行陰離子交換HPLC分析：將2-20mL樣品水溶液(取決于濃度)注入Dionex陰離子交換柱(4.6x 250mm)；在20min內(nèi)，使用1:0至0:1的線性梯度用(A)0.025M TRIS HCl和0.01M TRIS，以及(B)0.025M TRIS HCl,0.01M TRIS和1.0M NaCl的緩沖液水溶液以2mL/min洗脫樣品，其中在260nm進行UV檢測。
如先前所述16處理用于堿基組成分析的樣品，其中通過反相HPLC如下進行分析：將20uL樣品水溶液注入HAISIL HL C18 5m柱(4.6x150mm)；在20min內(nèi)，使用1:0至0:1的線性梯度用(A)0.1M TEAA,5％乙腈，(B)乙腈的緩沖液以1mL/min洗脫樣品。在260nm進行UV檢測。
5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N6,N6-(二叔丁氧基羰基)脫氧腺-3’-O-N,N-二異丙基氰乙基亞磷酰胺(結(jié)構(gòu)257)
向5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N6-(苯甲?；?脫氧腺苷(50g,76mM)和咪唑(20g,0.294M)中添加700mL無水吡啶和50g(0.333M)叔丁基二甲基氯硅烷。將溶液攪拌18小時。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除吡啶，以及將殘余物溶解在700mL乙酸乙酯中。將有機相用500ml 0.5M K2HPO4洗滌，隨后用500mL飽和NaHCO3洗滌。將溶液蒸發(fā)，產(chǎn)生了62g 5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N6-(苯甲酰基)-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-脫氧腺苷產(chǎn)物。向該產(chǎn)物在900mL甲醇中的溶液添加100mL濃氨水。在短暫渦旋之后，使溶液靜置過夜。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，將固體再溶解于700mL無水吡啶和20mL TEA中，以及添加50g焦碳酸二叔丁酯。將溶液攪拌18小時。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，將殘余物溶解在500mL DCM中，以及用500mL 0.5M KH2PO4洗滌該溶液。將有機相添加至用在DMF中的2％甲醇和2％吡啶填充的二氧化硅柱，10X35cm。將至6％甲醇的梯度應(yīng)用于柱，經(jīng)10L溶劑，以及將包含純的5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N6,N6–(二叔丁氧基羰基)-脫氧腺苷的級分合并，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減。產(chǎn)量為42g(55mM，72％，來自DMT dA(Bz))。
通過添加60mL 1M TBAF于THF中以及10mL HOAc于500mL THF中的溶液去除TBDMS基團。在18小時之后，添加50mL飽和NaHCO3，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除THF。將殘余物溶解在600mL DCM中，以及用400mL飽和NaHCO3洗滌。將有機相添加至用在DCM中的2％甲醇和2％吡啶填充的二氧化硅柱，10X35cm。將至10％甲醇的梯度應(yīng)用于柱，經(jīng)14L溶劑，以及將包含純的5’-O-DMT-N6,N6–(二叔丁氧基羰基)-脫氧腺苷的級分合并，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減。產(chǎn)量為32g(42.5mM，89％，來自5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N6,N6–(二叔丁氧基羰基)-脫氧腺苷)。1H NMR(400mHz,CDCl3,PPM)8.78(s,1H),8.22(s,1H),7.3–7.6(m,9H),6.8(d,4H),6.5(t,1H),4.7(s,1H),3.8(s,6H),3.42(d,2H),2.8(m,1H),2.55(m,1H),1.46(s,18H)。
