本發(fā)明涉及生物發(fā)酵技術領域，具體涉及一株通過誘變選育得到的銅綠假單胞菌，以及該銅綠假單胞菌的應用。

背景技術：

生物表面活性劑是一種由微生物合成的，結(jié)構多樣的表面活性劑，包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂及中性類脂衍生物等。表面活性劑一般由親水性基團和疏水性基團構成。鼠李糖脂屬于糖脂類的一種陰離子生物表面活性劑，具有良好的洗滌、乳化、增溶、潤濕、滲透等性能，且具有良好的生物降解性。在生物能源、石油化工、生物醫(yī)藥、食品及日化等領域有較大應用前景。

鼠李糖脂的親水基團一般由1-2分子的鼠李糖構成，疏水基團則由1-2分子具有不同碳鏈長度的飽和或不飽和酸構成。在發(fā)酵產(chǎn)物中，一般存在4種主要組成成分，分別是rha2c10c10，rhac10c10，rha2c10，rhac10。一般鼠李糖脂能使水的表面張力從72mn/m²降到30mn/m²左右，有良好的表面活性。鼠李糖脂能乳化長鏈烷烴化合物、芳香族化合物、油脂等，并保持其穩(wěn)定性。

目前鼠李糖脂產(chǎn)量一般為30-40g/l左右，底物轉(zhuǎn)化率相對較低。例如，cn1891831a公開的rl最大產(chǎn)量僅為23g/l，時進剛等報道的銅綠假單胞菌ab93066鼠李糖脂產(chǎn)量為30-40g/l，產(chǎn)率為0.67g/g底物。一般主要以植物油為碳源發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂，原料成本較高。目前較低的產(chǎn)量和過高的生產(chǎn)成本限制了鼠李糖脂在工業(yè)上廣泛的應用，因此獲得一株高產(chǎn)菌株和能利用低成本或廢棄的原料，對于鼠李糖脂工業(yè)化生產(chǎn)至關重要。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于：培育一株新的銅綠假單胞菌菌株，使其能夠遺傳穩(wěn)定且高產(chǎn)鼠李糖脂；

本發(fā)明的目的之二在于：提供所述銅綠假單胞菌菌株的應用，可同時利用廉價的粗甘油和地溝油協(xié)同作用，有利于菌體生長和鼠李糖脂的生產(chǎn)；

本發(fā)明的目的之三在于：提供所述銅綠假單胞菌菌株產(chǎn)物鼠李糖脂的分離提取方法。

為了解決本發(fā)明的技術問題，本發(fā)明采用的技術方案為：

一株鼠李糖脂高產(chǎn)菌，其分類命名為銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）kt1115，已于2016年11月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心cctcc，地址：中國武漢武漢大學，保藏號cctccm2016686。

所述菌株的分類學特征：菌體大小0.5-0.8μm×1.5-3.0μm，菌落扁平，邊緣不整齊。

所述的銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）kt1115，采用artp生物誘變，并利用藍色凝膠平板篩選，經(jīng)搖瓶發(fā)酵復篩獲得遺傳性狀穩(wěn)定且高產(chǎn)鼠李糖脂的銅綠假單胞菌目的菌株。

所述鼠李糖脂高產(chǎn)菌在發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂中的應用，包括如下步驟：

1）種子培養(yǎng)：將保存于-80℃的銅綠假單胞菌kt1115取5-10μl接種至lb種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過夜培養(yǎng)；

2）產(chǎn)脂培養(yǎng)基：將種子液按1-8%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，ph6.0-8.0，30-37℃，200rpm，培養(yǎng)6-9天；

3）將步驟2）得到的發(fā)酵液進行鼠李糖脂的提取，依次將發(fā)酵液離心取上清、酸沉降、有機溶劑萃取后得鼠李糖脂。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為（%為質(zhì)量分數(shù)）：碳源1.0%~10%、氮源0.5%~5.0%、磷酸鹽0.05%~0.5%、金屬離子0.01%~0.05%，所述碳源為葡萄糖、蔗糖、豆油、粗甘油、地溝油等，所述氮源為硝酸鈉、酵母粉、酵母浸膏、蛋白胨等，所述磷酸鹽為kh2po4、na2hpo4·12h2o，所述金屬離子mg²⁺、fe²⁺或者ca²⁺中的至少一種，ph6.0。

