相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)為申請(qǐng)日為2012年10月26日，申請(qǐng)?zhí)枮?01280060540.8的中國(guó)申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。原申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2011年10月28日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/552,582和61/552,587以及申請(qǐng)日為2012年9月14日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/700,908的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本申請(qǐng)。

本發(fā)明涉及基因修飾的非人動(dòng)物例如嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)，其表達(dá)人源或人源化的主要組織相容性復(fù)合物(mhc)i類分子。本發(fā)明還涉及基因修飾的非人動(dòng)物，例如小鼠或大鼠，其表達(dá)人源或人源化的mhci蛋白(例如mhciα鏈)和/或人源或人源化的β2微球蛋白；及表達(dá)人源或人源化的mhci蛋白(例如mhciα鏈)和/或人源或人源化的β2微球蛋白的胚胎、組織和細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備基因修飾的非人動(dòng)物的方法，所述動(dòng)物表達(dá)人源或人源化的mhci類蛋白(例如mhciα鏈)和/或β2微球蛋白。本發(fā)明還提供了一種在體外人源化細(xì)胞免疫系統(tǒng)或基因修飾的非人動(dòng)物中鑒定和評(píng)估肽的方法，以及修飾非人動(dòng)物例如小鼠或大鼠的mhci和/或β2微球蛋白基因座以表達(dá)人源或人源化的mhci和/或β2微球蛋白的方法。

背景技術(shù)：

在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，通過(guò)b淋巴細(xì)胞(例如免疫球蛋白)和t淋巴細(xì)胞(例如t細(xì)胞受體或tcr)上的受體分子識(shí)別外來(lái)抗原。這些外來(lái)抗原在細(xì)胞表面上以特定蛋白的肽片段遞呈，通常將其稱為主要組織相容性復(fù)合物(mhc)分子。mhc分子由多個(gè)基因座編碼，已發(fā)現(xiàn)其為跨距約4mb的連鎖的基因簇。在小鼠中，mhc基因位于17號(hào)染色體上，并且由于歷史原因被稱為組織相容性2(h-2)基因。在人中，該基因位于6號(hào)染色體上，被稱為人白細(xì)胞抗原(hla)基因。在小鼠和人中，所述基因座是多基因的，其包括三個(gè)在人和小鼠基因組中具有相似構(gòu)造的高多態(tài)性類型的mhc基因(i、ii和iii類)(分別參見圖2和圖3)。

mhc基因座在基因組中顯示出最高的多態(tài)性；一些基因通過(guò)>300個(gè)等位基因代表(例如人hla-drβ和人hla-b)。全部i類和ii類mhc基因均能遞呈為肽片段，但是各基因表達(dá)具有不同結(jié)合特性的蛋白，這反映了多態(tài)性和等位基因變體。在免疫應(yīng)答過(guò)程中任何具有獨(dú)特肽片段范圍的給定個(gè)體均能夠遞呈被遞呈至b和t細(xì)胞的細(xì)胞表面。

人與小鼠均具有i類mhc基因(參見圖2和圖3)。在人中，經(jīng)典的i源基因被稱為hla-a、hla-b和hla-c，而在小鼠中被稱為h-2k、h-2d和h-2l。i類分子由兩條鏈組成：多態(tài)性的α-鏈(有時(shí)被稱為重鏈)和被稱為β2-微球蛋白的較小的鏈(也被稱為輕鏈)，其通常不具有多態(tài)性(圖1)。這兩條鏈在細(xì)胞表面上形成非共價(jià)的異源二聚體。所述α-鏈包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域(α1、α2和α3)。α鏈基因的外顯子1編碼先導(dǎo)序列，外顯子2和3編碼α1和α2結(jié)構(gòu)域，外顯子4編碼α3結(jié)構(gòu)域，外顯子5編碼跨膜結(jié)構(gòu)域，而外顯子6和7編碼胞質(zhì)尾區(qū)。α-鏈形成含有α1和α2結(jié)構(gòu)域的肽結(jié)合縫隙(類似于ig-樣結(jié)構(gòu)域)接著為類似于β2-微球蛋白的α3結(jié)構(gòu)域。

β2微球蛋白是一種非糖基化的12kda蛋白；其功能之一在于穩(wěn)定mhci類α-鏈。與α-鏈不同，所述β2微球蛋白不跨膜。所述人源β2微球蛋白的基因座在15號(hào)染色體上，而鼠源的基因座在2號(hào)染色體上。β2微球蛋白的基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。循環(huán)形式的β2微球蛋白存在于血清、尿液和其他體液中；因此，非共價(jià)mhci結(jié)合的β2微球蛋白在生理?xiàng)l件下能夠與循環(huán)β2微球蛋白進(jìn)行交換。

i類mhc分子在所有有核細(xì)胞中表達(dá)，包括腫瘤細(xì)胞。其特異性地在t和b淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞以及其他細(xì)胞上表達(dá)并且其功能為在cd8+細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)表面展示肽片段(長(zhǎng)度通常為8-10個(gè)氨基酸)。ctl通過(guò)其自身的膜結(jié)合tcr特異性地殺傷攜帶mhci結(jié)合肽的任意細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞展示非正常存在的細(xì)胞蛋白來(lái)源的肽(例如病毒、腫瘤或其他非自身來(lái)源)時(shí)，這種肽被ctl所識(shí)別，ctl被激活并殺傷展示該肽的細(xì)胞。

通常，由于存在耐受機(jī)制，遞呈正常(即自身)蛋白在mhci分子環(huán)境下的遞呈不會(huì)引發(fā)ctl的激活。然而，在一些疾病(例如癌癥、自身免疫性疾病)中來(lái)源于自身蛋白的肽成為免疫系統(tǒng)的靶細(xì)胞成分，結(jié)果導(dǎo)致遞遞呈這種肽的細(xì)胞受到破壞。盡管在識(shí)別一些激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的自身來(lái)源抗原(例如與多種癌癥相關(guān)的抗原)的方面已有進(jìn)展，但是為了改進(jìn)通過(guò)mhci類分子被人ctl所識(shí)別的肽的鑒定，仍需要體內(nèi)和體外系統(tǒng)來(lái)模擬人源細(xì)胞免疫系統(tǒng)的各個(gè)方面。模擬人源細(xì)胞免疫系統(tǒng)的系統(tǒng)可用于鑒定與疾病相關(guān)的抗原從而開發(fā)人體治療產(chǎn)品例如疫苗和其他生物制品。在人源免疫系統(tǒng)中評(píng)估抗原識(shí)別的系統(tǒng)能夠輔助鑒定對(duì)治療有用的ctl群(例如對(duì)研究和防治人類疾病是有用的)。這種系統(tǒng)還能夠輔助增強(qiáng)人ctl群的活性以便更有效地對(duì)抗感染和攜帶外來(lái)抗原的實(shí)體。因此，需要一種能夠產(chǎn)生免疫系統(tǒng)的生物系統(tǒng)(例如基因改造的動(dòng)物)，所述免疫系統(tǒng)展示模擬人免疫系統(tǒng)功能的組分。

發(fā)明概述

本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N用于產(chǎn)生或鑒定肽的生物系統(tǒng)，所述的肽與mhci類蛋白及其嵌合體相聯(lián)，并且與cd8+t細(xì)胞結(jié)合。本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人動(dòng)物，其包含表達(dá)在細(xì)胞免疫應(yīng)答中具有功能的人源或人源化的分子的非人細(xì)胞。本申請(qǐng)還提供了編碼人源或人源化的mhci和β2微球蛋白的人源化的嚙齒動(dòng)物基因座。本申請(qǐng)還提供了表達(dá)人源或人源化的mhci和β2微球蛋白的人源化的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞。本申請(qǐng)?zhí)峁┝税嗽椿膰X動(dòng)物細(xì)胞的體內(nèi)和體外系統(tǒng)，其中所述嚙齒動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)一個(gè)或多個(gè)人源或人源化的免疫系統(tǒng)分子。

本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人動(dòng)物例如嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)，在其基因組中包含編碼人源/非人源(例如人/嚙齒動(dòng)物，例如人/小鼠或人/大鼠)嵌合mhci多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人源部分包含人mhci多肽的胞外結(jié)構(gòu)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明提供了一種非人動(dòng)物，其在內(nèi)源性mhci基因座包含編碼人源/非人源嵌合mhci多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人源部分包含人mhci多肽的胞外結(jié)構(gòu)域，并且其中所述動(dòng)物表達(dá)人源/非人源嵌合mhci多肽。在一個(gè)方面，所述動(dòng)物在內(nèi)源性非人源mhci基因座不表達(dá)內(nèi)源性非人源mhci多肽的胞外結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)包含兩個(gè)拷貝的mhci基因座，其中包含編碼人源/非人源(例如人/嚙齒動(dòng)物，例如人/小鼠或人/大鼠)嵌合mhci多肽的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述動(dòng)物包含一個(gè)拷貝的mhci基因座，其中包含編碼人源/非人源嵌合mhci多肽的核苷酸序列。因此，所述動(dòng)物針對(duì)包含編碼人源/非人源嵌合mhci多肽的核苷酸序列的mhci基因座可以是純合子或雜合子。在不同的實(shí)施方式中，編碼人源/非人源嵌合mhci多肽的核苷酸序列被包含在非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如大鼠或小鼠)的生殖細(xì)胞中。

在一個(gè)方面，所述編碼人源/非人源嵌合mhci的核苷酸序列可操作地與內(nèi)源性非人源調(diào)控元件連接，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子等。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合多肽的人源部分包含人先導(dǎo)序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合多肽的人源部分包含人mhci多肽的α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域。所述人mhci多肽可以選自以下組：hla-a、hla-b和hla-c。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人mhci多肽是hla-a2多肽，例如hla-a2.1多肽。

在一個(gè)方面，所述基因改造的非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物是小鼠。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述內(nèi)源性非人源的基因座是小鼠基因座，例如小鼠h-2k、h-2d或h-2l基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源/非人源嵌合mhci多肽的非人源部分包含內(nèi)源性非人源mhci多肽的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，其中所述非人動(dòng)物是小鼠，所述內(nèi)源性非人源mhci基因座可以是h-2k基因座(例如h-2kb基因座)以及所述內(nèi)源性非人源hmci多肽可以是h-2k多肽；因此，所述人源/非人源嵌合mhci多肽可以包含h-2k多肽的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方式中，其中所述非人動(dòng)物是小鼠，所述內(nèi)源性非人源mhci基因座可以是h-2d基因座以及所述內(nèi)源性非人源mhci多肽可以是h-2d多肽；因此，所述人源/非人源嵌合mhci多肽可以包含h-2d多肽的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。類似地，在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述內(nèi)源性非-mhci基因座可以是h-2l基因座且所述內(nèi)源性非人源mhci多肽可以是h-2l多肽；因此，人源/非人源嵌合mhci多肽可以包含h-2l多肽的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

