本發(fā)明屬于代謝工程和組合生物學
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種生產(chǎn)β-胡蘿卜素的重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：β-胡蘿卜素是存在于胡蘿卜、木瓜、綠色蔬菜等諸多食物中的一種天然類胡蘿卜素。在自然界中，β-胡蘿卜素主要以全反式結(jié)構(gòu)存在，具有11個共軛碳碳雙鍵，具有良好的淬滅自由基、抗氧化、抑制單線態(tài)氧等作用，并具有防癌、抗癌、延緩衰老等功能。β-胡蘿卜素作為維生素a的前體，是who和fao食品添加劑聯(lián)合專家委員會認定的a類營養(yǎng)食品強化劑。作為藥物，β-胡蘿卜素已被美國藥典(usp)1990版、1995版，歐洲藥典1997版，英國藥典(bp)1998版正式收載，中國衛(wèi)生部頒布的標準和中國國家藥品監(jiān)督管理局公布的第一批非處方藥目錄也已收錄本產(chǎn)品(s.j.chem.β-胡蘿卜素國內(nèi)市場分析,精細與專用化學品,2003,8:8-9)。微生物發(fā)酵法是指以三孢布拉霉、酵母等微生物發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素。其中，以三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素最具工業(yè)應(yīng)用前景。但是三孢布拉霉由于霉菌的生殖方式等原因，其性狀易發(fā)生衰退，這些不足限制了其發(fā)展，所以尋求優(yōu)良菌株變得尤為重要。cn105316246a公開了一種β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌種及其應(yīng)用，借助基因組裝技術(shù)，將來自于卷枝毛霉的β-胡蘿卜素合成途徑的基因carb、carrp，及來自于解脂耶氏酵母的thmg1、ggs1基因引入解脂耶氏酵母，構(gòu)建成為產(chǎn)β-胡蘿卜素的工程菌。所述的解脂耶氏酵母能夠利用普通碳源和氮源，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量可達到4.5g/l。cn104805167a公開了一種生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法及其基因工程菌，主要包括以下步驟：大腸桿菌基因工程菌中包括4個外源的β-胡蘿卜素合成基因(crte、crti、crty和crtb)表達載體和4個mep途徑基因(dxs、idi、ispd和ispf)表達載體，過表達mep途徑中的4個酶，構(gòu)建不同強度啟動子的mep途徑，從而提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量。cn102168096a公開了一種基于杜氏鹽藻代謝途徑的β-胡蘿卜素工程菌及構(gòu)建方法，包括如下步驟：獲取杜氏鹽藻中相關(guān)基因的cdna，獲取巴氏杜氏八氫番茄紅素合成酶psy啟動子，構(gòu)建質(zhì)粒pdscrtb轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得β-胡蘿卜素工程菌。在2yt培養(yǎng)基下37℃搖瓶培養(yǎng)24h，β-胡蘿卜素產(chǎn)率為2.6～3.2mg/gdcw。cn103865817a公開了一種產(chǎn)β-胡蘿卜素基因工程菌的構(gòu)建方法，主要步驟如下：利用來自紅發(fā)夫酵母中crte、crtyb、crti構(gòu)建基因表達模塊，并且所述的表達模塊包括基因上游的啟動子和下游的終止子。將所述基因表達模塊共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量約6mg/gdcw。cn105087408a公開了一種生產(chǎn)β-胡蘿卜素的酵母菌株，該發(fā)明酵母菌株基因組上的gal1、gal7、gal10基因被erg12、thmg1、erg8基因替換掉；gal80基因被mvd1、erg10、idi1基因替換；erg9基因的啟動子被替換；三孢布拉霉中carg、carb和carra基因被表達。盡管目前已經(jīng)有很多利用大腸桿菌和釀酒酵母合成β-胡蘿卜素的報道，但是仍然沒有相關(guān)的菌株被應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，究其原因，可能有以下幾點：(1)β-胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶(八氫番茄紅素脫氫酶、八氫番茄紅素合成酶/番茄紅素環(huán)化酶)自身活性較低，異源表達后胡蘿卜素合成量不高；(2)大腸桿菌會產(chǎn)生細胞毒素，用它做表達宿主生產(chǎn)胡蘿卜素時存在食品安全風險；(3)β-胡蘿卜素是一種脂溶性色素，它存儲于脂質(zhì)體中，而釀酒酵母是一種非產(chǎn)油酵母，積累的油脂量小于細胞干重的3％，這也限制了釀酒酵母作為表達宿主的應(yīng)用。