經(jīng)過優(yōu)化實驗，最終得到最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為（%為質(zhì)量分數(shù)）：粗甘油1.0%，地溝油6.0%，酵母浸膏1.0%，nano30.8%，kh2po40.1%，na2hpo4·12h2o0.1%，mgso40.01%，feso4.7h2o0.02%，cacl2·2h2o0.01%，ph6.8。

步驟3）中從發(fā)酵液中提取鼠李糖脂的具體過程如下：

a)離心取上清：加入等體積的正己烷，離心（4100rpm，4℃，30min）取上清；

b)酸沉降：將上述上清液調(diào)節(jié)ph2-3，4℃過夜沉降，離心（4100rpm，4℃，30min）收集沉淀；

c)有機溶劑萃取：用原發(fā)酵液1:1.25的乙酸乙酯萃取兩次，蒸干溶劑得鼠李糖脂粗品，待測。

上述步驟a）中，加入正己烷為了分離未轉(zhuǎn)化的地溝油。

先用2-溴代苯乙酮和三乙胺對鼠李糖脂進行衍生化，再進行hplc-uv檢測，詳見markusmichaelmüller。

所述菌株發(fā)酵液的性質(zhì)：排油圈直徑為7.9cm，水的表面張力降低至為24.8mn/m²，乳化值為80%。

有益效果：

本發(fā)明采用artp生物誘變，利用藍色凝膠平板篩選，再經(jīng)搖瓶發(fā)酵復篩獲得遺傳性狀穩(wěn)定且高產(chǎn)鼠李糖脂的銅綠假單胞菌目的菌株。

利用本發(fā)明的菌株和工藝進行發(fā)酵，以廉價的粗甘油和地溝油為復合碳源，大幅降低生產(chǎn)成本，粗甘油促進菌體生長，同時地溝油提供長鏈脂肪酸，有助于鼠李糖脂的生成，以nano3和酵母浸膏為復合氮源，按5%的接種量接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為35℃，初始ph為6.8進行發(fā)酵，最終得到鼠李糖脂的產(chǎn)量達到較高水平50.7g/l，相較于未誘變的菌體產(chǎn)量提高了18.1倍，并具有較高的轉(zhuǎn)化率0.75g/g。該菌株能利用廉價的粗甘油和地溝油，并且鼠李糖脂的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率均在較高水平，因此該菌株在進一步工業(yè)化應用中有較好的前景。同時鼠李糖脂能將水的表面張力降低至24.8mn/m²，對石蠟的乳化值達到了80%，具有優(yōu)良的表面活性。

附圖說明

圖1不同碳源條件下菌株kt1115的生長量和鼠李糖脂的產(chǎn)量；

圖2在不同濃度的地溝油對菌株kt1115的生長量和鼠李糖脂的產(chǎn)量的影響；

圖3不同氮源條件下菌株kt1115的生長量和鼠李糖脂的產(chǎn)量；

圖4不同濃度的nano3對菌株kt1115生長量和鼠李糖脂產(chǎn)量的影響。

具體實施方式

以下實施例中所采用的粗甘油為甘油含量小于93%的甘油。

地溝油來源：食堂的油炸廢油和剩飯、剩菜的浮油—南京工業(yè)大學江浦校區(qū)東苑食堂。從食堂收集的地溝油，先靜置12h，用定性濾紙過濾；再將濾液靜置12h，用定性濾紙過濾，得濾液為實驗用地溝油。

實施例1

本實施例說明將銅綠假單胞菌原始菌株進行artp誘變，并進行初篩、復篩，篩選優(yōu)良銅綠假單胞菌的方法。

銅綠假單胞菌原始菌株cicc21100來源于cicc，具體方法如下：

以氦氣為氣體，通氣流量為10l/min，作用距離2mm，作用功率120w。將培養(yǎng)好銅綠假單胞菌cicc21100的種子用0.9%的生理鹽水稀釋至od600=0.6，取10μl菌液均勻涂布于無菌小鐵片上，風干后放入育種機中進行誘變120s，獲得正向突變株。