本申請(qǐng)還提供了在內(nèi)源性h-2k基因座包含編碼人源/小鼠嵌合mhci多肽的核苷酸序列的小鼠，其中所述嵌合多肽的人源部分包含人hla-a(例如hla-a2)多肽的胞外結(jié)構(gòu)域和小鼠部分包含小鼠h-2k多肽的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，并且其中所述小鼠表達(dá)人源/小鼠嵌合mhci多肽。在一些實(shí)施方式中，所述小鼠不表達(dá)來(lái)自內(nèi)源性h-2k基因座的小鼠h-2k多肽胞外結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面，編碼人源/小鼠嵌合mhci多肽的核苷酸序列可操作地與內(nèi)源性小鼠調(diào)控元件連接。所述嵌合多肽的人源部分可以包含人先導(dǎo)序列。其還可以包含人mhci多肽的α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域。所述人mhci多肽可以是hla-a多肽，例如hla-a2.1多肽。在一個(gè)方面，所述小鼠h-2k基因座是h-2kb基因座。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種非人動(dòng)物例如嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)，在所述動(dòng)物的基因組中包含編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人動(dòng)物，所述動(dòng)物在內(nèi)源性非人源β2微球蛋白基因座包含編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，其中所述動(dòng)物表達(dá)人源或人源化β2微球蛋白多肽。在一個(gè)方面，所述動(dòng)物不表達(dá)來(lái)自內(nèi)源性非人源β2微球蛋白基因座的功能性內(nèi)源性非人源β2微球蛋白多肽。在一個(gè)方面，所述動(dòng)物包含兩個(gè)拷貝的編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的β2微球蛋白基因座；在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述動(dòng)物包含一個(gè)拷貝的編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的β2微球蛋白基因座。因此，所述動(dòng)物針對(duì)編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的β2微球蛋白基因座可以是純合子或雜合子。在多種實(shí)施方式中，編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列被包含在所述非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如大鼠或小鼠)的生殖細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包含編碼含有人β2微球蛋白氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽能夠與mhci蛋白結(jié)合。

在一些實(shí)施方式中，編碼所述人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列可操作地與內(nèi)源性非人源β2微球蛋白調(diào)控元件連接。在一個(gè)方面，編碼所述人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包含人源β2微球蛋白基因外顯子2至外顯子4中所示的核苷酸序列。在另一個(gè)方面，編碼所述人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包含人β2微球蛋白基因外顯子2、3和4中所示的核苷酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述核苷酸序列還包括非人源β2微球蛋白基因外顯子1中所示的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)；因此，所述非人源β2免疫球蛋白基因座是嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)β2免疫球蛋白基因座。

本申請(qǐng)還提供了一種小鼠，所述小鼠在內(nèi)源性β2微球蛋白基因座包含編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，其中所述小鼠表達(dá)所述人源或人源化的β2微球蛋白多肽。在一些實(shí)施方式中，所述小鼠不表達(dá)來(lái)自內(nèi)源性β2微球蛋白基因座的功能性內(nèi)源性小鼠β2微球蛋白。所述核苷酸序列可以與內(nèi)源性小鼠調(diào)控元件連接。在一個(gè)方面，所述核苷酸序列包含人β2微球蛋白基因外顯子2至外顯子4中所示的核苷酸序列?；蛘?，編碼所述人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列可以包含人β2微球蛋白基因外顯子2、3和4中所示的核苷酸序列。編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列可以進(jìn)一步包含小鼠β2微球蛋白基因外顯子1的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列可以包含編碼含有人源β2微球蛋白氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽能夠與mhci蛋白結(jié)合。

本發(fā)明進(jìn)一步包含一種非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)，所述動(dòng)物在其基因組中包含編碼人源/非人源嵌合mhci多肽的核苷酸序列以及編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種非人動(dòng)物，所述動(dòng)物在其基因組中包含編碼人源/非人源mhci多肽的第一核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人源部分包含人mhci多肽的胞外結(jié)構(gòu)域；以及編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列位于內(nèi)源性非人源mhci基因座，和所述第二核苷酸序列位于內(nèi)源性非人源β2微球蛋白基因座，并且其中所述動(dòng)物表達(dá)人源/非人源嵌合mhci多肽和人源或人源化β2微球蛋白多肽。在一個(gè)方面，所述動(dòng)物是小鼠。因此，所述內(nèi)源性mhci基因座可以選自下組：h-2k、h-2d和h-2l基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述內(nèi)源性小鼠基因座是h-2k基因座(例如h-2kb基因座)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人mhci多肽選自以下組：hla-a、hla-b和hla-c多肽。在一個(gè)方面，所述人mhci多肽是hla-a，例如hla-a2(例如hla-a2.1)。在多種實(shí)施方式中，所述第一和第二核苷酸序列被包含在所述非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)的生殖細(xì)胞中。

因此，本發(fā)明提供了一種小鼠，所述小鼠在其基因組中包含編碼人源/小鼠嵌合mhci多肽的第一核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人源部分包含人hla-a(例如hla-a2)的胞外結(jié)構(gòu)域和小鼠部分包含小鼠h-2k的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域；以及編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列位于內(nèi)源性h-2k基因座和所述第二核苷酸序列位于內(nèi)源性小鼠β2免疫球蛋白基因座，以及其中所述小鼠表達(dá)人源/小鼠嵌合mhci多肽和人源或人源化β2微球蛋白多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含嵌合mhci多肽和人源或人源化β2微球蛋白多肽的所述非人動(dòng)物(例如所述小鼠)在其各自的內(nèi)源性基因座不表達(dá)內(nèi)源性非人源mhci多肽(例如小鼠h-2k多肽)的胞外結(jié)構(gòu)域和/或功能性內(nèi)源性非人源(例如小鼠)β2微球蛋白多肽。在一個(gè)方面，所述動(dòng)物(例如所述小鼠)分別包含兩個(gè)拷貝的第一和第二核苷酸序列。在另一個(gè)方面，所述動(dòng)物(例如所述小鼠)包含一個(gè)拷貝的第一和一個(gè)拷貝的第二核苷酸序列。因此，所述動(dòng)物針對(duì)第一和第二核苷酸序列都可以是純合子或雜合子。

在一個(gè)方面，所述第一核苷酸序列可操作地與內(nèi)源性非人源(例如小鼠)mhci調(diào)控元件連接，并且所述第二核苷酸序列可操作地與內(nèi)源性非人源(例如小鼠)β2微球蛋白元件連接。所述嵌合多肽的人源部分可以包含人源mhci多肽的1、2和3結(jié)構(gòu)域。所述第二核苷酸序列可以包含人β2微球蛋白基因外顯子2至外顯子4中所示的核苷酸序列?；蛘?，所述第二核苷酸序列可以包含人β2微球蛋白基因外顯子2、3和4中所示的核苷酸序列。在一個(gè)方面，包含嵌合mhci多肽和人源或人源化β2微球蛋白多肽的所述小鼠可以是這樣的，與不表達(dá)人源或人源化β2微球蛋白多肽時(shí)人源/小鼠嵌合mhci多肽的表達(dá)情況相比，人源或人源化β2微球蛋白的表達(dá)使得人源/小鼠嵌合mhci多肽的表達(dá)量增加。

本發(fā)明還提供了一種制備本申請(qǐng)所述的基因改造的非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)的方法。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種修飾嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)的mhci基因座以表達(dá)人源/嚙齒動(dòng)物嵌合(例如人/小鼠或人/大鼠)mhci多肽的方法，其中所述方法包括在所述內(nèi)源性mhci基因座用編碼人源mhci多肽胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列取代編碼嚙齒動(dòng)物mhci多肽胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種修飾嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)的β2微球蛋白基因座以表達(dá)人源或人源化β2微球蛋白多肽的方法，其中所述方法包括在內(nèi)源性嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)β2微球蛋白基因座用編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列取代編碼嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在這種方法中，所述取代可以在單個(gè)es細(xì)胞中進(jìn)行，并且可以將所述單個(gè)es細(xì)胞引入嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)以制備胚胎?？梢詫⑺玫降膰X動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)進(jìn)行交配以產(chǎn)生雙人源化動(dòng)物。

因此，本發(fā)明還提供了一種制備雙人源化動(dòng)物例如嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)還提供了一種制備基因修飾的小鼠的方法，所述方法包括(a)修飾第一小鼠的mhci基因座以表達(dá)人源/小鼠嵌合mhci多肽，其在內(nèi)源性小鼠mhci基因座包含編碼小鼠mhci多肽胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列被編碼人mhci多肽胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列所取代，(b)修飾第二小鼠的β2微球蛋白基因座以表達(dá)人源或人源化β2微球蛋白多肽，其在內(nèi)源性小鼠β2微球蛋白基因座包含編碼小鼠β2微球蛋白多肽的核苷酸序列被編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列取代；以及(c)將所述第一和第二小鼠交配以生成經(jīng)修飾的小鼠，所述小鼠在其基因組中包含編碼人源/小鼠嵌合mhci多肽的第一核苷酸序列和編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列，其中所述基因修飾的小鼠表達(dá)人源/小鼠嵌合mhci多肽和人源或人源化β2微球蛋白多肽。在一些實(shí)施方式中，所述mhci基因座選自h-2k、h-2d和h-2l；；在一些實(shí)施方式中，所述人mhci多肽選自hla-a、hla-b和hla-c。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述mhci基因座是h-2k基因座，所述人mhci多肽是hla-a(例如hla-a2)，并且所述小鼠表達(dá)嵌合hla-a/h-2k多肽(例如hla-a2/h-2k多肽)。在一個(gè)方面，所述嵌合hla-a2/h-2k多肽包含hla-a2多肽的胞外結(jié)構(gòu)域和h-2k多肽的胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面，所述第二核苷酸序列包含人β2微球蛋白基因外顯子2、3和4(例如外顯子2至外顯子4)中所示的核苷酸序列，以及小鼠β2微球蛋白基因外顯子1中所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種來(lái)源于本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)的細(xì)胞例如分離的抗原遞呈細(xì)胞。本發(fā)明還提供了來(lái)源于本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的組織和胚胎。

在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了鑒定激發(fā)免疫應(yīng)答的抗原或抗原表位的方法，評(píng)估候選疫苗的方法，鑒定對(duì)人病原體或癌癥抗原具有高親和性的t細(xì)胞的方法。

本發(fā)明所述的任何實(shí)施方式和方面均可以彼此結(jié)合使用，除非另有說(shuō)明或從上下文是顯而易見的。通過(guò)隨后的詳細(xì)描述，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言其他實(shí)施方式將是顯而易見的。下文的詳細(xì)描述包括對(duì)本發(fā)明不同實(shí)施方式的示例性描述，其對(duì)所主張的發(fā)明不具有限制性。附圖構(gòu)成了本說(shuō)明書的一部分，其與說(shuō)明書一起僅用于說(shuō)明書實(shí)施方式，而不是用于限制本發(fā)明。

附圖簡(jiǎn)述

圖1是i類mhc分子四個(gè)結(jié)構(gòu)域的示意圖：含有α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域的α-鏈以及非共價(jià)結(jié)合的第四個(gè)結(jié)構(gòu)域β2-微球蛋白(β2m)?；疑膱A圈表示在肽結(jié)合縫隙中結(jié)合的肽。

圖2是人hla相對(duì)基因組結(jié)構(gòu)示意圖(未按照比例)，顯示了i、ii和iii類基因。

圖3是小鼠mhc相對(duì)基因組結(jié)構(gòu)的示意圖(未按照比例)，顯示了i、ii和iii類基因。

圖4顯示了含有編碼嵌合hla-a/h-2k多肽的cdna以及ires-gfp報(bào)告基因的病毒載體構(gòu)建體(a)；以及對(duì)單獨(dú)轉(zhuǎn)導(dǎo)(左圖)hla-a2(虛線)、hla-a2/h-2k(點(diǎn)線)或未轉(zhuǎn)導(dǎo)(實(shí)線)，或與人源化β2微球蛋白共轉(zhuǎn)導(dǎo)(右圖)的mg87細(xì)胞中人hla-a2表達(dá)情況進(jìn)行比較的直方圖(b)。與(b)圖平行對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)在表(c)中以表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞所占百分率表示。

圖5是用于制備表達(dá)人hla-a2蛋白胞外區(qū)域的嵌合h-2k基因座的定位策略的示意圖(未按照比例)。小鼠序列以黑色表示，人序列以白色表示。l＝先導(dǎo)序列，utr＝非翻譯區(qū)，tm＝跨膜結(jié)構(gòu)域，cyt＝胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，hyg＝潮霉素。

