本發(fā)明屬于化合物藥物領(lǐng)域，具體涉及吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤生長(zhǎng)速度快，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，易發(fā)生出血、壞死、潰瘍等，并常有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，造成人體消瘦、無(wú)力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損，最終造成患者死亡，對(duì)人群健康和生命有巨大的威脅。手術(shù)治療根治性切除仍是肺癌、腎癌、肝癌等癌癥目前最基本和常用的治療方法，但是通常切除手術(shù)創(chuàng)傷性較大、術(shù)后會(huì)造成機(jī)體組織的損傷及氣血的虧損，所以不適合老年人、自身身體素質(zhì)較差以及合并有心、肺、肝等重要臟器疾病者選用，因此需要開(kāi)發(fā)新的化學(xué)藥物治療。此外，化學(xué)藥物治療也是目前治療腫瘤及某些自身免疫性疾病的主要手段之一。盡管市場(chǎng)上已經(jīng)存在多種治療癌癥的藥物，但是都存在著各種缺陷，例如生物利用度不高、專屬性不強(qiáng)、毒副作用大等問(wèn)題。而這些缺陷，往往是由于化合物本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其作用靶標(biāo)所帶來(lái)的，難以在進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)中克服。因此，本領(lǐng)域人員都希望合成出結(jié)構(gòu)各異的多種化合物以及探索到新的作用靶標(biāo)以克服前述缺陷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種全新結(jié)構(gòu)的吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物。式(ⅰ)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其溶劑合物：其中，r1表示-nh2、-nh(c1-c4烷基)或者-n(c1-c4烷基)2；r2表示氫或c1-c6烷基；r3表示氫或c1-c6烷基；r4表示無(wú)或苯環(huán)上的一個(gè)或多個(gè)取代基，所述取代基分別獨(dú)立地選自羥基或n表示1～10的正整數(shù)；r5選自亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基、亞己基、亞庚基、亞辛基、亞壬基或亞癸基；x表示鹵素原子、-oh、c1-c6烷基。進(jìn)一步地，r1為-nh2。進(jìn)一步地，r2為氫。進(jìn)一步地，r3表示c1-c6烷基。進(jìn)一步地，r3表示叔丁基。進(jìn)一步地，r1為-nh2，且r2為氫，且r3表示叔丁基。進(jìn)一步地，n為1、2或3。進(jìn)一步地，r5為亞乙基。進(jìn)一步地，x為甲基。更進(jìn)一步地，所述化合物結(jié)構(gòu)為：本發(fā)明還提供了前述的化合物、或其溶劑合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的用途；優(yōu)選的，所述腫瘤為肝癌、肺癌和腎癌。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它是以前述的化合物、或其溶劑合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。本發(fā)明中，所述c1-c4的烷基是指c1、c2、c3、c4的烷基，即具有1～4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基等等。類似的，所述c1-c6的烷基是指c1、c2、c3、c4、c5、c6的烷基，即具有1～6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、己基等等。本發(fā)明中，“治療”也包括復(fù)發(fā)性(relapse)預(yù)防或階段性(phase)預(yù)防，以及急性或慢性體征、癥狀和/或功能失常的治療。治療可以是對(duì)癥治療，例如抑制癥狀。它可以在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)，在中期內(nèi)調(diào)整，或者可以說(shuō)是長(zhǎng)期治療，例如在維持療法里面。所述“預(yù)防”包括延遲和/或阻止病癥、疾病或病況和/或其伴發(fā)癥狀的發(fā)作；防止對(duì)象染上病癥、疾病或病況；或降低對(duì)象染上病癥、疾病或病況的風(fēng)險(xiǎn)的方法。本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的”是指某載體、運(yùn)載物、稀釋劑、輔料，和/或所形成的鹽通常在化學(xué)上或物理上與構(gòu)成某藥物劑型的其它成分相兼容，并在生理上與受體相兼容。本發(fā)明中，“鹽”是將化合物或其立體異構(gòu)體，與無(wú)機(jī)和/或有機(jī)酸和堿形成的酸式和/或堿式鹽，也包括兩性離子鹽(內(nèi)鹽)，還包括季銨鹽，例如烷基銨鹽。這些鹽可以是在化合物的最后分離和純化中直接得到。也可以是通過(guò)將化合物，或其立體異構(gòu)體，與一定數(shù)量的酸或堿適當(dāng)(例如等當(dāng)量)進(jìn)行混合而得到。這些鹽可能在溶液中形成沉淀而以過(guò)濾方法收集，或在溶劑蒸發(fā)后回收而得到，或在水介質(zhì)中反應(yīng)后冷凍干燥制得。本發(fā)明中所述鹽可以是化合物的鹽酸鹽、硫酸鹽、枸櫞酸鹽、苯磺酸鹽、氫溴酸鹽、氫氟酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、丁二酸鹽、草酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、酒石酸鹽或三氟乙酸鹽。試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的化合物對(duì)肺癌細(xì)胞株a549、肝癌細(xì)胞株hepg2和腎癌細(xì)胞株786-0都有抑制細(xì)胞增殖的作用。對(duì)a549細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用和使得a549細(xì)胞增殖減慢的作用?？