其中，所使用的培養(yǎng)基配方（%為質(zhì)量百分比）：

藍色凝膠平板初篩：葡萄糖2.0%，kh2po40.07%，na2hpo40.09%，nano30.2%，mgso4·7h2o0.04%，cacl2·2h2o0.01%，ctab0.02%，亞甲基藍0.0005%，瓊脂1.5%，2ml/l微量元素溶液。微量元素溶液（%）：feso4·7h2o0.2%，mnso4·h2o0.15%。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1.0%，ph7.0。

產(chǎn)脂培養(yǎng)基：粗甘油1%，nano30.5%，kh2po40.1%，na2hpo4·12h2o0.1%，mgso40.01%，feso4·7h2o0.02%，cacl2·2h2o0.01%，ph6.0。

篩選步驟：

1、藍色凝膠平板篩選：

將經(jīng)artp生物誘變處理后的樣品進行一定的稀釋倍數(shù)，以未處理的樣品作為對照涂布于藍色凝膠平板上，溫度37℃培養(yǎng)3-4天，挑選藍色暈圈直徑與菌落直徑之比大的菌落，在藍色凝膠平板進行轉(zhuǎn)點。

2、試管復篩：

將上述篩出的30個菌落分別接種于5ml種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，200rpm震蕩培養(yǎng)12h，進行試管發(fā)酵。

3、發(fā)酵搖瓶篩選：

將種子液（接種量6%）轉(zhuǎn)接到產(chǎn)脂培養(yǎng)基（50ml/250ml）中，培養(yǎng)溫度30℃，200rpm，培養(yǎng)6-9天。

通過測定排油圈、表面張力和乳化值來進一步篩選菌株。

1）排油圈的測定

在培養(yǎng)皿中倒入20ml無菌水，在表層中央滴入20μl液體石蠟，使石蠟在水層表面均勻鋪開，然后在油膜中央滴加10μl稀釋一定倍數(shù)的發(fā)酵液上清，測定排油圈直徑，選取排油圈直徑較大的菌株。2）表面張力的測定將發(fā)酵液在4℃、12000rpm、離心20min，去除細胞沉淀，留下發(fā)酵液上清。采用qbzy-1型表面張力測定儀測定經(jīng)過適當稀釋發(fā)酵液上清的表面張力。測定時，以去離子水和空白發(fā)酵液培養(yǎng)基為對照。每次測量前鉑金板分別用蒸餾水和丙酮沖洗干凈，然后再放到火焰上燒干。3）乳化性能的測定取若干帶有刻度的試管，試管中加入5ml液體石蠟和5ml發(fā)酵液上清，旋渦震蕩5min，室溫下使其靜置24h，測定乳化性能。乳化性力用乳化指數(shù)e24來表示。e24=乳化層高度/液面總高度×100%

出發(fā)菌株銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）經(jīng)artp生物誘變處理后，通過藍色凝膠平板篩得30株菌，將其進行搖瓶復篩產(chǎn)鼠李糖脂實驗，得到7株表面活性較好的菌株，結(jié)果見表1。

表1菌株21100的誘變選育結(jié)果

注：帶*為突變株kt1115在實施例3以地溝油為唯一碳源所生產(chǎn)鼠李糖脂的產(chǎn)量

采用藍色凝膠平板初篩，后經(jīng)搖瓶復篩，篩得上述7株增幅較大的菌株。其中正突變株kt1115產(chǎn)鼠李糖脂量最高，為5.2g/l，比出發(fā)菌株提高了85.7%。

實施例2

本實施例說明突變株kt1115的傳代穩(wěn)定性及分類學特征。

將突變株kt1115每隔12h進行傳代發(fā)酵培養(yǎng)，并檢測每一代發(fā)酵液的鼠李糖脂產(chǎn)量，觀察是否出現(xiàn)回復突變。其結(jié)果見表2所示。

表2不同代數(shù)菌株kt1115的鼠李糖脂產(chǎn)量

從實驗結(jié)果可知，經(jīng)過7次連續(xù)傳代，突變株kt1115產(chǎn)鼠李糖脂的量較穩(wěn)定，具有較好的傳代穩(wěn)定性，可作為進一步研究和開發(fā)的生產(chǎn)菌株。