制備2-氰乙基-N,N,N’,N’-四異丙基亞磷酰二胺(15g,50mM)和1H-四唑(1g,14mM)在800mL無水乙腈中的溶液，以及在混合1min之后，將其添加至包含32g(49mM)無水5’-O-DMT-N6,N6–(二叔丁氧基羰基)-脫氧腺苷的燒瓶中。在渦旋下，緩慢地溶解核苷，持續(xù)2hr。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，以及將殘余物溶解在包含300mL飽和NaHCO3溶液的700ml EtOAc中。搖振混合物，使其分離，以及將有機相添加至用在EtOAc中的2％吡啶填充的二氧化硅柱，10X25cm。等度洗脫柱，將包含純的257的級分合并，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減至33.9g(35.6mM，84％收率，來自受保護的核苷)。31P NMR(161mHz,CDCl3,PPM):149.617,149.410。C50H64N7O10P的分析計算值:C,62.95.H,6.76.N,10.28。實測值：C,63.20.H,6.79.N,10.21。
5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N4-(叔丁氧基羰基)脫氧胞嘧啶-3’-O-N,N-二異丙基氰乙基亞磷酰胺(結(jié)構(gòu)258)
向無水5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N4-(乙?；?脫氧胞嘧啶(50g,87.4mM)中添加咪唑(20g,0.294M)、700mL無水吡啶和50g(0.333M)叔丁基二甲基氯硅烷。將溶液攪拌18小時，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除吡啶，以及將殘余物溶解在700mL乙酸乙酯中。將有機相用500ml 0.5M K2HPO4洗滌，隨后用500mL飽和NaHCO3洗滌。蒸發(fā)產(chǎn)生了56g(81mM)5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N4-(乙?；?-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-脫氧胞嘧啶。制備該產(chǎn)物在900mL甲醇中的溶液，以及向此添加100mL濃氨水。在短暫渦旋之后，使溶液靜置過夜。在干燥之后，將固體再溶解在700mL無水吡啶中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，以及進行高真空過夜。將固體再溶解在700mL無水THF中，以及添加20g無水K2CO3。在10min之后，添加50g(229mM)焦碳酸二叔丁酯。將溶液攪拌18小時。通過過濾去除K2CO3，以及添加200mL 0.5M KH2PO4。通過蒸發(fā)去除THF。將殘余物溶解在500mL DCM中，以及用500mL 0.5M KH2PO4洗滌。將有機相添加至用在DCM中的1％甲醇和1％吡啶填充的二氧化硅柱，10X35cm。在洗脫包含第一DMT的條帶之后，將至2％甲醇的梯度應(yīng)用于柱，將包含純的5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N4–(叔丁氧基羰基)-脫氧胞嘧啶的級分合并，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減。產(chǎn)量為28g(37.6mM，43％收率，來自DMT dC(Ac))。通過添加60mL 1M TBAF在THF中以及10mL HOAc在500mL THF中的溶液去除TBDMS基團。在18小時之后，添加飽和NaHCO3(50mL)，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除THF。將殘余物溶解在600mL DCM中，以及用400mL飽和NaHCO3洗滌。將有機相添加至用在DCM中的2％甲醇和2％吡啶填充的二氧化硅柱，10X35cm。將至10％甲醇的梯度應(yīng)用于柱，經(jīng)10L溶劑，將包含純的5’-O-DMT-N4–(叔丁氧基羰基)-脫氧胞嘧啶的級分合并，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減。產(chǎn)量為20g(31.7mM,84％，來自5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N4–(叔丁氧基羰基)-脫氧胞嘧啶)。1H NMR(400mHz,CDCl3,PPM):8.2(d,1H),7.3(m,9H),7.0(d,1H),6.85(d,4H),6.3(t,1H),4.5(dd,1H),4.15(dd,1H),3.8(s,6H),3.5(dd,2H),3.4(dd,1H),2.75(m,1H),2.35(m,1H),1.5(s,18H)。