圖6a顯示了從野生型(wt)小鼠或攜帶嵌合hla-a2/h-2k基因座的雜合子小鼠(hla-a/h-2khet)分離的細(xì)胞中hla-a2(左圖)和h-2k(右圖)的表達(dá)情況(占總細(xì)胞％)。

圖6b為在攜帶嵌合hla-a2/h-2k基因座的雜合子小鼠中嵌合hla-a2/h-2k蛋白體內(nèi)表達(dá)情況的點(diǎn)圖。

圖7顯示了在小鼠β2微球蛋白基因座將β2微球蛋白基因人源化的定向策略(未按照比例)。小鼠序列以黑色表示，人序列以白色表示。neo＝新霉素。

圖8顯示了從野生型(wt)小鼠、嵌合hla-a2/h-2k雜合子小鼠、嵌合hla-a2/h-2k雜合子和人源化β2微球蛋白雜合子小鼠(雙雜合子；i類/β2mhet)的血液分離的細(xì)胞中hlai類和人β2微球蛋白的表達(dá)情況的代表性點(diǎn)圖。

圖9顯示了從野生型(wt)、嵌合hla-a2/h-2k雜合子(i類het)和嵌合hla-a2/h2k/人源化β2微球蛋白雙雜合子(i類/β2mhet)小鼠血液分離的細(xì)胞中人hlai類表達(dá)情況(x-軸)的代表性直方圖。

圖10顯示了在流感(左圖)或ebv(右圖)肽存在的條件下，對(duì)接觸來(lái)源于野生型小鼠的抗原遞呈細(xì)胞(apc)(wtapc)或針對(duì)嵌合hla-a2/h-2k和人源化β2微球蛋白是雜合子的小鼠的抗原遞呈細(xì)胞(apc)(雙hetapc)遞呈的人t細(xì)胞進(jìn)行ifnγelispot檢測(cè)的結(jié)果。使用單因素方差檢驗(yàn)anova結(jié)合tukey的檢驗(yàn)后多重比較測(cè)試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

發(fā)明詳述

定義

本發(fā)明提供了表達(dá)人源或人源化mhci和/或β2微球蛋白的基因修飾的非人動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、家兔等)；以及包含該基因修飾的胚胎、細(xì)胞和組織；制備該基因修飾動(dòng)物以及使用其的方法。除非另有定義，否則本申請(qǐng)使用的所有術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)包括所述術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)在本領(lǐng)域中所具有的含義，除非有明確的相反說(shuō)明或在使用所述術(shù)語(yǔ)或短語(yǔ)的上下文中是顯而易見的。

當(dāng)用于描述保守的氨基酸取代時(shí)，術(shù)語(yǔ)“保守的”包括氨基酸殘基被另一個(gè)具有帶有相似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的側(cè)鏈r基的氨基酸殘基取代。保守的氨基酸取代可以通過(guò)修飾核苷酸序列以引入編碼保守取代的核苷酸的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)。在通常情況下，保守的氨基酸取代將不會(huì)從基本上改變目標(biāo)蛋白的功能性性質(zhì)，例如mhci遞呈目標(biāo)肽的能力。具有帶有相似化學(xué)性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸基團(tuán)的例子包括脂肪族側(cè)鏈如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；脂肪族-羥基側(cè)鏈如絲氨酸和蘇氨酸；含有酰胺的側(cè)鏈如天冬酰胺和谷胺酰胺；芳香側(cè)鏈如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；堿性側(cè)鏈如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；酸性側(cè)鏈如天冬氨酸和谷氨酸；和含硫側(cè)鏈如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守的氨基酸取代基團(tuán)包括例如纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、賴氨酸/精氨酸、丙氨酸/纈氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些實(shí)施方式中，保守的氨基酸取代可以是蛋白中的任意天然殘基被丙氨酸取代，用于例如丙氨酸掃描誘變。在一些實(shí)施方式中，所采用的保守取代在pam250對(duì)數(shù)概似矩陣中具有正值的，如gonnet等，(1992)exhaustivematchingoftheentireproteinsequencedatabase,science256:1443-45所公開的，其通過(guò)引用并入本申請(qǐng)。在一些實(shí)施方式中，所述取代是適度的保守取代，其中所述取代在pam250對(duì)數(shù)概似矩陣中具有非負(fù)值。

因此，本發(fā)明還包括一種基因修飾的非人動(dòng)物，所述動(dòng)物的基因組包含編碼人源或人源化mhci多肽和/或β2微球蛋白多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含本申請(qǐng)所述的氨基酸序列的保守氨基酸取代。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除了本申請(qǐng)所述的編碼人源或人源化mhci多肽和/或β2微球蛋白的核酸殘基以外，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，其他核酸也可以編碼本發(fā)明的多肽。因此，除了在其基因組中包含編碼具有保守氨基酸取代的mhci和/或β2微球蛋白多肽的核苷酸序列的基因修飾的非人動(dòng)物以外，本申請(qǐng)還提供了由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性使得在其基因組包含不同于本申請(qǐng)所述的核酸序列的非人動(dòng)物。

當(dāng)與序列一起使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“同一性”包括通過(guò)本領(lǐng)域公知的能夠用于測(cè)定核苷酸和/或氨基酸序列同一性的多種不同算法確定的同一性。在本申請(qǐng)所述的一些實(shí)施方式中，使用開放間隙罰分為10.0和延伸間隙罰分為0.1的clustalwv.1.83(slow)算法和gonnet相似性矩陣(macvector^tm10.0.2,macvectorinc.,2008)確定同一性。用于序列同一性比較的序列的長(zhǎng)度取決于特定的序列。在多種實(shí)施方式中，通過(guò)從成熟蛋白的n末端至c末端進(jìn)行序列比較確定其同一性。在不同實(shí)施方式中，當(dāng)將人源/非人源嵌合序列與人序列進(jìn)行比較時(shí)，將所述人源/非人源嵌合序列的人源部分(而不是非人源部分)用于比較，以確定人源序列和人源/非人源嵌合序列的人部分之間的同一性水平(例如將人源/小鼠嵌合蛋白的人胞外結(jié)構(gòu)域與人蛋白的人胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比較)。

關(guān)于序列例如核苷酸或氨基酸序列的術(shù)語(yǔ)“同源性”或“同源的”是指兩條序列經(jīng)最佳比對(duì)和比較具有至少約75％的核苷酸或氨基酸、至少約80％的核苷酸或氨基酸、至少約90-95％的核苷酸或氨基酸，例如超過(guò)97％的核苷酸或氨基酸是相同的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，對(duì)于最佳基因靶向而言，靶向構(gòu)建體應(yīng)含有與內(nèi)源性dna序列同源的臂(即“同源臂”)；因此，能夠在靶向構(gòu)建體與被靶向的內(nèi)源性序列之間發(fā)生同源重組。

術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指并列，其中被這樣描述的組分處于允許其以預(yù)計(jì)方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。因此，編碼蛋白的核酸序列可以可操作地與調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子序列等)連接，以保持適宜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，在細(xì)胞中本發(fā)明的嵌合或人源化蛋白的多個(gè)部分可以可操作地相連以保持其折疊、加工、靶向、表達(dá)和其他細(xì)胞中的蛋白功能。除非另有明示，本發(fā)明的嵌合或人源化蛋白的多種結(jié)構(gòu)域彼此之間可操作地連接。

如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“mhci復(fù)合物”或類似表述包括mhciα鏈多肽與β2-微球蛋白多肽之間的復(fù)合物。如本申請(qǐng)所使用的，術(shù)語(yǔ)“mhci多肽”或類似表述包括單獨(dú)的mhciα鏈多肽。通常，術(shù)語(yǔ)“人mhc”和“hla”可以互換使用。

關(guān)于基因取代中的術(shù)語(yǔ)“取代”，是指在內(nèi)源性基因座加入外源性遺傳物質(zhì)，從而用直系同源的或同源的核酸序列取代全部或部分內(nèi)源性基因。如下述實(shí)施例中所示，編碼部分小鼠mhci和β2微球蛋白多肽的內(nèi)源性基因座的核酸序列分別被編碼部分人源mhci和β2微球蛋白多肽的核酸序列取代。

如本申請(qǐng)所使用的“功能性”，就功能性多肽而言，是指保留至少一個(gè)通常與天然蛋白相關(guān)的生物活性的多肽。例如，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在內(nèi)源性基因座的取代(例如在內(nèi)源性非人源mhci和/或β2微球蛋白基因座的取代)使得基因座無(wú)法表達(dá)功能性內(nèi)源性多肽。

本申請(qǐng)下文描述的基因修飾的mhci非人動(dòng)物的若干方面，例如動(dòng)物類型、動(dòng)物品系、細(xì)胞類型、篩選、檢測(cè)和其他方法、使用方法等將適用于基因改造β2微球蛋白和mhci/β2微球蛋白的動(dòng)物。

基因修飾的mhci動(dòng)物

在多種實(shí)施方式中，本發(fā)明基本提供了基因修飾的非人動(dòng)物，所述動(dòng)物在其基因組中包含編碼人源或人源化mhci多肽的核苷酸序列；因此，所述動(dòng)物表達(dá)人源或人源化的mhci多肽。

mhc基因分為三類：i類、ii類和iii類，其均在人6號(hào)染色體或小鼠17號(hào)染色體上編碼。人和小鼠的mhc類型相對(duì)結(jié)構(gòu)的示意圖分別見圖2和圖3。mhc基因是小鼠和人基因組中最具多態(tài)性的基因。mhc多態(tài)性被推定為在提供進(jìn)化優(yōu)勢(shì)方面是重要的；序列的改變能夠?qū)е码慕Y(jié)合的差異，以便更好地將病原體遞呈至細(xì)胞毒性t細(xì)胞。

mhci類蛋白包含胞外結(jié)構(gòu)域(其含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：α1、α2和α3)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾。α1和α2結(jié)構(gòu)域形成肽結(jié)合裂隙，而α3與β2-微球蛋白相互作用。

除了與β2-微球蛋白的相互作用之外，α3結(jié)構(gòu)域還與tcr共受體cd8之間相互作用，以促進(jìn)抗原特異性活化。盡管mhci類與cd8的結(jié)合比tcr與mhci類的結(jié)合弱約100倍，但是cd8結(jié)合增強(qiáng)了tcr結(jié)合的親和性。wooldridge等，(2010)mhcclassimoleculeswithsuperenhancedcd8bindingpropertiesbypasstherequirementforcognatetcrrecognitionandnonspecificallyactivatectls,j.immunol.184:3357-3366。有趣的是，增強(qiáng)mhci類與cd8的結(jié)合消除了ctl活化中的抗原特異性。同上。

cd8與mhci類分子的結(jié)合具有種屬特異性；已發(fā)現(xiàn)cd8的小鼠同源物lyt-2在α3結(jié)構(gòu)域與h-2d^d分子結(jié)合，但其不與hla-a分子結(jié)合。connolly等，(1988)thelyt-2moleculerecognizesresiduesintheclassiα3domaininallogeneiccytotoxictcellresponses,j.exp.med.168:325-341。這種差異性結(jié)合可能是由cd8上的cdr樣決定簇(cdr1-和cdr2-樣)在人和小鼠之間不保守所導(dǎo)致的。sanders等，(1991)mutationsincd8thataffectinteractionswithhlaclassiandmonoclonalanti-cd8antibodies,j.exp.med.174:371-379；vitiello等，(1991)analysisofthehla-restrictedinfluenza-specificcytotoxictlymphocyteresponseintransgenicmicecarryingachimerichuman-mouseclassimajorhistocompatibilitycomplex,j.exp.med.173:1007-1015；以及gao等，(1997)crystalstructureofthecomplexbetweenhumancd8ααandhla-a2,nature387:630-634。已報(bào)道cd8在α3結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)(在位點(diǎn)223-229)結(jié)合hla-a2。在hla-a中的單一取代(v245a)導(dǎo)致cd8與hla-a的結(jié)合降低，同時(shí)伴隨著t細(xì)胞介導(dǎo)的裂解大大減少。salter等，(1989),polymorphismintheα3domainofhla-amoleculesaffectsbindingtocd8,nature338:345-348。在通常情況下，hla-a分子在α3結(jié)構(gòu)域的多態(tài)性也會(huì)影響其與cd8的結(jié)合。同上。在小鼠中，在h-2d^d中殘基227的氨基酸取代影響小鼠lyt-2與h-2d^d的結(jié)合，并且使用突變的h-2d^d轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不會(huì)被cd8+t細(xì)胞裂解。potter等，(1989)substitutionatresidue227ofh-2classimoleculesabrogatesrecognitionbycd8-dependent,butnotcd8-independent,cytotoxictlymphocytes,nature337:73-75。