梢灶A(yù)期其具有治療肺癌、肝癌和腎癌的作用，臨床藥用的前景明確。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說(shuō)明下述附圖中，03-20為本發(fā)明化合物、或其溶劑合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。圖1為03-20對(duì)不同細(xì)胞(a549，hepg2，786-0)處理72h后的抑制率。圖2為不同濃度的03-20對(duì)a549的凋亡影響結(jié)果。圖3為不同濃度的03-20對(duì)a549的周期影響結(jié)果。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中，關(guān)鍵中間體產(chǎn)物可通過(guò)自制得到，其余所有參與合成的試劑在商業(yè)中均可從國(guó)藥、長(zhǎng)征公司購(gòu)買得到。實(shí)施例1本發(fā)明化合物的制備化合物1(269mg,1mmol)溶解在1,4-二氧六環(huán)/水(4:1)150ml溶液中，并轉(zhuǎn)移到250ml的圓底燒瓶中，再向反應(yīng)液中加入(1.38g,10mol)碳酸鉀，在室溫下攪拌三分鐘以后，加入催化劑雙二苯膦基二茂鐵合氯化鈀(73.1mg，0.1mol)，將反應(yīng)混合物加熱到100℃,通過(guò)tlc檢測(cè)反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束以后，首先，待反應(yīng)液冷卻，加入50ml的蒸餾水，然后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入100ml的二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鈉，旋干有機(jī)溶劑，通過(guò)硅膠柱分離得到中間化合物2(200mg，70％)，(二氯甲烷：(二氯甲烷：甲醇)＝100:2.5)。1hnmr(600mhz,dmso-6d)δ9.83(s,1h,hoar),8.28(s,1h,ch),6.97-7.83(m，4h，ar)，5.83(s,1h),1.80(m，9h，t-bu)；hr-ms(esi+)：calc.for[c15h17n5o]:284.1433[m+h]+；found284.1513[m+h]+?；衔?(283mg，1mol)溶解在20ml的無(wú)水乙腈中，然后通過(guò)滴液漏斗加入到(68mg，0.5mol)碳酸銫和二對(duì)甲苯磺酸三乙二醇酯的乙腈溶液中，回流反應(yīng)3小時(shí)，通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行，待反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液冷卻以后，加入50ml的蒸餾水，然后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入100ml的二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鈉，旋干有機(jī)溶劑，通過(guò)硅膠柱分離得到中間化合物3(400mg，76％)，(二氯甲烷：(二氯甲烷：甲醇)＝100:1)。1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ8.22(s,1h),7.79-7.06(m,8h,ar),4.51–3.50(t,8h),4.10–4.05(m,6h),2.36(s,3h),1.72(s,9h)；hr-ms(esi+)：calc.for[c26h31n5o5s]:526.2046[m+h]+；found526.1277[m+h]+?；衔?(525mg，1mol)溶解在0.2mol/l的甲醇鈉甲醇溶液中，在室溫下攪拌6小時(shí)，通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行，待反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)液冷卻以后，加入50ml的蒸餾水，然后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入100ml的二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鈉，旋干有機(jī)溶劑，通過(guò)硅膠柱分離得到終產(chǎn)物4(300mg，78％)，(二氯甲烷：(二氯甲烷：甲醇)＝100:1.5)。1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ8.21(s,1h),7.57–7.08(m,4h),4.15–3.40(m,8h),3.24(s,3h),1.72(s,9h)；hr-ms(esi+)：calc.for[c20h27n5o3]:386.2114[m+h]+；found386.2123[m+h]+。以下通過(guò)試驗(yàn)說(shuō)明本發(fā)明的有益效果試驗(yàn)1.細(xì)胞活性檢驗(yàn)采用mtt檢測(cè)法，其為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸。huaxi03-20藥物為本發(fā)明化合物(化合物4)、或其溶劑合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。(1)所需實(shí)驗(yàn)試劑、耗材、儀器實(shí)驗(yàn)材料：huaxi03-20藥物，hepg2細(xì)胞，a549細(xì)胞，786-0細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)試劑：dmso，mtt，dmem完全培養(yǎng)基+10％fbs+1％雙抗，胰酶，pbs(滅菌)；實(shí)驗(yàn)耗材：96孔板，10ul槍尖(均滅菌)，1ml離心管，配套移液槍；實(shí)驗(yàn)儀器：多功能熒光酶標(biāo)儀(bioteksynergymx)、渦旋振蕩器。(2)實(shí)驗(yàn)步驟：(a)收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100μl，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至3000個(gè)/孔，(邊緣孔用無(wú)菌pbs填充)。