因此，尋找一種更具有優(yōu)勢的微生物勢在必行。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有的生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法存在的穩(wěn)定性較低、產(chǎn)量低的問題，提供一種高產(chǎn)β-胡蘿卜素的重組菌，以及該重組菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用。解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是該產(chǎn)β-胡蘿卜素的重組菌由下述方法構(gòu)建而成：1、構(gòu)建基因表達模塊，所述基因表達模塊包括a和b：a、經(jīng)密碼子優(yōu)化的β-胡蘿卜素合成基因以及該基因上游的啟動子和下游的終止子，其中所述經(jīng)密碼子優(yōu)化的β-胡蘿卜素合成基因編碼的蛋白質(zhì)分別為八氫番茄紅素合成酶/番茄紅素環(huán)化酶和八氫番茄紅素脫氫酶。b、mva途徑基因以及該基因上游的啟動子和下游的終止子，其中所述mva途徑基因編碼的蛋白質(zhì)分別為牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶。2、將步驟1的基因表達模塊進行體外組裝，獲得含4個基因表達模塊的質(zhì)粒。3、將步驟2的質(zhì)粒整合至不產(chǎn)β-胡蘿卜素的宿主菌的基因組中，篩選橘紅色的單菌落，即得到產(chǎn)β-胡蘿卜素的重組菌。上述經(jīng)密碼子優(yōu)化的β-胡蘿卜素合成基因編碼的蛋白質(zhì)來源于三孢布拉霉菌、成團泛菌、菠蘿泛菌、法夫酵母、卷枝毛霉中的任意一種，mva途徑基因編碼的蛋白質(zhì)來源于解脂亞羅酵母、釀酒酵母、假絲酵母中的任意一種，不產(chǎn)β-胡蘿卜素的宿主菌為解脂亞羅酵母、釀酒酵母、假絲酵母、大腸桿菌中的任意一種。上述經(jīng)密碼子優(yōu)化的八氫番茄紅素合成酶/番茄紅素環(huán)化酶基因的堿基序列如seqidno.1所示，經(jīng)密碼子優(yōu)化的八氫番茄紅素脫氫酶基因的堿基序列如seqidno.2所示。上述啟動子為ptef1、phxt7、pgal1-pgal10、ptpi1、ptdh3、ppgk1、ppyk1、pexp1、pfba、ppyk1、pxpr2、puas、pgpat、pyat1、pleum、ptps1中的任意一種，終止子為tcyc1、tadh1、txpr2、tmig1、tlip2、ttkl1、ttdh2、teno2中的任意一種。本發(fā)明重組菌在制備β-胡蘿卜素中的應(yīng)用，具體方法如下：1、一級種子培養(yǎng)：將重組菌菌株單克隆接種于種子培養(yǎng)液中，在28℃、200rpm/min下培養(yǎng)24h，獲得一級種子液；其中種子培養(yǎng)液是按每100ml去離子水中加入2g葡萄糖、2g蛋白胨、1g酵母粉，滅菌后得到。2、發(fā)酵培養(yǎng)：將一級種子液按1％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃、200rpm/min下培養(yǎng)144h，收集發(fā)酵液；其中發(fā)酵培養(yǎng)基的是按每100ml去離子水中加入4g葡萄糖、0.251g硫酸銨、0.2g缺少亮氨酸的酵母氮源(drop-outmixsyntheticminusleucinew/oyeastnitrogenbase)、0.17g酵母氮源，滅菌后得到。3、以丙酮為提取溶劑，從發(fā)酵液中提取β-胡蘿卜素。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明通過分別構(gòu)建經(jīng)密碼子優(yōu)化的β-胡蘿卜素合成基因編碼的蛋白質(zhì)八氫番茄紅素合成酶/番茄紅素環(huán)化酶、八氫番茄紅素脫氫酶以及mva途徑基因編碼的蛋白質(zhì)牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶的超強基因表達模塊；將所述基因表達模塊體外組裝后獲得含4個基因表達模塊的質(zhì)粒，然后將該質(zhì)粒整合至不產(chǎn)β-胡蘿卜素的宿主菌基因組中，篩選橘紅色的單菌落，即得到產(chǎn)β-胡蘿卜素的重組菌。采用本發(fā)明的重組菌進行發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)β-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量可達到26.03mg/gdcw，具有高的產(chǎn)β-胡蘿卜素性能。附圖說明圖1是解脂亞羅酵母中β-胡蘿卜素生物合成途徑示意圖，其中carbonsource表示碳源，acetyl-coa表示乙酰-coa，hmg-coa表示3-羥基-3-甲基戊二酰-coa還原酶，mevalonateacid表示甲羥戊酸，gpp表示牻牛兒基焦磷酸，fpp表示法尼基焦磷酸，ggpp表示牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸，phytoene表示八氫番茄紅素，lycopene表示番茄紅素，beta-carotene表示β-胡蘿卜素。