因此，由于mhci類α3結(jié)構(gòu)域與cd8之間的相互作用具有種屬特異性，因此包含h-2kα3結(jié)構(gòu)域被人hla-a2α3結(jié)構(gòu)域取代的mhci復(fù)合物在缺乏人cd8的小鼠中(即在體內(nèi))無(wú)功能。在hla-a2的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，使用人α3結(jié)構(gòu)域取代小鼠α3結(jié)構(gòu)域使得t細(xì)胞應(yīng)答恢復(fù)。irwin等，(1989)species-restrictedinteractionsbetweencd8andtheα3domainofclassiinfluencethemagnitudeofthexenogeneicresponse,j.exp.med.170:1091-1101；vitiello等，(1991)，見前。

小鼠mhci類蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾也具有重要功能。mhci跨膜結(jié)構(gòu)域的一個(gè)功能是促進(jìn)hla-a2同型細(xì)胞粘附的調(diào)控(增強(qiáng)或抑制粘附)，這可能是表面mhc分子交聯(lián)(或連接)的結(jié)果。wagner等，(1994)ligationofmhcclassiandclassiimoleculescanleadtoheterologousdesensitizationofsignaltransductionpathwaysthatregulatehomotypicadhesioninhumanlymphocytes,j.immunol.152:5275-5287。細(xì)胞粘附能夠受到與hla-a2分子不同表位結(jié)合的mab的影響，這表明hla-a2上的多個(gè)位點(diǎn)參與了調(diào)節(jié)同型細(xì)胞的粘附；依據(jù)所結(jié)合表位的不同，該影響可能會(huì)增強(qiáng)或抑制hla-a2依賴性粘附。同上。

據(jù)報(bào)道由mhci基因的外顯子6和7編碼的胞質(zhì)尾對(duì)細(xì)胞表面上的適宜表達(dá)和lir1介導(dǎo)的nk細(xì)胞毒性的抑制是必要的。gruda等，(2007)intracellularcysteineresiduesinthetailofmhcclassiproteinsarecrucialforextracellularrecognitionbyleukocyteig-likereceptor1,j.immunol.179:3655-3661。胞質(zhì)尾對(duì)于至少通過(guò)在其半胱氨酸殘基上形成二硫鍵的mhci分子的多聚化是必需的，因此其可能在成簇和被nk細(xì)胞識(shí)別中具有重要作用。lynch等，(2009)novelmhcclassistructuresonexosomes,j.immunol.183:1884-1891。

盡管hla-a2的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)組成型的磷酸化絲氨酸殘基和一個(gè)可磷酸化的酪氨酸，但是在jurkat細(xì)胞中缺乏胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的突變hla-a2分子在表達(dá)、細(xì)胞骨架結(jié)合、聚合和內(nèi)吞內(nèi)化方面表現(xiàn)正常。gur等，(1997)structuralanalysisofclassimhcmolecules:thecytoplasmicdomainisnotrequiredforcytoskeletalassociation,aggregation,andinternalization,mol.immunol.34(2):125-132。缺乏胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的截短的hla-a2分子顯示出正常的表達(dá)且與β2微球蛋白的結(jié)合，同上。

然而，一些研究已表明胞質(zhì)尾在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、樹突狀細(xì)胞(dc)介導(dǎo)的抗原遞呈和ctl引發(fā)中具有重要作用。已證明外顯子6編碼的酪氨酸殘基是通過(guò)內(nèi)涵體小室的mhci轉(zhuǎn)運(yùn)、外源性抗原的遞呈和ctl引發(fā)所必需的；而外顯子7的缺失導(dǎo)致抗病毒ctl應(yīng)答的增強(qiáng)。lizee等，(2003)controlofdendriticcross-presentationbythemajorhistocompatibilitycomplexclassicytoplasmicdomain,natureimmunol.4:1065-73；basha等，(2008)mhcclassiendosomalandlysosomaltraffickingcoincideswithexogenousantigenloadingindendriticcells,plosone3:e3247；和rodriguez-cruz等，(2011)naturalsplicevariantofmhcclassicytoplasmictailenhancesdendriticcell-inducedcd8+t-cellresponsesandboostsanti-tumorimmunity,plosone6:e22939。

在多種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、家兔等)，在所述動(dòng)物的基因組中包含編碼人源或人源化mhci類多肽的核苷酸序列。所述非人動(dòng)物可以在其基因組中包含編碼mhci多肽的核苷酸序列，所述mhci多肽部分是人源的和部分是非人源的，例如表達(dá)人源/非人源嵌合mhci多肽的非人動(dòng)物。在一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物僅表達(dá)人源或人源化mhci多肽，例如人源/非人源嵌合mhci多肽，并且不表達(dá)來(lái)自內(nèi)源性mhci基因座的內(nèi)源性非人源mhci蛋白。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源/非人源嵌合mhci多肽在其人源部分包含一個(gè)人mhci多肽的肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面，所述嵌合多肽的人源部分包含人mhci的胞外結(jié)構(gòu)域。在這個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合多肽的人源部分包含人mhciα鏈的胞外結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合多肽的人源部分包含人mhci的α1和α2結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合多肽的人源部分包含人mhci的α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域。

所述人源或人源化mhci多肽可以來(lái)源于由任意hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f或hla-g基因座編碼的功能性人hla分子。常用的hla抗原列表可參見shankarkumar等((2004)thehumanleukocyteantigen(hla)system,int.j.hum.genet.4(2):91-103)，其通過(guò)引用并入本申請(qǐng)。shankarkumar等還提供了對(duì)本領(lǐng)域使用的hla命名法的簡(jiǎn)要說(shuō)明。hla命名法和不同hla等位基因的其他信息可以參見holdsworth等，(2009)thehladictionary2008:asummaryofhla-a,-b,-c,-drb1/3/4/5,anddqb1allelesandtheirassociationwithserologicallydefinedhla-a,-b,-c,-dr,and–dqantigens,tissueantigens73:95-170，以及最新的marsh等，(2010)nomenclatureforfactorsofthehlasystem,2010,tissueantigens75:291-455，其均通過(guò)引用并入本申請(qǐng)。因此，所述人源或人源化mhci多肽可以來(lái)源于本申請(qǐng)所述的任意功能性人hlai類分子。

在一個(gè)特定方面，所述人源或人源化mhci多肽來(lái)源于人hla-a。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述hla-a多肽是hla-a2多肽(例如hla-a2.1多肽)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述hla-a多肽是由hla-a*0201等位基因(例如hla-a*02:01:01:01等位基因)編碼的多肽。hla-a*0201等位基因通常用于北美人群中。盡管本實(shí)施例中描述了這一特定的hla序列，但是任意適宜的hla-a序列均包含在本申請(qǐng)中，例如hla-a2在人群中的多態(tài)性變體、具有一個(gè)或多個(gè)保守的或非保守的氨基酸修飾的序列、由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于本申請(qǐng)所述序列的核酸序列等。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝吮磉_(dá)人hla-a2序列的非人動(dòng)物，其中所述人hla-a2序列包含一個(gè)或多個(gè)保守的或非保守的修飾。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝吮磉_(dá)人源hla-a2序列的非人動(dòng)物，其中所述人源hla-a2序列與人hla-a2序列具有至少約85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人源hla-a2序列與實(shí)施例中所述的人hla-a2序列具有至少約90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人hla-a2序列包含一個(gè)或多個(gè)保守取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人hla-a2序列包含一個(gè)或多個(gè)非保守取代。

在另一個(gè)特定的方面，所述人源或人源化mhci多肽來(lái)源于選自hla-b和hla-c的人mhci。在一個(gè)方面，所述人源或人源化mhci來(lái)源于hla-b例如hla-b27。

在一個(gè)方面，所述人源/非人源嵌合mhci多肽的非人源部分包含非人源mhci多肽的跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是小鼠，并且所述非人源mhci多肽選自h-2k、h-2d和h-2l。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人源mhci多肽是h-2k例如h-2kb。盡管在實(shí)施例中描述了特定的h-2k序列，但是在本申請(qǐng)中包含任意適宜的h-2k序列例如多態(tài)性變體、保守/非保守的氨基酸取代等。

本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物可以在其基因組中包含編碼人源或人源化mhci多肽的核苷酸序列，例如人源/或非人源嵌合mhci多肽，其中所述編碼這種多肽的核苷酸序列位于內(nèi)源性非人源mhci基因座(例如h-2k基因座)。在一個(gè)方面，其為內(nèi)源性mhci基因或其部分被編碼人源或人源化mhci多肽的核苷酸序列取代的結(jié)果，例如編碼本申請(qǐng)所述的人源/非人源嵌合mhci多肽的嵌合基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述取代包含編碼非人源mhci多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域或非人源mhci胞外結(jié)構(gòu)域的內(nèi)源性核苷酸序列被編碼其的人核苷酸序列(例如hla-a2核苷酸序列)取代。在這個(gè)實(shí)施方式中，所述取代不包含編碼非人源mhci多肽(例如h-2k多肽)的跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的mhci序列的取代。因此，所述非人動(dòng)物在內(nèi)源性非人源mhci基因座包含人源/非人源嵌合序列，并且從內(nèi)源性非人源mhci基因座表達(dá)人源/非人源嵌合mhc多肽。

人源/非人源嵌合多肽可以是包含人源或非人源的先導(dǎo)(信號(hào))序列的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合多肽包含非人源內(nèi)源性mhci蛋白的先導(dǎo)序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合多肽包含人源mhci蛋白例如hla-a2蛋白(例如hla-a2.1先導(dǎo)序列)的先導(dǎo)序列。因此，編碼所述嵌合mhci多肽的核苷酸序列可以可操作地與編碼人源mhci先導(dǎo)序列的核苷酸序列連接。

人源/或非人源嵌合mhci多肽可以在其人部分中包含完整的或基本上完整的人源mhci多肽胞外結(jié)構(gòu)域。因此，所述人部分可以包含編碼人源mhci多肽(例如hla-a2多肽)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸的至少80％、優(yōu)選地至少85％、更優(yōu)選地至少90％，例如95％或以上。在一個(gè)例子中，基本上完整的人源mhci多肽的胞外結(jié)構(gòu)域缺乏人源mhci先導(dǎo)序列。在另一個(gè)例子中，所述人源/非人源嵌合mhci多肽包含人源mhci先導(dǎo)序列。

而且，所述嵌合mhci多肽可以在內(nèi)源性非人源調(diào)控元件例如嚙齒動(dòng)物mhci調(diào)控元件的調(diào)控下表達(dá)。這種重排將有利于在非人動(dòng)物中例如在非人動(dòng)物的免疫應(yīng)答中適宜地表達(dá)嵌合mhci多肽。