制備9g(30mM)2-氰乙基-N,N,N’,N’-四異丙基亞磷酰二胺和650mg(9mM)1H-四唑在500mL無水乙腈中的溶液，以及在混合1min之后，將其添加至20g(31.7mM)無水5’-O-DMT-N4–(-叔丁氧基羰基)-脫氧胞嘧啶。在渦旋下，緩慢地溶解核苷，以及在2小時之后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。將殘余物溶解在500ml EtOAc中，以及用200mL飽和NaHCO3溶液搖振。將分離的有機相添加至用在EtOAc中的2％吡啶填充的二氧化硅柱，5X25cm。等度洗脫柱，將包含純的258的級分合并，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減至19.5g(23.5mM，74％收率，來自核苷)。31P NMR(161mHz,CDCl3,PPM):149.997,149.339。C44H56N5O9P的分析計算值：C,63.68.H,6.80.N,8.44。實測值：C,63.59.H,6.69.N,8.52。
5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N2-(叔丁氧基羰基)脫氧鳥苷-3’-O-N,N-二異丙基氰乙基亞磷酰胺(結(jié)構(gòu)259)
向無水5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N2-(異丁?；?脫氧鳥苷(100g,156mM)中添加含咪唑(40g,0.588M)的1200mL無水吡啶和100g(0.666M)叔丁基二甲基氯硅烷。將溶液攪拌18小時，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除吡啶，以及將殘余物溶解在700mL乙酸乙酯中。將有機相用500ml 0.5M K2HPO4洗滌，隨后用500mL飽和NaHCO3洗滌。干燥產(chǎn)生110g(145mM)5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N2-(異丁酰基)-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-脫氧鳥苷產(chǎn)物。制備產(chǎn)物在1500mL甲醇中的溶液，以及向此添加150mL濃氨水。在短暫渦旋之后，使溶液靜置過夜。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，將干燥的固體再溶解在1400mL THF中，以及添加40g無水K2CO3。在攪拌10min之后，添加100g焦碳酸二叔丁酯。將溶液攪拌3小時。TLC顯示部分轉(zhuǎn)化(二氧化硅，2％MeOH，2％吡啶于DCM中，原料rf：0.3，產(chǎn)物rf：0.7，用10％H2SO4和加熱進行可視化)。較長的反應(yīng)時間產(chǎn)生較少的期望產(chǎn)物和較多的副反應(yīng)材料。通過過濾去除K2CO3，以及添加400mL 0.5M KH2PO4。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除THF，以及將殘余物與700mL DCM混合。將有機相添加至用在DMF中的2％甲醇和2％吡啶填充的二氧化硅柱，10X35cm。將至10％甲醇的梯度應(yīng)用于柱，經(jīng)14L溶劑，將包含純的5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N2-(叔丁氧基羰基)-脫氧鳥苷的級分合并，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減。產(chǎn)量為25g(34mM，22％收率，來自DMT dG(iBu))。通過添加60mL 1M TBAF在THF中以及10mL HOAc在500mL THF中的溶液去除TBDMS基團。在18小時之后，添加50mL飽和NaHCO3，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除THF。將殘余物溶解在600mL DCM中，以及用400mL飽和NaHCO3洗滌。