具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于這些實施例。實施例1根據(jù)圖1所示的解脂亞羅酵母中β-胡蘿卜素生物合成途徑，構(gòu)建產(chǎn)β-胡蘿卜素重組菌，具體構(gòu)建方法如下：1、構(gòu)建基因表達模塊將經(jīng)密碼子優(yōu)化的八氫番茄紅素合成酶/番茄紅素環(huán)化酶基因(optcarra，堿基序列如seqidno.1所示，登錄號為ky971027，由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成)和表達載體pjn44(含啟動子ptef和終止子txpr2)分別用限制性內(nèi)切酶smai在37℃下處理2h，純化并膠回收目的基因和載體的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到含optcarra表達模塊的質(zhì)粒optpjn44-carra。將經(jīng)密碼子優(yōu)化的八氫番茄紅素脫氫酶基因(optcarb，堿基序列如seqidno.2所示，登錄號為ky971026，由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成)和表達載體pjn44分別用限制性內(nèi)切酶hindiii/smai在37℃下處理2h，純化并膠回收目的基因和載體(約7500bp)的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到含optcarb表達模塊的質(zhì)粒optpjn44-carb。將牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因(ggs1，堿基序列如seqidno.3所示，登錄號為yali0d17050g)和表達載體pjn44分別用限制性內(nèi)切酶hindiii/smai在37℃下處理2h，純化并膠回收目的基因和載體(約7500bp)的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到含ggs1表達模塊的質(zhì)粒pjn44-ggs1。將3-羥基-3甲基戊二酰輔酶a還原酶基因(thmg，堿基序列如seqidno.4所示，登錄號為yali0e04807g)和表達載體pjn44分別用限制性內(nèi)切酶smai在37℃下處理2h，純化并膠回收目的基因和載體的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到含thmg表達模塊的質(zhì)粒pjn44-thmg。2、基因表達模塊體外組裝將含optcarb表達模塊的質(zhì)粒optpjn44-carb和含optcarra表達模塊的質(zhì)粒optpjn44-carra分別用限制性內(nèi)切酶xbai/spei、spei在37℃下處理2h，純化并膠回收optcarb表達模塊(約2700bp)和質(zhì)粒optpjn44-carra的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到質(zhì)粒optpjn44-carra/carb。將含ggs1表達模塊的質(zhì)粒pjn44-ggs1和質(zhì)粒optpjn44-carra/carb分別用限制性內(nèi)切酶xbai/spei、spei在37℃下處理2h，純化并膠回收pjn44-ggs1表達模塊(約1900bp)和質(zhì)粒optpjn44-carra/carb的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到質(zhì)粒optpjn44-carra/carb/ggs1。將含thmg表達模塊的質(zhì)粒pjn44-thmg和質(zhì)粒optpjn44-carra/carb/ggs1分別用限制性內(nèi)切酶xbai/spei、spei在37℃下處理2h，純化并膠回收pjn44-thmg表達模塊(約2500bp)和質(zhì)粒optpjn44-carra/carb/ggs1的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到質(zhì)粒optpjn44-carra/carb/ggs1/thmg。3、質(zhì)粒整合至宿主菌的基因組按照酵母轉(zhuǎn)化試劑盒說明書(zymoresearchcorporation，usa)操作，將活化的解脂亞羅酵母單菌落接種于2mlypd培養(yǎng)基中，于30℃、180rpm過夜培養(yǎng)至菌液od600在1.8左右；取1ml菌液于1.5ml干凈的離心管中，離心(4000×g，4min)，棄培養(yǎng)基，加入500μlsolution1，渦旋混勻，離心(4000×g，4min)，棄上清液，加入50μlsolution2，渦旋混勻，加入5μl質(zhì)粒optpjn44-carra/carb/ggs1/thmg，震蕩混勻，再加入500μlsolution3，渦旋混勻，于30℃、180rpm培養(yǎng)4h后，涂布于相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型sd篩選平板上；待菌落長出后，篩選橘紅色的單菌落，即得到產(chǎn)β-胡蘿卜素的重組菌。