突變株kt1115的分類學特征：菌體大小0.5-0.8μm×1.5-3.0μm，有單端鞭毛。菌落扁平，邊緣不整齊。

實施例3

本實施例說明銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）菌株kt1115發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂以地溝油為唯一碳源。

地溝油的預處理：從食堂收集的地溝油，先靜置12h，用定性濾紙過濾；再將濾液靜置12h，用定性濾紙過濾，得濾液為實驗用地溝油。

本實施例所述的培養(yǎng)基配方（%為質(zhì)量分數(shù)）：

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1.0%，ph7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：地溝油1.0%，nano30.5%，kh2po40.1%，na2hpo4·12h2o0.1%，mgso40.01%，feso4·7h2o0.02%，cacl2·2h2o0.01%，ph6.0。

將保存于-80℃的銅綠假單胞菌kt1115取5μl接種至5mllb種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過夜培養(yǎng)。將種子液按6%的接種量接種至產(chǎn)脂培養(yǎng)基（50ml/250ml）中，30℃，200rpm，培養(yǎng)6-9天，結(jié)果見表1。如表所示，以地溝油為唯一碳源時，突變菌株kt1115產(chǎn)鼠李糖脂最高為10.0g/l。

實施例4

本實施例說明銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）菌株kt1115發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的優(yōu)化工藝。

本實施例所述的培養(yǎng)基配方（%為質(zhì)量分數(shù)）：

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1.0%，ph7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖、蔗糖、豆油、粗甘油、地溝油中取其一1.0%，nano30.5%，kh2po40.1%，na2hpo4·12h2o0.1%，mgso40.01%，feso4·7h2o0.02%，cacl2·2h2o0.01%，ph6.0。

將保存于-80℃的銅綠假單胞菌kt1115取5μl接種至5mllb種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過夜培養(yǎng)。將種子液按6%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml/250ml）中，30℃，200rpm，培養(yǎng)6-9天，發(fā)酵結(jié)果見圖1。發(fā)酵8天以后，以地溝油為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，產(chǎn)鼠李糖脂的量最大為10.0g/l，以粗甘油為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，菌體生長最好，因此決定以地溝油和粗甘油兩者為復合碳源。

確定再次優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基（%為質(zhì)量分數(shù)）：粗甘油1.0%，nano30.5%，kh2po40.1%，na2hpo4·12h2o0.1%，mgso40.01%，feso4·7h2o0.02%，cacl2·2h2o0.01%，ph6.0。添加不同濃度的地溝油，分別為2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%。

將保存于-80℃的銅綠假單胞菌kt1115取5μl接種至5mllb種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過夜培養(yǎng)。將種子液按6%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml/250ml）中，30℃，200rpm，培養(yǎng)6-9天，結(jié)果見圖2。發(fā)酵8天以后，當添加有機碳源地溝油的濃度為6.0%的時候，鼠李糖脂的產(chǎn)量達到了最大為36.6g/l。

實施例5

本實施例說明銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）菌株kt1115發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的工藝。

本實施例所述的培養(yǎng)基配方（%為質(zhì)量分數(shù)）：

平板培養(yǎng)：蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1.0%，瓊脂2.0%，ph7.0。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1.0%，ph7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：粗甘油1.0%，地溝油6.0%，硝酸鈉、酵母粉、蛋白胨中取其一，無機氮源0.5%，有機氮源1.0%，kh2po40.1%，na2hpo4·12h2o0.1%，mgso40.01%，feso4·7h2o0.02%，cacl2·2h2o0.01%，ph6.0。

將保存于-80℃的銅綠假單胞菌kt1115取5μl接種至5mllb種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過夜培養(yǎng)。將種子液按6%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml/250ml）中，30℃，200rpm，培養(yǎng)6-9天，結(jié)果見圖3。發(fā)酵8天以后，以nano3為氮源的已優(yōu)化碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，產(chǎn)鼠李糖脂的量最大為25.5g/l，以酵母浸膏為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，菌體生長最好，因此以nano3和酵母浸膏為復合氮源。