將有機相通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減至泡沫以產(chǎn)生5’-O-DMT-N2-(叔丁氧基羰基)-脫氧鳥苷(19.5g,29.1mM,86％，來自5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N2–(叔丁氧基羰基)-脫氧鳥苷)。材料的純度足以用于下一步驟。在用在DCM中的2％甲醇和2％吡啶填充的二氧化硅柱(10X35cM)上通過柱色譜法如上制備分析性樣品。將至10％甲醇的梯度應(yīng)用于柱，經(jīng)10L溶劑，將包含純的產(chǎn)物的級分合并以及蒸發(fā)。1H NMR(400mHz,CDCl3,PPM)7.7(m,1H),7.2–7.4(m,10H),6.8(d,4H),6.2(t,1H),5.7(s,2H),4.65(m,1H),4.15(m,1H),3.8(s,6H),3.35(m,2H),2.7(m,1H),2.45(m,1H),1.6(s,18H)。
制備2-氰乙基-N,N,N’,N’-四異丙基-亞磷酰二胺(12g,40mM)和1H-四唑(1g,14mM)在400mL無水乙腈中的溶液，以及在混合1min之后，將其添加至包含19.5g(29.1mM)無水5’-O-DMT-N2–(叔丁氧基羰基)-脫氧鳥苷的燒瓶中。在渦旋下，緩慢地溶解核苷，在2小時之后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，以及將殘余物溶解在包含100mL飽和NaHCO3溶液的EtOAc(500ml)中。搖振混合物，使其分離，以及將有機相添加至用在EtOAc中的2％吡啶填充的二氧化硅柱，6X25cM。等度洗脫柱，將包含純的259的級分合并，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減至12g(14mM，45％收率，來自核苷)。31P NMR(161mHz,CDCl3,PPM):149.213,149.175。C45H56N7O9P的分析計算值：C,62.13.H,6.49.N,11.27。實測值：C,62.22.H,6.69.N,11.02。
5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-N3-(叔丁氧基羰基)-胸苷-3’-O-N,N-二異丙基氰乙基亞磷酰胺(結(jié)構(gòu)260)
將50g(91.5mM)5’-O-(4,4’二甲氧基三苯甲基)-胸苷通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)從700mL無水吡啶中干燥，以及進行高真空過夜。添加20g(0.294M)咪唑以及700mL無水吡啶和50g(0.333M)叔丁基二甲基氯硅烷。將溶液攪拌18小時，由此TLC顯示完全轉(zhuǎn)化(二氧化硅，10％MeOH，2％吡啶于DCM中，原料rf：0.5，產(chǎn)物rf：0.9，用10％H2SO4和加熱進行可視化)。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除吡啶，以及將產(chǎn)物溶解在700mL DCM中。將溶液用500mL 0.5M KH2PO4洗滌，隨后用500mL飽和NaHCO3水溶液洗滌。將溶液蒸發(fā)，以及進行高真空過夜。產(chǎn)量為60g，90.8％。將50g該產(chǎn)物溶解在1L THF中，以及在氬氣下添加25g無水K2CO3。將混合物攪拌30min，以及添加50g焦碳酸二叔丁酯。在此完全溶解之后，添加12g DMAP。在過夜攪拌之后，TLC揭示完全反應(yīng)(1:1石油醚：乙酸乙酯，2％吡啶，原料rf：0.4，產(chǎn)物rf：0.8)。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除THF，以及將殘余物溶解在700mL乙酸乙酯中。將有機相用500ml 0.5M K2HPO4洗滌，隨后用500mL飽和NaHCO3洗滌。將有機相添加至用49％乙酸乙酯、49％石油醚和2％吡啶填充的二氧化硅柱，10x 35cM。等度洗脫柱，以及將包含純的5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N3-(叔丁氧基羰基)-胸苷的級分合并，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減。產(chǎn)量為49.3g，86％收率。通過添加60mL 1M TBAF在THF中以及10mL HOAc在500mL THF中的溶液去除TBDMS基團。