對比例11、構(gòu)建基因表達模塊將八氫番茄紅素合成酶/番茄紅素環(huán)化酶基因(carra，堿基序列如seqidno.5所示，登錄號為37729028)和表達載體pjn44分別用限制性內(nèi)切酶smai在37℃下處理2h，純化并膠回收目的基因和載體的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到含carra表達模塊的質(zhì)粒pjn44-carra。將八氫番茄紅素脫氫酶基因(carb，堿基序列如seqidno.6所示，登錄號為37729027)和表達載體pjn44分別用限制性內(nèi)切酶hindiii/smai在37℃下處理2h，純化并膠回收目的基因和載體(約7500bp)的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到含carb表達模塊的質(zhì)粒pjn44-carb。2、基因表達模塊體外組裝將含carb表達模塊的質(zhì)粒pjn44-carb和含carra表達模塊的質(zhì)粒pjn44-carra分別用限制性內(nèi)切酶xbai/spei、spei在37℃下處理2h，純化并膠回收carb表達模塊(約2700bp)和質(zhì)粒pjn44-carra的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到質(zhì)粒pjn44-carra/carb。3、質(zhì)粒整合至宿主菌的基因組該步驟中，用等體積的質(zhì)粒pjn44-carra/carb替換實施例1步驟3中的質(zhì)粒optpjn44-carra/carb/ggs1/thmg，其他步驟與實施例1的步驟3相同，得到重組菌。對比例21、構(gòu)建基因表達模塊按照實施例1步驟1的方法構(gòu)建含optcarra表達模塊的質(zhì)粒optpjn44-carra和含optcarb表達模塊的質(zhì)粒optpjn44-carb。2、基因表達模塊體外組裝將含optcarb表達模塊的質(zhì)粒optpjn44-carb和含optcarra表達模塊的質(zhì)粒optpjn44-carra分別用限制性內(nèi)切酶xbai/spei、spei在37℃下處理2h，純化并膠回收optcarb表達模塊(約2700bp)和質(zhì)粒optpjn44-carra的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到質(zhì)粒optpjn44-carra/carb。3、質(zhì)粒整合至宿主菌的基因組該步驟中，用等體積的質(zhì)粒optpjn44-carra/carb替換實施例1步驟3中的質(zhì)粒optpjn44-carra/carb/ggs1/thmg，其他步驟與實施例1的步驟3相同，得到重組菌。對比例31、構(gòu)建基因表達模塊按照實施例1步驟1的方法構(gòu)建含optcarra表達模塊的質(zhì)粒optpjn44-carra、含optcarb表達模塊的質(zhì)粒optpjn44-carb及含ggs1表達模塊的質(zhì)粒pjn44-ggs1。2、基因表達模塊體外組裝將含optcarb表達模塊的質(zhì)粒optpjn44-carb和含optcarra表達模塊的質(zhì)粒optpjn44-carra分別用限制性內(nèi)切酶xbai/spei、spei在37℃下處理2h，純化并膠回收optcarb表達模塊(約2700bp)和質(zhì)粒optpjn44-carra的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到質(zhì)粒optpjn44-carra/carb。將含ggs1表達模塊的質(zhì)粒pjn44-ggs1和質(zhì)粒optpjn44-carra/carb分別用限制性內(nèi)切酶xbai/spei、spei在37℃下處理2h，純化并膠回收pjn44-ggs1表達模塊(約1900bp)和質(zhì)粒optpjn44-carra/carb的dna片段；將回收的兩個dna片段在nebdna連接酶(neb公司，產(chǎn)品編號：m0367s)作用下進行連接反應(yīng)，得到質(zhì)粒optpjn44-carra/carb/ggs1。3、質(zhì)粒整合至宿主菌的基因組該步驟中，用等體積的質(zhì)粒optpjn44-carra/carb/ggs1替換實施例1步驟3中的質(zhì)粒optpjn44-carra/carb/ggs1/thmg，其他步驟與實施例1的步驟3相同，得到重組菌。