(b)5％co2，37℃孵育，次日上午加藥，一般5個(gè)濃梯度，每孔100μl，設(shè)4--6個(gè)復(fù)孔。(c)5％co2，37℃孵育72小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。(d)每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。(e)終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。(f)每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀od490nm處測(cè)量各孔的吸光值。(g)同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、mtt、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、mtt、二甲基亞砜)。(h)計(jì)算:抑制率＝(對(duì)照-給藥)/對(duì)照×100％。(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：a549細(xì)胞作用72h，藥物劑量分別為3.125μm、6.25μm、12.5μm、24μm和50μm，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。hepg2和786-0細(xì)胞作用時(shí)間為72h，藥物劑量為50μm，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。hepg2和786-0細(xì)胞在5％co2，37℃條件下作用時(shí)間為72h，藥物劑量為50μm，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。表1mtt法測(cè)試不同濃度作用a549細(xì)胞72h后的吸光度結(jié)論：從細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)可以看出，03-20對(duì)a549、hepg2和786-0細(xì)胞都有抑制細(xì)胞增殖的作用。試驗(yàn)2.細(xì)胞凋亡檢測(cè)(1)所需實(shí)驗(yàn)試劑、耗材、儀器實(shí)驗(yàn)材料：huaxi03-20藥物，a549細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)試劑：dmem完全培養(yǎng)基+10％fbs+1％雙抗，凋亡試劑盒(四正柏)，胰酶，pbs(滅菌)；實(shí)驗(yàn)耗材：6孔板，1ml槍尖，200ul槍尖，10ul槍尖(均滅菌)，配套移液槍；實(shí)驗(yàn)儀器：渦旋振蕩器、恒溫孵箱流式分析儀(beckman，cytoflex)。(2)實(shí)驗(yàn)步驟(a)用冷的pbs洗2次，然后用1x的結(jié)合液重懸細(xì)胞(1*10^6cells/ml)。(b)將100ul溶液(1*10^5cells)轉(zhuǎn)移至5ml的離心管中。(c)加5ul的fitcannexinv避光孵育10分鐘，然后加入5ul的pi試劑輕輕渦旋細(xì)胞，避光，室溫孵育15min。(d)加400ul/tube1x的結(jié)合液，流式分析。(3)a549凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)室結(jié)果見(jiàn)圖2和表2所示。表2不同濃度的03-20對(duì)a549的凋亡結(jié)果對(duì)照03-208um03-2010um03-2012um03-2015um(早凋+晚凋)％8.3111.3611.4815.1137.42結(jié)論：從凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，03-20對(duì)a549細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用，并且隨著濃度升高，凋亡作用越明顯。試驗(yàn)3.細(xì)胞周期檢測(cè)(1)所需實(shí)驗(yàn)試劑、耗材、儀器實(shí)驗(yàn)材料：huaxi03-20藥物，a549細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)試劑：dmem完全培養(yǎng)基+10％fbs+1％雙抗，周期試劑盒(四正柏)，胰酶，pbs(滅菌)；實(shí)驗(yàn)耗材：6孔板，1ml槍尖，200ul槍尖，10ul槍尖(均滅菌)，配套移液槍；實(shí)驗(yàn)儀器：多功能熒光酶標(biāo)儀(bioteksynergymx)、渦旋振蕩器、恒溫孵箱，流式分析儀(beckman，cytoflex)。(2)實(shí)驗(yàn)步驟(a)0.25％胰酶(無(wú)edta)消化，將細(xì)胞消化成單個(gè)，離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷pbs洗細(xì)胞兩次(加3ml，吹懸，離心，棄上清算洗一次)。(b)將細(xì)胞沉淀加入1ml預(yù)冷(-20℃)70％乙醇中，震蕩混勻后于4℃固定過(guò)夜。(c)離心收集細(xì)胞，以1ml的pbs洗細(xì)胞兩次，加入500ulpbs含50ug/ml溴化乙錠(pi)，100ug/mlrnasea，0.2％tritonx-100，4℃避光孵育30分鐘。(d)送實(shí)驗(yàn)室，上機(jī)。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3和圖3所示表3不同濃度的03-20對(duì)a549的周期結(jié)果對(duì)照03-2010um03-2012um(g1期+s期)％90.4191.2591.94s期％29.4134.8034.88g2期％9.598.758.06結(jié)論：從周期實(shí)驗(yàn)可以得出，和對(duì)照相比，a549細(xì)胞在03-20藥物10um和12um作用下，處于s期的比例提高，而g2期降低，使得細(xì)胞增殖減慢。綜上所述，本發(fā)明提供的化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制增長(zhǎng)作用、促凋亡作用和減緩癌細(xì)胞的增殖作用，可以用于預(yù)防和/或治療腫瘤相關(guān)疾病，尤其是肺癌、腎癌和肝癌，具有廣泛的應(yīng)用前景。當(dāng)前第1頁(yè)12