在18小時之后，TLC顯示完全轉(zhuǎn)化(二氧化硅，2％MeOH，2％吡啶于DCM中，原料rf：0.60，產(chǎn)物rf 0.2，用10％H2SO4和加熱進行可視化)。添加50mL飽和NaHCO3，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除THF。將殘余物溶解在600mL EtOAc中，以及用400mL水洗滌，隨后用400mL飽和NaHCO3洗滌。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將有機相縮減至焦油，然后再溶解在200mL DCM中，以及添加至用在DCM中的2％甲醇和2％吡啶填充的二氧化硅柱，10X35cM。將至10％甲醇的梯度應(yīng)用于柱，經(jīng)10L溶劑，將包含純的5’-O-DMT-N3-(叔丁氧基羰基)-胸苷的級分合并，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減。產(chǎn)量為35g(54.3mM，84％，來自5’-O-DMT-3’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-N3-(叔丁氧基羰基)-胸苷)。1H NMR(400mHz,CDCl3,PPM):8.6(d,2H),7.4–7.2(m,9H),6.7(dd,4H),6.37(t,1H),4.6(dd,1H),4.15(dd,1H),3.8(s,6H),3.5(dd,1H),3.4(dd,1H),2.7(d,1H),2.35(m,2H),1.6(s,9H),1.45(s,3H)。將25g(45mM)產(chǎn)物通過在無水吡啶(500mL)中的溶液干燥，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，隨后高真空過夜。制備15g(50mM)2-氰乙基-N,N,N’,N’-四異丙基亞磷酰二胺和650mg(9mM)1H-四唑在500mL無水乙腈中的溶液，以及在混合1min之后，將其添加至包含25g(45mM)無水5’-O-DMT-N3-(-叔丁氧基羰基)-胸苷的燒瓶中。在渦旋下緩慢地溶解核苷，以及2小時之后，TLC顯示完全轉(zhuǎn)化(二氧化硅，2％吡啶于EtOAc中，原料rf：0.30，產(chǎn)物rf：0.75，呈兩個非對映體斑點，用0.5％AgNO3和加熱進行可視化)。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，以及將殘余物溶解在包含200mL飽和NaHCO3溶液的500ml EtOAc中。搖振混合物，使其分離，以及將有機相添加至用49％乙酸乙酯、49％石油醚和2％吡啶填充的二氧化硅柱，5X25cM。等度洗脫柱，將包含純的260的級分合并，以及通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)縮減至25.5g(29.6mM，76.3％收率，來自核苷)。31P NMR(161mHz,CDCl3,PPM):149.711,149.105。C45H57N4O10P的分析計算值：C,63.97.H,6.80.N,6.63。實測值：C,63.74.H,6.64.N,6.78。
Boc受保護的核糖核苷亞磷酰胺的一般合成。
通過用氨處理商購的堿基-受保護的5’-O-DMT-2’-O-TBDMS核糖核苷3’-亞磷酰胺以去除核堿基之上的保護基團來制備用于合成RNA的這些試劑。用焦碳酸二叔丁酯對其進行處理產(chǎn)生了用于RNA合成的期望的Boc-受保護的試劑。
例如，以下為riboC試劑的制備。
用在甲醇中的氨水進行N-脫保護5’-O-DMT-2’-O-TBDMS-N4-乙?；奏?’-O-(N,N-二異丙基氰乙基亞磷酰胺)。將產(chǎn)物充分干燥，以及用在THF中的焦碳酸二叔丁酯和碳酸鉀處理。通過柱色譜法分離產(chǎn)物Boc RNA amidite。同樣也制備了完全受保護的N6-二Boc-腺苷、N2-Boc-鳥苷和N-1-Boc-尿苷亞磷酰胺。
CPG-Boc-核苷的一般合成
用在無水吡啶中的二甘醇酸酐和催化劑N-甲基咪唑處理5’-DMT-N-(Boc)核苷，以及將所得的3’-酯通過柱色譜法純化。用在足以與CPG形成濃漿液的乙腈中的400mg甘醇酸酯、400mg BOP和400微升N-甲基嗎啉處理10g 1000A氨丙基CPG。靜置過夜，隨后洗滌，加帽和干燥，產(chǎn)生了30微摩爾/g負載下的衍生化的CPG。
脫保護T10寡核苷酸中的單個Boc殘基的時間進程
Boc-dC-T10的制備和脫保護