實施例2實施例1的重組菌在制備β-胡蘿卜素中的應(yīng)用，具體方法如下：1、一級種子培養(yǎng)：將實施例1的重組菌菌株單克隆接種于含5ml種子培養(yǎng)液的試管中，在28℃、200rpm/min下培養(yǎng)24h，獲得一級種子液；其中種子培養(yǎng)液是按每100ml去離子水中加入2g葡萄糖、2g蛋白胨、酵母粉1g，滅菌后得到。2、發(fā)酵培養(yǎng)：將一級種子液按1％的接種量轉(zhuǎn)接至含50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，在28℃、200rpm/min下培養(yǎng)144h，收集菌液；其中發(fā)酵培養(yǎng)基的是按每100ml去離子水中加入4g葡萄糖、0.251g硫酸銨、0.2g缺少亮氨酸的酵母氮源(drop-outmixsyntheticminusleucinew/oyeastnitrogenbase)、0.17g酵母氮源，滅菌后得到。同時以對比例1、2、3得到的重組菌做對比試驗。利用hplc檢測菌液中β-胡蘿卜素含量，結(jié)果見表1。表1重組菌β-胡蘿卜素產(chǎn)量對比例10對比例20.045mg/gdcw對比例36.16mg/gdcw實施例126.03mg/gdcw由表1可見，當在不產(chǎn)β-胡蘿卜素的宿主菌中導入原生carra和carb基因時(對比例1)，不能合成β-胡蘿卜素，即使將經(jīng)密碼子優(yōu)化的carra和carb基因?qū)胨拗骶?對比例2)，提取的β-胡蘿卜素含量也僅為0.045mg/gdcw，在此基礎(chǔ)上進一步在經(jīng)密碼子優(yōu)化的carra和carb基因中引入ggs1基因(對比例3)，所得β-胡蘿卜素含量雖然有所提高(6.16mg/gdcw)，但β-胡蘿卜素產(chǎn)量仍較低，本發(fā)明通過在經(jīng)密碼子優(yōu)化的carra和carb基因中引入mva途徑中的ggs1和thmg基因(實施例1重組菌)，所得β-胡蘿卜素含量可達到26.03mg/gdcw，β-胡蘿卜素的產(chǎn)量明顯提高，說明本發(fā)明重組菌具有高的產(chǎn)β-胡蘿卜素性能。核苷酸或氨基酸序列表<110>陜西師范大學<120>一種產(chǎn)β-胡蘿卜素的重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用<160>6<210>1<211>1827<212>dna<213>人工序列<400>11atgtctatcctgacctacctggagttccacctgtactacaccctgcctgtcctggctgct61ctgtgttggctgctgaagcccttccactcccagcaggacaacctgaagtacaagttcctg121atgctgatggccgcttctaccgcctccatctgggacaactacattgtgtaccaccgagct181tggtggtactgtcccacctgcgtggtcgccgtcatcggttacgtgcccctggaggagtac241atgttcttcatcattatgaccctgatgaccgtcgctttctctaacttcgtgatgcgatgg301cacctgcacaccttcttcattcgacccaacacctcttggaagcagaccctgctggtccga361ctggtgcccgtctccgctctgctggctatcacctaccacgcctggcacctgaccctgccc421aacaagccctctttctacggctcctgtattctgtggtacgcttgccctgtgctggctatc481ctgtggctgggtgctggcgagtacattctgcgacgacccgtggccgtcctgctgtctatc541gtcattccctccgtgtacctgtgttgggccgacatcgtcgccatttccgctggaacctgg601cacatctctctgcgaacctccaccggcaagatggtggtccctgacctgcctgtggaggag661tgtctgttcttcaccctgattaacaccgtgctggtcttcgctacctgcgctatcgaccga721gctcaggctattctgcacctgtacaagtcttccgtccagaaccagaaccccaagcaggct781atctctctgttccagcacgtgaaggagctggcctgggctttctgcctgcccgaccagatg841ctgaacaacgagctgttcgacgacctgaccatctcctgggacattctgcgaaaggcctct901aagtccttctacaccgcctctgctgtcttcccctcctacgtgcgacaggacctgggagtc961ctgtacgctttctgtcgagccaccgacgacctgtgcgacgacgagtctaagtccgtgcag1021gagcgacgagaccagctggacctgacccgacagttcgtccgagacctgttctctcagaag1081acctccgctcccatcgtgattgactgggagctgtaccagaaccagctgcccgcctcttgt1141