基因修飾的非人動(dòng)物可以選自以下組：小鼠、大鼠、家兔、豬、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、雪貂、靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如狨猴、獼猴)。對(duì)于不易于獲得適宜基因修飾的es細(xì)胞的非人動(dòng)物而言，可以使用其他方法制備包含基因修飾的非人動(dòng)物。這種方法包括例如修飾非es細(xì)胞基因組(例如成纖維細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)以及引入核轉(zhuǎn)移以便將經(jīng)修飾的基因組轉(zhuǎn)移至適宜細(xì)胞例如卵母細(xì)胞，并且在適宜條件下在非人動(dòng)物中使經(jīng)修飾的細(xì)胞(例如經(jīng)修飾的卵細(xì)胞)妊娠以形成胚胎。

在一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。在一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物是小型哺乳動(dòng)物，例如跳鼠科或鼠科超家族。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因修飾的動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物選自小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物選自鼠科超家族。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因修飾的動(dòng)物來(lái)自選自麗倉(cāng)鼠科(例如小鼠樣倉(cāng)鼠)、倉(cāng)鼠科(例如倉(cāng)鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、馬島鼠科(登山小鼠、巖小鼠、有尾大鼠、馬達(dá)加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(例如多刺睡鼠)和鼴形鼠科(例如摩爾大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述基因修飾的嚙齒動(dòng)物選自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、刺毛鼠和黃冠鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因修飾的小鼠是鼠科家族成員。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物選自小鼠和大鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是小鼠。

在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物，其是c57bl品系的小鼠，選自c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠是選自以下組的129品系：129p1、129p2、129p3、129x1、129s1(例如129s1/sv、129s1/svim)、129s2、129s4、129s5、129s9/svevh、129s6(129/svevtac)、129s7、129s8、129t1、129t2(參見例如festing等(1999)revisednomenclatureforstrain129mice,mammaliangenome10:836，亦參見auerbach等(2000)establishmentandchimeraanalysisof129/svev-andc57bl/6-derivedmouseembryonicstemcelllines)。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述基因修飾的小鼠是前述129品系和前述c57bl/6品系的混合品系。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述小鼠是前述129品系的混合品系或前述bl/6品系的混合品系。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述129品系的混合品系是129s6(129/svevtac)品系。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠是balb品系，例如balb/c品系。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠是balb品系和另一個(gè)前述品系的混合品系。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是大鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述大鼠選自wistar大鼠、lea品系、spraguedawley品系、fischer品系、f344、f6和darkagouti。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述大鼠品系是兩種或多種選自以下組的品系的混合品系：wistar、lea、spraguedawley、fischer、f344、f6和darkagouti。

因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種基因修飾的小鼠，所述小鼠在其基因組中包含編碼人源/小鼠嵌合mhci多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人源部分包含人源mhci(例如人hla-a，例如人hla-a2，例如人hla-a2.1)的肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域或胞外結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述小鼠不表達(dá)來(lái)自其內(nèi)源性小鼠基因座的內(nèi)源性小鼠多肽的肽結(jié)合或胞外結(jié)構(gòu)域。所述人源mhci的肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含α1和α2結(jié)構(gòu)域?；蛘?，所述人mhci的肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面，所述人源mhci的胞外結(jié)構(gòu)域包含人mhciα鏈的胞外結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述內(nèi)源性小鼠基因座是h-2k(例如h-2kb)基因座，并且所述嵌合多肽的小鼠部分包含小鼠h-2k(例如h-2kb)多肽的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了一種基因修飾的小鼠，其中所述小鼠在內(nèi)源性h-2k(例如h-2kb)基因座包含編碼人源/小鼠嵌合mhci多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人源部分包含人hla-a2(例如hla-a2.1)多肽的胞外結(jié)構(gòu)域和小鼠部分包含小鼠h-2k(例如h-2kb)多肽的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面，所述小鼠不表達(dá)來(lái)自內(nèi)源性mhci基因座的小鼠h-2k(例如h-2kb)多肽的胞外結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠表達(dá)來(lái)自內(nèi)源性h-2k(例如h-2kb)基因座的嵌合hla-a2/h-2k(例如嵌合hla-a2.1/h-2kb)多肽。在多種實(shí)施方式中，嵌合基因的表達(dá)在內(nèi)源性小鼠mhci類調(diào)控元件的調(diào)控下進(jìn)行。在一些方面，所述小鼠包含兩個(gè)拷貝的嵌合mhci基因座，其含有編碼嵌合hla-a2/h-2k多肽的核苷酸序列；而在其他方面，所述小鼠包含一個(gè)拷貝的嵌合mhci基因座，其含有編碼嵌合hla-a2/h-2k多肽的核苷酸序列。因此，所述小鼠針對(duì)編碼嵌合hla-a2/h-2k多肽的核苷酸序列可以是純合子或雜合子。

在本申請(qǐng)所述的一些實(shí)施方式中，提供了一種小鼠，所述小鼠在內(nèi)源性小鼠h-2k基因座包含嵌合mhci基因座。所述嵌合基因座包含編碼人hla-a2蛋白胞外結(jié)構(gòu)域例如人hla-a2基因的α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。所述嵌合基因座缺乏編碼小鼠h-2k蛋白胞外結(jié)構(gòu)域(例如小鼠h-2k的α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域)的核苷酸序列。在一個(gè)方面，所述嵌合基因座缺乏編碼小鼠h-2k的先導(dǎo)肽，α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列；并且包含人hla-a2的先導(dǎo)肽，α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域以及小鼠h-2k的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。所述嵌合基因座的不同結(jié)構(gòu)域可操作地彼此連接，以使得所述嵌合基因座表達(dá)功能性人源/小鼠嵌合mhci蛋白。

在多種實(shí)施方式中，非人動(dòng)物例如嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)，其表達(dá)來(lái)自如本申請(qǐng)所述的嵌合mhci基因座的功能性嵌合mhci蛋白，在細(xì)胞表面展示嵌合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物在細(xì)胞表面表達(dá)的嵌合mhci蛋白在細(xì)胞中的分布與在人中所觀察到的結(jié)果相同。在一個(gè)方面，所述細(xì)胞展示的肽片段(抗原片段)與所述嵌合mhci蛋白的胞外部分(例如人hla-a2的胞外部分)結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方式中，這種嵌合蛋白的胞外部分與所述細(xì)胞表面的其他蛋白例如β2-微球蛋白相互作用。

在多種實(shí)施方式中，展示嵌合mhci蛋白的例如hla-a2/h-2k蛋白的細(xì)胞是有核細(xì)胞。在多種方面，所述細(xì)胞是抗原遞呈細(xì)胞(apc)。但是機(jī)體內(nèi)的大部分細(xì)胞在mhci存在條件下能夠遞呈抗原，抗原遞呈細(xì)胞的一些非限制性例子包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和b細(xì)胞。其他抗原遞呈細(xì)胞包括專職的和非專職的apc是本領(lǐng)域公知的，其均包含在本申請(qǐng)中。在一些實(shí)施方式中，展示所述嵌合mhci蛋白的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，并且通過(guò)嵌合蛋白遞呈的肽片段來(lái)自腫瘤。在其他實(shí)施方式中，通過(guò)所述嵌合mhci蛋白遞呈的肽片段來(lái)自病原體，例如細(xì)菌或病毒。

本申請(qǐng)所述的嵌合mhci蛋白可以與相同細(xì)胞或另一個(gè)細(xì)胞表面的其他蛋白相互作用。在一些實(shí)施方式中，所述嵌合mhci蛋白與所述細(xì)胞表面的內(nèi)源性非人蛋白相互作用。所述嵌合mhci蛋白還可以與相同細(xì)胞或另一個(gè)細(xì)胞表面的人源或人源化蛋白相互作用。

在同一細(xì)胞上，hlai類分子可以在功能上與非人源(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)和人源β2-微球蛋白相互作用。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合mhci蛋白例如hla-a2/h-2k蛋白與小鼠β2-微球蛋白相互作用。盡管一些人hlai類分子與小鼠β2-微球蛋白之間的相互作用是可能的，但是其與人hlai類和人β2-微球蛋白之間的相互作用相比大大減少。因此，在缺乏人β2-微球蛋白的條件下，人mhci在細(xì)胞表面的表達(dá)可能降低。perarnau等，(1988)humanβ2-microglobulinspecificallyenhancescell-surfaceexpressionofhlaclassimoleculesintransfectedmurinecells,j.immunol.141:1383-89。其他hla分子例如hla-b27不與小鼠β2-微球蛋白相互作用；參見例如tishon等，(2000)transgenicmiceexpressinghumanhlaandcd8moleculesgeneratehla-restrictedmeaslesviruscytotoxictlymphocytesofthesamespecificityashumanswithnaturalmeaslesvirusinfection,virology275:286-293，其報(bào)道了在轉(zhuǎn)基因小鼠中hla-b27的功能需要人β2-微球蛋白和人cd8。因此，在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合mhci蛋白與人源或人源化β2-微球蛋白相互作用。在一些這種實(shí)施方式中，如本申請(qǐng)的下文所述，所述非人動(dòng)物例如嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)在其基因組中包含人源或人源化β2-微球蛋白基因，并且所述動(dòng)物表達(dá)功能性人源或人源化β2-微球蛋白多肽；因此，所述嵌合mhci蛋白與人源或人源化β2-微球蛋白多肽相互作用。

在多種方面，所述嵌合蛋白(例如hla-a2/h-2k蛋白)還與另一個(gè)細(xì)胞表面的蛋白相互作用(通過(guò)其細(xì)胞外部分)。所述另一個(gè)細(xì)胞可以是非人的例如小鼠的或人源的細(xì)胞。所述另一個(gè)細(xì)胞可以來(lái)源于與表達(dá)所述嵌合mhci多肽的細(xì)胞相同的非人動(dòng)物或相同的非人動(dòng)物種屬。與嵌合蛋白(例如hla-a2/h-2k)的胞外部分相互作用的蛋白的非限制性例子包括t細(xì)胞受體(tcr)及其共受體cd8。因此，另一個(gè)細(xì)胞可以是t細(xì)胞。此外，所述嵌合mhci蛋白的胞外部分可以與自然殺傷(nk)細(xì)胞表面的蛋白結(jié)合，例如nk細(xì)胞表面上的殺傷免疫球蛋白受體(kir)。

t細(xì)胞或nk細(xì)胞可以與嵌合mhci多肽及其展示的肽片段之間形成的復(fù)合物結(jié)合。這種結(jié)合可以分別導(dǎo)致t細(xì)胞的活化或nk介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷的抑制。一種假設(shè)是nk細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化為通過(guò)下調(diào)其mhci復(fù)合物殺傷已逃逸t細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的受感染的或腫瘤細(xì)胞。然而，當(dāng)mhci復(fù)合物在細(xì)胞表面表達(dá)時(shí)，可以被nk細(xì)胞受體識(shí)別，并且抑制nk介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷。因此，在一些方面，當(dāng)nk細(xì)胞與所述嵌合mhci多肽(例如hla-a2/h-2k多肽)和在受感染的或腫瘤細(xì)胞表面所展示的肽片段之間形成的復(fù)合物結(jié)合時(shí)，nk介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷被抑制。

在一個(gè)例子中，本申請(qǐng)所述的嵌合mhci多肽例如嵌合hla-a2/h-2k多肽與另一個(gè)細(xì)胞表面的cd8蛋白相互作用。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合hla-a2/h-2k多肽與另一個(gè)細(xì)胞表面的內(nèi)源性嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)cd8蛋白相互作用。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述另一個(gè)細(xì)胞是t細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述另一個(gè)細(xì)胞被改造以表達(dá)cd8。在某些方面，所述嵌合hla-a2/h-2k多肽與另一個(gè)細(xì)胞(例如人細(xì)胞或嚙齒動(dòng)物細(xì)胞)表面的人cd8相互作用。在一些這種實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物例如小鼠或大鼠包含人cd8轉(zhuǎn)基因，并且所述小鼠或大鼠表達(dá)功能性人cd8蛋白。