確定再次優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基（%為質(zhì)量分數(shù)）：粗甘油1.0%，地溝油6.0%，酵母粉1.0%，kh2po40.1%，na2hpo4·12h2o0.1%，mgso40.01%，feso4·7h2o0.02%，cacl2·2h2o0.01%，ph6.0。添加不同濃度的nano3，分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%。

將保存于-80℃的銅綠假單胞菌kt1115取5μl接種至5mllb種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過夜培養(yǎng)。將種子液按6%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml/250ml）中，30℃，200rpm，培養(yǎng)6-9天，結(jié)果見圖4。發(fā)酵8天以后，當添加無機氮源nano3的濃度為0.8%的時候，鼠李糖脂的產(chǎn)量達到了最大為42.3g/l。

實施例6

本實施例說明銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）菌株kt1115發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的工藝。

本實施例所述的培養(yǎng)基配方（%為質(zhì)量分數(shù)）：

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1.0%，ph7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：粗甘油1.0%，地溝油6.0%，酵母粉1.0%，nano30.8%，kh2po40.1%，na2hpo4·12h2o0.1%，mgso40.01%，feso4.7h2o0.02%，cacl2·2h2o0.01%，ph6.0-8.0。

將保存于-80℃的銅綠假單胞菌kt1115取5μl接種至5mllb種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過夜培養(yǎng)。將種子液按6%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml/250ml）中，ph分別為6.0、6.5、6.8、7.0、7.5、8.0，30℃，200rpm，培養(yǎng)6-9天。當ph為6.8時，在中性偏酸條件下，鼠李糖脂產(chǎn)量最高為45.2g/l，因此6.8為最佳的初始ph。

實施例7

本實施例說明銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）菌株kt1115發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的工藝。

本實施例所述的培養(yǎng)基配方（%為質(zhì)量分數(shù)）：

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1.0%，ph7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：粗甘油1.0%，地溝油6.0%，酵母粉1.0%，nano30.8%，kh2po40.1%，na2hpo4·12h2o0.1%，mgso40.01%，feso4.7h2o0.02%，cacl2·2h2o0.01%，ph6.8。

將保存于-80℃的銅綠假單胞菌kt1115取5μl接種至5mllb種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過夜培養(yǎng)。將種子液按6%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml/250ml）中，ph6.8，在不同溫度條件下，30℃、35℃、37℃，200rpm，培養(yǎng)6-9天。當溫度為35℃時，菌體產(chǎn)鼠李糖脂最高為48.7g/l。

實施例8

本實施例說明銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）菌株kt1115發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的工藝。

本實施例所述的培養(yǎng)基配方（%為質(zhì)量分數(shù)）：

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1.0%，ph7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：粗甘油1.0%，地溝油6.0%，酵母粉1.0%，nano30.8%，kh2po40.1%，na2hpo4·12h2o0.1%，mgso40.01%，feso4.7h2o0.02%，cacl2·2h2o0.01%，ph6.8。

將保存于-80℃的銅綠假單胞菌kt1115取5μl接種至5mllb種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過夜培養(yǎng)。發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂將種子液按2%、4%、5%、6%、8%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（50ml/250ml）中，ph6.8，35℃，200rpm，培養(yǎng)6-9天。當接種量為5%時，測得的鼠李糖脂產(chǎn)量最高為50.7g/l。

實施例8

本實施例說明綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）菌株kt1115發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的提取和檢測方法。

取適當發(fā)酵液加入等體積的正己烷，離心（4100rpm，4℃，30min）取上清；將上述上清液調(diào)節(jié)至ph2-3，4℃過夜沉降，離心（4100rpm，4℃，30min）收集沉淀；用原發(fā)酵液1:1.25的乙酸乙酯萃取兩次，蒸干溶劑得鼠李糖脂粗品，待測。

先用1：1的40mm的2-溴代苯乙酮和20mm的三乙胺對鼠李糖脂進行衍生化，60℃反應1h，再進行hplc-uv檢測，條件如下：

hplc儀器：agilent1260；色譜柱：c185μm4.6*250mm；流動相：5%甲醇（溶液a）、95%甲醇（溶液b）；洗脫條件：0-17min溶液b80%-100%、

17-25min溶液b100%、25-30min溶液b100%-80%、30-35min溶液b80%；流速：0.4ml/min；檢測波長：254nm。