atttccgccttccgagctttcacccgactgcgacacgtgctggaggtcgaccctgtggag1201gagctgctggacggctacaagtgggacctggagcgacgacccatcctggacgagcaggac1261ctggaggcctactctgcttgtgtcgcctcttccgtgggagagatgtgcacccgagtcatt1321ctggctcaggaccagaaggagaacgacgcttggatcattgaccgagcccgagagatggga1381ctggtcctgcagtacgtgaacatcgcccgagacattgtgaccgactccgagaccctgggt1441cgatgctacctgccccagcagtggctgcgaaaggaggagaccgagcagatccagcaggga1501aacgcccgatctctgggtgaccagcgactgctgggcctgtccctgaagctggtcggcaag1561gccgacgctatcatggtgcgagctaagaagggaattgacaagctgcctgctaactgtcag1621ggtggagtccgagctgcttgccaggtgtacgccgctattggttctgtgctgaagcagcag1681aagaccacctaccctacccgagctcacctgaagggttccgagcgagctaagatcgccctg1741ctgtctgtctacaacctgtaccagtccgaggacaagcctgtggctctgcgacaggctcga1801aagattaagtctttcttcgtggactag<210>2<211>1749<212>dna<213>人工序列<400>21atgtccgaccagaagaagcacatcgtggtcattggtgctggaatcggtggaaccgctacc61gctgctcgactggctcgagagggcttccgagtgaccgtggtcgagaagaacgacttctcc121ggtggccgatgttctttcatccaccacgacggtcaccgattcgaccagggcccctctctg181tacctgatgcccaagctgttcgaggacgccttcgctgacctggacgagcgaattggcgac241cacctggacctgctgcgatgcgacaacaactacaaggtgcacttcgacgacggagacgct301gtccagctgtcttccgacctgaccaagatgaagggcgagctggaccgaattgagggaccc361ctgggtttcggccgattcctggacttcatgaaggagacccacgtgcactacgagcaggga421accttcatcgccattaagcgaaacttcgagaccatctgggacctgattcgactgcagtac481gtccccgagatcttccgactgcacctgttcggcaagatctacgaccgagcttccaagtac541ttccagaccaagaagatgcgaatggccttcaccttccagaccatgtacatgggaatgtcc601ccctacgacgcccccgctgtgtactctctgctgcagtacaccgagttcgctgagggcatc661tggtacccccgaggaggtttcaacatggtggtccagaagctggagtccattgcttctaag721aagtacggcgccgagttccgataccagtcccccgtggccaagatcaacaccgtcgacaag781gacaagcgagtgaccggagtcaccctggagtctggagaggtcatcgaggccgacgctgtg841gtctgtaacgccgacctggtctacgcttaccaccacctgctgcccccctgcaactggacc901aagaagaccctggcttccaagaagctgacctcttcctctatctctttctactggtccatg961tctaccaaggtgccccagctggacgtccacaacatcttcctggccgaggcttacaaggag1021tccttcgacgagattttcaacgacttcggactgccctccgaggcctctttctacgtgaac1081gtcccctcccgaatcgacgagtctgccgctccccccaacaaggactctatcattgtgctg1141gtccccattggtcacatgaagtccaagaccggcaactctgctgaggagaactaccccgag1201ctggtgaaccgagcccgaaagatggtgctggaggtcatcgagcgacgactgggcgtcaac1261aacttcgccaacctgattgagcacgaggaggtgaacgacccctccgtctggcagtctaag1321ttcaacctgtggcgaggctccatcctgggactgtctcacgacgtgttccaggtcctgtgg1381ttccgaccctccaccaaggactctaccaaccgatacgacaacctgttcttcgtgggagct1441tctacccaccccggaaccggtgtgcccattgtcctggccggatccaagctgacctctgac1501caggtctgtaagtccttcggtcagaaccccctgccccgaaagctgcaggactctcagaag1561aagtacgctcccgagcagacctccaagaccgagtctcactggatctactactgtctggcc1621tgctacttcgtgaccttcctgttcttctacttcttccctcgagacgacaccaccacccct1681gcttccttcattaaccagctgctgcccaacgtgttccaggtccagaactctaacgacatc1741cgaatctag<210>3<211>984<212>dna<213>解脂亞羅酵母（yarrowialipolytica）<400>31atggattataacagcgcggatttcaaggagatatggggcaaggccgccgacaccgcgctg61ctgggaccgtacaactacctcgccaacaaccggggccacaacatcagagaacacttgatc121gcagcgttcggagcggttatcaaggtggacaagagcgatctcgagaccatttcgcacatc181accaagattttgcataactcgtcgctgcttgttgatgacgtggaagacaactcgatgctc241cgacgaggcctgccggcagcccattgtctgtttggagtcccccaaaccatcaactccgcc301aactacatgtactttgtggctctgcaggaggtgctcaagctcaagtcttatgatgccgtc361tccattttcaccgaggaaatgatcaacttgcatagaggtcagggtatggatctctactgg421agagaaacactcacttgcccctcggaagacgagtatctggagatggtggtgcacaagacc481ggtggactgtttcggctggctctgagacttatgctgtcggtggcatcgaaacaggaggac541catgaaaagatcaactttgatctcacacaccttaccgacacactgggagtcatttaccag601attctggatgattacctcaacctgcagtccacggaattgaccgagaacaagggattctgc661gaagatatcagcgaaggaaagttttcgtttccgctgattcacagcatacgcaccaacccg721gataaccacgagattctcaacattctcaaacagcgaacaagcgacgcttcactcaaaaag781tacgccgtggactacatgagaacagaaaccaagagtttcgactactgcctcaagaggata841caggccatgtcactcaaggcaagttcgtacattgatgatctagcagcagctggccacgat901gtctccaagctacgagccattttgcattattttgtgtccacctctgactgtgaggagaga961aagtactttgaggatgcgcagtga<210>4<211>1521<212>dna<213>解脂亞羅酵母（yarrowialipolytica）<400>41gccacccgagaagttgtgcgaacccagtctgtgaaggtggttgagaagcacgttcctatc61gtcattgagaagcccagcgagaaggaggaggacacctcttctgaagactccattgagctg121actgtcggaaagcagcccaagcccgtgaccgagacccgttctctggacgacctagaggct181atcatgaaggcaggtaagaccaagcttctggaggaccacgaggttgtcaagctctctctc241gagggcaagcttcctttgtatgctcttgagaagcagcttggtgacaacacccgagctgtt301ggcatccgacgatctatcatctcccagcagtctaataccaagactttagagacctcaaag361cttccttacctgcactacgactacgaccgtgtttttggagcctgttgcgagaacgttatt421ggttacatgcctctccccgttggtgttgctggccccatgaacattgatggcaagaactac481cacattcctatggccaccactgagggttgtcttgttgcctcaaccatgcgaggttgcaag541gccatcaacgccggtggcggtgttaccactgtgcttactcaggacggtatgacacgaggt601ccttgtgtttccttcccctctctcaagcgggctggagccgctaagatctggcttgattcc661gag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