本申請(qǐng)所述的嵌合mhci多肽還可以與另一個(gè)細(xì)胞上的非人(例如小鼠或大鼠)tcr、人源tcr或人源化的tcr相互作用。所述嵌合mhci多肽可以與另一個(gè)細(xì)胞表面的內(nèi)源性tcr(例如小鼠或大鼠tcr)相互作用。所述嵌合mhci多肽還可以與另一個(gè)細(xì)胞表面表達(dá)的人源或人源化tcr相互作用，其中所述細(xì)胞來(lái)源于與表達(dá)所述嵌合mhci多肽的細(xì)胞相同的動(dòng)物或動(dòng)物種屬(例如小鼠或大鼠)。所述嵌合mhci多肽可以與人細(xì)胞表面表達(dá)的人tcr相互作用。

除了基因修飾的非人動(dòng)物以外，本申請(qǐng)還提供了非人胚胎(例如嚙齒動(dòng)物胚胎，例如小鼠或大鼠胚胎)，其中所述胚胎包含供體es細(xì)胞，其來(lái)源于如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)。在一個(gè)方面，所述胚胎包含包括所述嵌合mhci基因的es供體細(xì)胞和宿主胚胎細(xì)胞。

本申請(qǐng)還提供了一種組織，其中所述組織來(lái)源于如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)，并且表達(dá)所述嵌合mhci多肽(例如hla-a2/h-2k多肽)。

此外，本申請(qǐng)?zhí)峁┝朔蛛x自如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的非人細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是es細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是抗原遞呈細(xì)胞，例如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是免疫細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。

本申請(qǐng)還提供了一種非人細(xì)胞，所述細(xì)胞包含如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的染色體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人細(xì)胞包含如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的細(xì)胞核。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人細(xì)胞包含核轉(zhuǎn)移得到的染色體或其片段。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼如本申請(qǐng)所述的嵌合mhci多肽(例如hla-a2/h-2k多肽)的基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞來(lái)源于如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N雜交瘤或四價(jià)體瘤，其來(lái)源于如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是小鼠或大鼠。

本申請(qǐng)還提供了一種制備如本申請(qǐng)所述的基因改造的非人動(dòng)物(例如基因改造的嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)的方法。制備基因改造的非人動(dòng)物的方法使得在所述動(dòng)物的基因組中包含編碼嵌合mhci多肽的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法生成的基因改造的小鼠，其基因組在內(nèi)源性mhci基因座例如h-2k基因座包含編碼人源/小鼠嵌合mhci多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合mhci多肽的人源部分包含人hla-a2胞外結(jié)構(gòu)域且小鼠部分包含小鼠h-2k的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，如實(shí)施例中所描述的，所述方法利用使用技術(shù)制備的靶向構(gòu)建體，將所述構(gòu)建體引入es細(xì)胞并使用技術(shù)將目標(biāo)es細(xì)胞克隆引入小鼠胚胎。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述es細(xì)胞是129和c57bl/6小鼠品系的混合物；在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述es細(xì)胞是balb/c和129小鼠品系的混合物。

因此，本申請(qǐng)還提供了用于生成本申請(qǐng)所述的基因改造的非人動(dòng)物的核苷酸構(gòu)建體。在一個(gè)方面，所述核苷酸構(gòu)建體包含：5’和3’非人同源臂、包含人hla-a基因序列的人dna片段和篩選基因表達(dá)盒兩側(cè)的重組位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人dna片段是包含人hla-a基因的內(nèi)含子和外顯子的基因組片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人同源臂與非人mhci類基因座(例如小鼠h-2k基因座)具有同源性。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因組片段包含人hla-a先導(dǎo)、α1結(jié)構(gòu)域、α2結(jié)構(gòu)域和α3結(jié)構(gòu)域的編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人dna片段包含，從5’至3’：hla-a先導(dǎo)序列、hla-a先導(dǎo)/α1內(nèi)含子、hla-aα1外顯子、hla-aα1-α2內(nèi)含子、hla-aα2外顯子、hla-aα2-α3內(nèi)含子和hla-aα3外顯子。

篩選基因表達(dá)盒是插入靶向構(gòu)建體的一段核苷酸序列，其有助于篩選已插入目的構(gòu)建體的細(xì)胞(例如es細(xì)胞)。若干適宜的篩選基因表達(dá)盒是本領(lǐng)域公知的。通常，在存在特定抗生素(例如neo、hyg、pur、cm、spec等)的條件下篩選基因表達(dá)盒能夠得到陽(yáng)性篩選。此外，篩選基因表達(dá)盒可能在兩側(cè)具有重組位點(diǎn)，這使得在使用重組酶處理后可以將篩選基因表達(dá)盒去除。常用的重組位點(diǎn)是loxp和frt，其分別由cre和flp酶識(shí)別，但其他的也是本領(lǐng)域公知的。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述篩選基因表達(dá)盒位于人dna片段的5’端。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述篩選基因表達(dá)盒位于人dna片段的3’端。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述篩選基因表達(dá)盒位于人dna片段中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述篩選基因表達(dá)盒位于人dna片段的內(nèi)含子中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述篩選基因表達(dá)盒位于α2-α3內(nèi)含子中。

在一個(gè)實(shí)施方式中，5’和3’非人同源臂包含分別位于內(nèi)源性非人源(例如鼠源)mhci類基因座的5’和3’位置的基因組序列(例如非人源mhci基因第一先導(dǎo)序列的5’和α3外顯子的3’端)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述內(nèi)源性mhci類基因座選自小鼠h-2k、h-2d和h-2l。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述內(nèi)源性mhci類基因座是小鼠h-2k。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N核苷酸構(gòu)建體，其從5’至3’包含：含有內(nèi)源性小鼠h-2k基因座的小鼠基因組序列5’端的5’同源臂、含有hla-a基因第一基因組序列的第一人dna片段、5’重組序列位點(diǎn)(例如loxp)、篩選基因表達(dá)盒、3’重組序列位點(diǎn)(例如loxp)、含有hla-a基因第二基因組序列的第二人dna片段和含有內(nèi)源性h-2kα3外顯子的小鼠基因組序列3’端的3’同源臂。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核苷酸構(gòu)建體，從5’至3’包含：含有內(nèi)源性小鼠h-2k基因座的小鼠基因組序列5’端的5’同源臂、包括hla-a前導(dǎo)的人基因組序列、hla-a前導(dǎo)/α1內(nèi)含子序列、hla-aα1外顯子、hla-aα1-α2內(nèi)含子、hla-aα2外顯子、α2-α3內(nèi)含子的第一5’部分、兩側(cè)有重組位點(diǎn)的篩選基因表達(dá)盒、α2-α3內(nèi)含子的第二3’部分、hla-aα3外顯子和含有內(nèi)源性小鼠h-2kα3外顯子非小鼠基因組序列3’端的3’同源臂。在一個(gè)實(shí)施方式中，5’同源臂序列如seqidno:1所示和3’同源臂序列如seqidno:2所示。

在基因靶向完成后，對(duì)es細(xì)胞或基因修飾的非人動(dòng)物進(jìn)行篩選以確證成功插入了目的外源性核苷酸序列或表達(dá)了外源性多肽。多種技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括(但不限于)southern印跡、長(zhǎng)pcr、定量pct(例如使用的實(shí)時(shí)pcr)、熒光原位雜交、northern印跡、流式細(xì)胞術(shù)、western分析、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組化等。在一個(gè)例子中，可以通過(guò)篩選小鼠等位基因的缺失情況和/或人等位基因的獲得情況對(duì)攜帶目的基因修飾的非人動(dòng)物(例如小鼠)進(jìn)行鑒定，其采用valenzuela等，(2003)high-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis,naturebiotech.21(6):652-659中所述的經(jīng)修訂的等位基因檢測(cè)。鑒定基因修飾動(dòng)物中的特定核苷酸或氨基酸序列的其他檢測(cè)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。

本公開還提供了一種修飾非人動(dòng)物的mhci基因座以表達(dá)本申請(qǐng)所述的人源/非人源嵌合mhci多肽的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N修飾小鼠的mhci基因座以表達(dá)人源/小鼠嵌合mhci多肽的方法，其中所述方法包括在內(nèi)源性mhci基因座編碼小鼠mhc多肽肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列被編碼人mhci多肽肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列取代。在一些方面，小鼠mhci胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列被人mhci胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列取代。所述小鼠可能無(wú)法表達(dá)來(lái)自內(nèi)源性mhci基因座的小鼠mhci的肽結(jié)合或胞外結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，小鼠h-2k胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列被人hla-a2胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列取代，以使得經(jīng)修飾的小鼠mhci基因座表達(dá)嵌合hla-a2/h-2k多肽。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N用于制備人源hlai類/非人源mhci類嵌合分子的方法，所述方法包含在單個(gè)細(xì)胞中表達(dá)來(lái)自核苷酸構(gòu)建體的嵌合hla-a/h-2k蛋白，其中所述核苷酸構(gòu)建體包含編碼hla-a蛋白α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域以及非人h-2k蛋白例如小鼠h-2k蛋白的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的cdna序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核苷酸構(gòu)建體是病毒載體；在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述病毒載體是慢病毒載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞選自cho、cos、293、hela和表達(dá)病毒核酸序列的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如perc.6^tm細(xì)胞)。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N表達(dá)人源hlai類/非人源mhci嵌合蛋白(例如hla-a/h-2k蛋白)的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含含有嵌合mhci類基因的表達(dá)載體，其中所述嵌合mhci類基因包含可操作地與非人h-2k基因序列例如小鼠h-2k基因連接的人hla-a基因序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人hla-a基因序列包含編碼hla-a蛋白α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域的外顯子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人h-2k基因序列包含編碼h-2k蛋白跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的外顯子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞選自cho、cos、293、hela和表達(dá)病毒核酸序列的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如perc.6^tm細(xì)胞)。

本申請(qǐng)還提供了使用本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物制備的嵌合mhci類分子，其中所述嵌合mhci類分子包含來(lái)自人hla-a蛋白的α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域以及來(lái)自非人例如小鼠h-2k蛋白的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?？梢酝ㄟ^(guò)抗-hla-a抗體檢測(cè)本申請(qǐng)所述的嵌合mhci多肽。因此，可以使用抗-hla-a抗體分子檢測(cè)和/或選擇展示人源/非人源嵌合mhci多肽的細(xì)胞。在一些例子中，可以使用抗-hla-a2抗體檢測(cè)本申請(qǐng)所述的嵌合mhci多肽。

盡管下述實(shí)施例描述了一種基因改造的動(dòng)物，其基因組在內(nèi)源性小鼠h-2k基因座包含編碼小鼠h-2k多肽胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列被編碼人hla-a胞外結(jié)構(gòu)域的序列取代，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以使用類似的策略用相應(yīng)的人hla基因座(hla-b、hla-c等)取代其他的小鼠mhci基因座(h-2d、h-2l等)。因此，本申請(qǐng)還提供了一種非人動(dòng)物，所述動(dòng)物在其基因組中包含編碼人源/非人源嵌合mhci多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的人部分來(lái)源于另一種hlai類蛋白。還涉及多個(gè)mhci基因座的取代。