將dC amidite與T-10偶聯(lián)，切割DNA，用在甲醇(1mL)中的25％的2-甲氧基乙胺在室溫脫保護3小時，去除CPG并蒸發(fā)至干燥，再溶解于DI水(1mL)中。ESMS顯示具有仍然連接的叔丁基的DNA(M+100)的準(zhǔn)確質(zhì)量。RP HPLC被用于跟蹤熱誘導(dǎo)的N-4-Boc-dC脫保護；Boc受保護的dC-T-10具有較長的保留時間，其中來自oligo的基線分離無上述現(xiàn)象。積分給出了溶液中各物質(zhì)的相對量。3小時時間進程顯示15min內(nèi)完全脫保護；12min時間進程(以下顯示)顯示依次地脫保護，其中T1/2為約6min。
剩余的部分Boc：5’-dC(Boc)T10-3’，94°，中性水
時間，分鐘
(Boc)2-dA-T10的脫保護
將BisBoc-dA amidite與T-10偶聯(lián)，切割DNA，用在甲醇(1mL)中的25％的2-甲氧基乙胺在室溫脫保護3小時，去除CPG并蒸發(fā)至干燥，再溶解于DI水(1mL)中。ESMS顯示具有仍然連接的叔丁基的DNA(M+100)的準(zhǔn)確質(zhì)量。RP HPLC被用于跟蹤熱誘導(dǎo)的Boc脫保護。15分鐘的時間進程顯示15min內(nèi)80％的脫保護，其中T1/2為約7min。NMR和ESMS數(shù)據(jù)顯示：在從CPG去除寡核苷酸期間，通過堿處理去除碳酸叔丁酯之一，從而在腺嘌呤殘基上留下單個Boc。
脫保護寡核苷酸中的Boc-受保護的dA的時間進程
Boc-受保護的RNA
在10-15min的偶聯(lián)時間內(nèi)將核糖核苷amidite與T10以至少90％的效率偶聯(lián)。將各個與T-10偶聯(lián)，以及通過RP HPLC檢查。通過磷NMR測得其純度為98％。當(dāng)將樣品在94℃加熱1h時，在所有情況中，在加熱后，觀察到Boc基團的完全去除。通過ESMS確認結(jié)果。時間進程用于測量轉(zhuǎn)化率，使用HPLC用于簡單評價存在的各物質(zhì)的量。以下顯示了rC-和rA-T10寡核苷酸的結(jié)果：
Boc-受保護的PCR引物的脫保護
用Boc dA、dC和dG amidite在Boc-dG CPG(1μmol)上合成RNaseP正向引物19-mer[AGATTTGGACCTGCGAGCG]。該引物的完全脫保護的質(zhì)量為5868g/mol，以及Boc保護的預(yù)期質(zhì)量為7369g/mol[15個Boc殘基·100amu/Boc＝增加的1500]。在室溫下，用在甲醇(1mL)中的25％的2-甲氧基乙胺進行3小時的側(cè)鏈保護基團的脫保護，去除CPG且蒸發(fā)至干燥，再溶解于DI水(1mL)中。在裂解之前，去除DMT，因為Boc基團可以被用作疏水手柄。將產(chǎn)物用在1mL筒(cartridge)中填充的20-50微米聚苯乙烯珠子中脫鹽，以及在20％ACN/H2O中洗脫。
將脫鹽的Boc-引物等分至3個100uL微量離心管中。將樣品干燥，以及溶解在1mL家用DI水中。向第一管中僅添加水。在第二管中，將1mL含有MgCl2的PCR緩沖液，pH 8.5，1X，添加至6mM的終濃度(標(biāo)準(zhǔn)PCR濃度)。向第三管中添加TEAA以產(chǎn)生0.025N的終濃度。將3個樣品各自等分至10個200uL薄壁PCR管中，總共30個管。在室溫進行所有引物準(zhǔn)備。
將ABI 9700熱循環(huán)儀預(yù)熱至94℃。將各樣品置于熱塊(heat block)上，在某時間點移除并置于冰上以終止反應(yīng)。作為陰性對照，在實驗開始時，T＝0時的樣品不進行加熱，且直接置于冰中。使樣品在室溫解凍，轉(zhuǎn)移至96孔板中，用于HPLC和質(zhì)譜分析。
對于各時間點，獲得反相和質(zhì)譜數(shù)據(jù)以追蹤Boc保護基團的去除。Boc受保護的引物不是單一物質(zhì)，而是各種保護階段的集合。在T＝0的樣品中，一系列物質(zhì)(相差100個質(zhì)量單位)顯示一些Boc基團可能通過暴露于質(zhì)譜儀的高溫入口已經(jīng)脫離。
加熱之前的HPLC：
加熱之前的ESMS：
2：(時間：1.52)MaxEnt 1；組合(1:294)6.2e+003
10分鐘之后，幾乎所有Boc基團離去；然而，一些保留在TEAA樣品中。15分鐘之后，去除TEAA中的所有Boc基團。重要地是，10分鐘之后，在正常PCR緩沖作用中，脫保護引物。
加熱之后的HPLC：
加熱之后的ESMS:
5：(時間：0.84)MaxEnt 1；組合(1:278)1.3e+004