基因修飾β2微球蛋白的動(dòng)物

本發(fā)明通常涉及基因修飾的非人動(dòng)物，所述動(dòng)物在其基因組中包含編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列；因此，所述動(dòng)物表達(dá)人源或人源化β2微球蛋白多肽。

β2微球蛋白或mhci類復(fù)合物的輕鏈(也簡(jiǎn)稱為“β2m”)是較小的(12kda)非糖基化蛋白，其功能主要是穩(wěn)定mhcα鏈。人β2微球蛋白基因編碼119個(gè)氨基酸的蛋白，其具有編碼先導(dǎo)序列的20個(gè)n末端氨基酸。其成熟蛋白包含99個(gè)氨基酸。其基因含有4個(gè)外顯子，第一個(gè)外顯子含有5’非翻譯區(qū)、整個(gè)前導(dǎo)序列和成熟多肽的前兩個(gè)氨基酸；第二個(gè)外顯子編碼大部分成熟蛋白；第三個(gè)外顯子編碼成熟蛋白的最后四個(gè)氨基酸和終止密碼子；以及第四個(gè)外顯子含有3’非翻譯區(qū)。gussow等，(1987)theβ2-microglobulingene.primarystructureanddefinitionofthetranscriptionalunit,j.immunol.139:3131-38。β2微球蛋白與mhci非共價(jià)結(jié)合。未結(jié)合的β2微球蛋白存在于體液中，如血漿，并且其通過(guò)腎排泄。腎功能障礙導(dǎo)致β2微球蛋白的蓄積，其可能是致病性的(例如透析相關(guān)淀粉樣變)；蓄積的蛋白在關(guān)節(jié)和結(jié)締組織中形成絲狀纖維樣的淀粉樣蛋白斑塊。

除了透析相關(guān)淀粉樣變以外，β2微球蛋白還參與多種其他疾病。在淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤中例如非霍奇金氏淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤檢測(cè)到β2微球蛋白水平升高。參見例如shi等，(2009)β2microglobulin:emergingasapromisingcancertherapeutictarget,drugdiscoverytoday14:25-30。伴隨β2微球蛋白水平升高的一些其他惡性腫瘤包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、胃腸道和鼻咽癌。β2微球蛋白過(guò)表達(dá)已顯示出具有腫瘤生長(zhǎng)促進(jìn)作用，同上。最近還發(fā)現(xiàn)了β2微球蛋白驅(qū)動(dòng)上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)變，其在乳腺、前列腺、肺和腎癌中促進(jìn)癌向骨和軟組織轉(zhuǎn)移。josson等，(2011)β2microglobulininducesepitelialtomesenchymaltransitionandconferscancerlethalityandbonemetastasisinhumancancercells.cancerres.71(7):1-11。β2微球蛋白與非經(jīng)典mhci成員血色素沉著病蛋白(hfe)以及與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相互作用，并且調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)，同上。在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛記載了β2微球蛋白參與惡性腫瘤的其他特征(自我更新、血管生成增強(qiáng)、治療抗性)。

β2微球蛋白缺陷小鼠已被報(bào)道。參見koller等，(1990)normaldevelopmentofmicedeficientinβ2m,mhcclassiproteins,andcd8+tcells,science248:1227-1230。如koller等所報(bào)道的，這些小鼠外觀健康，但是檢測(cè)不到mhci類的表達(dá)。而且，在一些組織中大部分t細(xì)胞群是正常的，而在其他組織中觀察到cd8+t細(xì)胞顯著減少。這種所謂的mhci表達(dá)的缺乏，與此前allen等((1986)β2microglobulinisnotrequiredforcellsurfaceexpressionofthemurineclassihistocompatibilityantigenh-2d^borofatruncatedh-2d^b,proc.natl.acad.sci.usa83:7447-7451)得到的結(jié)果不同。allen等報(bào)道了β2微球蛋白不是所有mhci復(fù)合物在細(xì)胞表面表達(dá)所必需的，因?yàn)槿狈Ζ?微球蛋白的細(xì)胞能夠表達(dá)h-2d^b。然而，據(jù)推測(cè)在這些細(xì)胞中h-2d^b的功能是受損的，并且h-2d^b的構(gòu)象不同于天然蛋白，這解釋了為何koller和他的同事使用針對(duì)天然h-2d^b的抗體無(wú)法檢測(cè)到這種蛋白。然而，據(jù)報(bào)道缺乏β2微球蛋白的細(xì)胞可能遞呈針對(duì)cd8+t細(xì)胞的內(nèi)源性抗原(包括來(lái)自正常小鼠的內(nèi)源性cd8+t細(xì)胞)，并且據(jù)報(bào)道小鼠對(duì)抗原的攻擊進(jìn)行應(yīng)答時(shí)不需要β2微球蛋白就能生成高水平的h-2^dmhci類-限制性的cd8+ctl，盡管其是維持有效的免疫應(yīng)答所需要的。quinn等，(1997)virus-specific,cd8+majorhistocompatibilitycomplexclassi-restrictedcytotoxictlymphocytesinlymphocyticchoriomeningitisvirus-infectedβ2-microglobulin-deficientmice,j.virol.71:8392-8396。值得注意的是，據(jù)報(bào)道在缺乏β2微球蛋白時(shí)產(chǎn)生高水平這種t細(xì)胞的能力限于h-2^dmhci類-限制性的應(yīng)答。已報(bào)道β2微球蛋白缺陷小鼠具有多種顯著特征，例如對(duì)一些寄生蟲病的敏感性增加、對(duì)肝炎感染的敏感性增加、在鐵代謝中存在缺陷和繁殖表型受損。cooper等(2007)animpairedbreedingphenotypeinmicewithageneticdeletionofbeta-2microglobulinanddiminishedmhcclassiexpression:roleinreproductivefitness,biol.reprod.77:274-279。

在隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)基因上同時(shí)表達(dá)人β2微球蛋白和人hlai類分子(即hla-b7)的小鼠已被報(bào)道。chamberlain等，(1988)tissue-specificandcellsurfaceexpressionofhumanmajorhistocompatibilitycomplexclassiheavy(hla-b7)andlight(β2-microglobulin)chaingenesintransgenicmice,proc.natl.acad.sci.usa85:7690-7694。人hlai類的表達(dá)與肝臟中內(nèi)源性i類的顯著減少一致，同上。人β2微球蛋白的表達(dá)還與內(nèi)源性β2微球蛋白一致，而在雙轉(zhuǎn)基因小鼠中人hlai類分子的表達(dá)增加10-至17-倍，同上。然而，作者并沒有試圖用人β2微球蛋白基因座取代內(nèi)源性β2微球蛋白基因座。

因此，本申請(qǐng)所公開的是一種基因改造的非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)，在其基因組中包含編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在一個(gè)方面，所述動(dòng)物不表達(dá)來(lái)自內(nèi)源性非人源β2微球蛋白基因座的內(nèi)源性非人源β2微球蛋白。在一些實(shí)施方式中，編碼β2微球蛋白多肽的所述核苷酸序列部分是人源的且部分是非人源的，例如其含有一些對(duì)應(yīng)于人的氨基酸和一些對(duì)應(yīng)于非人β2微球蛋白的氨基酸。在一個(gè)方面，所述非人動(dòng)物不表達(dá)來(lái)自于內(nèi)源性非人源基因座的內(nèi)源性非人β2微球蛋白多肽，并且僅表達(dá)人源或人源化的β2微球蛋白多肽。在一個(gè)例子中，所述非人動(dòng)物不表達(dá)來(lái)自于內(nèi)源性β2微球蛋白基因座的完整的內(nèi)源性非人源β2微球蛋白多肽，僅表達(dá)部分非人源內(nèi)源性β2微球蛋白多肽。因此，在多種實(shí)施方式中，所述動(dòng)物不表達(dá)來(lái)自于內(nèi)源性非人源β2微球蛋白基因座的功能性非人源β2微球蛋白多肽。在一個(gè)特定方面，編碼人源或人源化β2微球蛋白的所述核苷酸序列位于內(nèi)源性非人源β2微球蛋白基因座。在一個(gè)方面，所述動(dòng)物包含兩個(gè)拷貝的β2微球蛋白基因座，其中包含編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在另一個(gè)方面，所述動(dòng)物包含一個(gè)拷貝的β2微球蛋白基因座，其中包含編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。因此，所述動(dòng)物針對(duì)包含編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列的β2微球蛋白基因座可以是純合子或雜合子。所述人源或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列可以來(lái)源于在人群中天然存在的β2微球蛋白序列的集合。在不同實(shí)施方式中，本發(fā)明的基因修飾的非人動(dòng)物在其生殖細(xì)胞中包含編碼人源或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包含編碼包括人源β2微球蛋白氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽能夠與mhci蛋白結(jié)合。

編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列可以包含與整個(gè)人β2微球蛋白基因?qū)?yīng)的核酸殘基。或者，所述核苷酸序列可以包含編碼人β2微球蛋白的氨基酸21-119中所示的氨基酸序列的核酸殘基(即與成熟人β2微球蛋白對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基)。在一個(gè)替代實(shí)施方式中，所述核苷酸序列可以包含編碼人β2微球蛋白的氨基酸23-115中所示的氨基酸序列的核酸殘基，例如人β2微球蛋白的氨基酸23-119中所示的氨基酸序列。人β2微球蛋白的核酸和氨基酸序列如gussow等所述，同上，其通過(guò)引用并入本申請(qǐng)。

因此，所述人源或人源化β2微球蛋白可以包含人β2微球蛋白多肽的氨基酸23-115中所示的氨基酸序列，例如人β2微球蛋白多肽的氨基酸23-119中所示的氨基酸序列，例如人β2微球蛋白多肽的氨基酸21-119中所示的氨基酸序列?；蛘?，人β2微球蛋白可以包含人β2微球蛋白多肽的氨基酸1-119。

在一些實(shí)施方式中，編碼人源或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列包含人β2微球蛋白基因的外顯子2至外顯子4中所示的核苷酸序列?；蛘撸龊塑账嵝蛄邪甩?微球蛋白基因的外顯子2、3和4中所示的核苷酸序列。在這個(gè)實(shí)施方式中，外顯子2、3和4中所示的核苷酸序列可操作地連接以使得所述基因正常轉(zhuǎn)錄和翻譯。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源序列包含與人β2微球蛋白基因的外顯子2至外顯子4對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人序列包含與人β2微球蛋白基因的外顯子2至外顯子4之后約267bp對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人序列包含約2.8kb的人β2微球蛋白基因。

因此，所述人源或人源化β2微球蛋白多肽可以由包含人β2微球蛋白的外顯子2至外顯子4中所示的核苷酸序列例如與人β2微球蛋白基因的外顯子2至外顯子4對(duì)應(yīng)的核苷酸序列的核苷酸序列所編碼?；蛘?，所述多肽可以由包含人β2微球蛋白基因的外顯子2、3和4中所示的核苷酸序列的核苷酸序列所編碼。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人源或人源化β2微球蛋白多肽由與人β2微球蛋白基因的外顯子2至外顯子4之后約267bp對(duì)應(yīng)的核苷酸序列所編碼。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述人源或人源化多肽由包含約2.8kb人源β2微球蛋白基因的核苷酸序列所編碼。因?yàn)樗靓?微球蛋白基因的外顯子4含有5’非翻譯區(qū)，因而所述人源或人源化多肽可以由包含β2微球蛋白基因的外顯子2和3的核苷酸序列所編碼。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，盡管本實(shí)施例中描述了生成基因改造的動(dòng)物的特定核酸和氨基酸序列，但是本申請(qǐng)中還提供了一種或多種保守或非保守氨基酸取代的序列或者由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性導(dǎo)致的與本申請(qǐng)所述的那些不同的序列。

因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N表達(dá)人β2微球蛋白序列的非人動(dòng)物，其中所述β2微球蛋白序列與人β2微球蛋白序列具有至少約85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述β2微球蛋白序列與實(shí)施例中所述的人β2微球蛋白序列具有至少約90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人β2微球蛋白序列包含一個(gè)或多個(gè)保守的取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人β2微球蛋白序列包含一個(gè)或多個(gè)非保守的取代。

此外，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人動(dòng)物，其中編碼人源或人源化β2微球蛋白的所述核苷酸序列還包含非人源β2微球蛋白基因的外顯子1中所示的核苷酸序列。因此，在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物在其基因組中包含編碼人源或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含非人源β2微球蛋白的外顯子1和人源β2微球蛋白基因的外顯子2、3和4。因此，所述人源或人源化β2微球蛋白多肽由非人源β2微球蛋白基因的外顯子1和人源β2微球蛋白基因的外顯子2、3和4(例如人β2微球蛋白基因的外顯子2和3)所編碼。

與包含編碼人源/非人源嵌合mhci多肽的核苷酸序列的非人動(dòng)物類似，包含編碼人源或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列的非人動(dòng)物可以選自以下組：小鼠、大鼠、家兔、豬、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、雪貂、靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如狨猴、獼猴)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是鼠源的例如嚙齒動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述動(dòng)物是小鼠。

因此，在一些方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因改造的小鼠，其中所述小鼠包含編碼如本申請(qǐng)所述的人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因改造的小鼠，其中所述小鼠在其內(nèi)源性β2微球蛋白基因座包含編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽(例如人源或基本上人源的β2微球蛋白多肽)的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述小鼠不表達(dá)來(lái)自內(nèi)源性β2微球蛋白基因座的內(nèi)源性β2微球蛋白多肽(例如功能性內(nèi)源性β2微球蛋白多肽)。在一些實(shí)施方式中，所述基因改造的小鼠包含含有小鼠β2微球蛋白基因的外顯子1以及人β2微球蛋白基因的外顯子2、3和4的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，所述小鼠表達(dá)人源或人源化β2微球蛋白多肽。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N經(jīng)修飾的非人源β2微球蛋白基因座，其包含異源β2微球蛋白序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述異源β2微球蛋白序列是人源或人源化序列。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述經(jīng)修飾的基因座是嚙齒動(dòng)物基因座。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述嚙齒動(dòng)物基因座選自小鼠或大鼠基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人基因座被至少一個(gè)人源β2微球蛋白編碼序列所修飾。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述異源β2微球蛋白序列可操作地與內(nèi)源性調(diào)控元件連接，例如內(nèi)源性啟動(dòng)子和/或表達(dá)控制序列。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述異源β2微球蛋白序列是人序列并且所述人序列可操作地與內(nèi)源性啟動(dòng)子和/或表達(dá)控制序列連接。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝私?jīng)修飾的非人源β2微球蛋白基因座，其包含可操作地與內(nèi)源性啟動(dòng)子和/或表達(dá)控制序列連接的人序列。

在多種方面，基因修飾的非人動(dòng)物，或者來(lái)自非人動(dòng)物的細(xì)胞、胚胎或組織所表達(dá)的人源或人源化β2微球蛋白保留了內(nèi)源性和/或人源β2微球蛋白全部的功能性方面。例如，優(yōu)選的是所述人源或人源化β2微球蛋白結(jié)合mhci多肽(例如內(nèi)源性非人源或人源mhci多肽)的α鏈。所述人源或人源化β2微球蛋白多肽可以結(jié)合、招募或以其他方式與任意其他分子例如與內(nèi)源性非人源和/或人源β2微球蛋白相關(guān)的受體、錨定或信號(hào)分子(例如hfe等)相互作用。

除了基因修飾的動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)以外，本申請(qǐng)還提供了組織或細(xì)胞，其中所述組織或細(xì)胞來(lái)源于如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物，并且包含外源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列，即核苷酸和/或氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述異源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列是人源或人源化β2微球蛋白基因或者人源或人源化β2微球蛋白序列。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是有核細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是已知表達(dá)mhci復(fù)合物的任意細(xì)胞，例如抗原遞呈細(xì)胞。所述細(xì)胞表達(dá)的人源或人源化β2微球蛋白多肽可以與內(nèi)源性非人源mhci(例如嚙齒動(dòng)物mhci)相互作用以形成功能性mhci復(fù)合物。所得到的mhci復(fù)合物可能能夠與t細(xì)胞例如細(xì)胞毒性t細(xì)胞相互作用。因此，本申請(qǐng)還提供了一種如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的細(xì)胞與t細(xì)胞的體外復(fù)合物。

本申請(qǐng)還提供了一種非人細(xì)胞，其包含人源或人源化β2微球蛋白基因或序列，以及附加的人源或人源化序列例如本申請(qǐng)公開的嵌合mhci多肽。在這種情況下，所述人源或人源化β2微球蛋白多肽可以與例如人源/非人源嵌合mhci多肽相互作用，并且形成功能性mhci復(fù)合物。在一些方面，這種復(fù)合物能夠與t細(xì)胞例如人源或非人源t細(xì)胞上的tcr相互作用。因此，本申請(qǐng)還提供了一種如本申請(qǐng)所述的非人源動(dòng)物的細(xì)胞與非人源t細(xì)胞形成的體外復(fù)合物。

本公開的另一個(gè)方面是一種嚙齒動(dòng)物胚胎(例如小鼠或大鼠胚胎)，其包含如本申請(qǐng)所述的異源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述胚胎包含es供體細(xì)胞，其包含所述異源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列，以及宿主胚胎細(xì)胞。所述異源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列是人源或人源化β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列。

本發(fā)明還包含一種非人動(dòng)物細(xì)胞，其包含如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的染色體或其片段(例如其中所述染色體或其片段包含編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列)。所述非人細(xì)胞可以包含如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的細(xì)胞核。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人細(xì)胞包含作為核轉(zhuǎn)移結(jié)果的所述染色體或其片段。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，其包含異源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞來(lái)源于本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述異源β2微球蛋白基因或β2微球蛋白序列是人源或人源化基因或序列。

本申請(qǐng)還提供了一種雜交瘤或四價(jià)體瘤，其來(lái)源于如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是小鼠或大鼠。

本公開還提供了一種制備本申請(qǐng)所述的基因改造的非人動(dòng)物(例如基因改造的嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)的方法。所述方法最終生成一種動(dòng)物，所述動(dòng)物的基因組中包含編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在一個(gè)方面，所述方法最終生成一種基因改造的小鼠，所述小鼠在其基因組的內(nèi)源性β2微球蛋白基因座包含編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列。在一些情況下，所述小鼠不表達(dá)來(lái)自于內(nèi)源性小鼠β2微球蛋白基因座的功能性小鼠β2微球蛋白。在一些方面，所述方法利用使用技術(shù)制備的靶向構(gòu)建體，將所述構(gòu)建體引入es細(xì)胞，并且使用技術(shù)將被靶向的es細(xì)胞克隆引入小鼠胚胎，如實(shí)施例所述。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述es細(xì)胞是129和c57bl/6小鼠品系的混合物；在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述es細(xì)胞是balb/c和129小鼠品系的混合物。

本申請(qǐng)還提供了一種用于生成基因改造的非人動(dòng)物的核苷酸構(gòu)建體。所述核苷酸構(gòu)建體可以包含：5’和3’非人同源臂、包含人β2微球蛋白序列的人dna片段和兩側(cè)具有重組位點(diǎn)的篩選基因表達(dá)盒。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人dna片段是包含人源β2微球蛋白基因的內(nèi)含子和外顯子的基因組片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人同源臂與非人源β2微球蛋白基因座具有同源性。所述基因組片段可以包含人β2微球蛋白基因的外顯子2、3和4。在一個(gè)例子中，所述基因組片段包含，從5’至3’：外顯子2、內(nèi)含子、外顯子3、內(nèi)含子和外顯子4、全部人β2微球蛋白序列。所述篩選基因表達(dá)盒可以位于構(gòu)建體中β2微球蛋白編碼區(qū)以外的任意位置，例如其可以位于人β2微球蛋白外顯子4的3’端。5’和3’非人同源臂可以分別包含內(nèi)源性非人β2微球蛋白基因的5’端和3’端基因組序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，5’和3’非人同源臂可以分別包含內(nèi)源性非人基因外顯子2的5’端和外顯子4的3’端基因組序列。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種修飾非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)的β2微球蛋白基因座的方法，以表達(dá)本申請(qǐng)所述的人源或人源化β2微球蛋白多肽。修飾小鼠的β2微球蛋白基因座以表達(dá)人源或人源化β2微球蛋白多肽的一種方法包括在內(nèi)源性β2微球蛋白基因座用編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列取代編碼小鼠β2微球蛋白的核苷酸序列。在這種方法的一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠不表達(dá)來(lái)自內(nèi)源性小鼠β2微球蛋白基因座的功能性β2微球蛋白多肽。在一些特定實(shí)施方式中，所述編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包含人β2微球蛋白基因外顯子2至4中所示的核苷酸序列。在其他實(shí)施方式中，編碼所述人源或人源化β2微球蛋白多肽的核苷酸序列包含人β2微球蛋白基因外顯子2、3和4中所示的核苷酸序列。

基因修飾mhci/β2微球蛋白的動(dòng)物

在多種實(shí)施方式中，本發(fā)明通常提供了一種基因修飾的非人動(dòng)物，所述動(dòng)物在其基因組中包含編碼人源或人源化mhci和β2微球蛋白多肽的核苷酸序列；因此所述動(dòng)物表達(dá)人源或人源化mhci和β2微球蛋白多肽。

在使用混合的人源/非人源系統(tǒng)組件時(shí)會(huì)出現(xiàn)功能差異。hlai類與β2微球蛋白的結(jié)合比小鼠i類緊密。bernabeu(1984)β2-microgobulinfromserumassociateswithmhcclassiantigensonthesurfaceofculturedcells,nature308:642-645。消除功能差異的嘗試體現(xiàn)在對(duì)特定人源化mhc小鼠的構(gòu)建上。已開發(fā)了h-2i類和2類敲除小鼠(在小鼠β2微球蛋白ko背景下)，其表達(dá)具有人的α1和α2以及小鼠h-2d^b的α3的隨機(jī)整合的人hla-a2.1/hla-dr1嵌合轉(zhuǎn)基因，其在n-末端通過(guò)接頭與人β2-微球蛋白的c-末端連接。參見例如pajot等，(2004)amousemodelofhumanadaptiveimmunefunctions:hla-a2.1-/hla-dr1-transgenich-2classi-/classii-knockoutmice,eur.j.immunol.34:3060-3069。據(jù)報(bào)道這些小鼠生成了針對(duì)乙肝病毒的抗原特異性抗體和ctl應(yīng)答，而僅具有hla-a2.1的轉(zhuǎn)基因小鼠或僅敲除h-2i類/ii類基因的小鼠則不會(huì)生成針對(duì)乙肝病毒的抗原特異性抗體和ctl應(yīng)答。據(jù)推測(cè)導(dǎo)致僅具有hla-a2.1的轉(zhuǎn)基因小鼠的缺陷的原因是這種小鼠具有引入內(nèi)源性i類和/或ii類基因以避免使用任何轉(zhuǎn)基因的能力，而mhc敲除小鼠則不具有這種選項(xiàng)。然而，所述小鼠至少可以表達(dá)h-2d^b，據(jù)推測(cè)這是由于培育到小鼠β2微球蛋白敲除背景的小鼠中造成的(參見pajot等，見前；其顯然包含完整的內(nèi)源性i類和ii類基因座)。

據(jù)報(bào)道與人β2微球蛋白融合的嵌合mhc在細(xì)胞表面的表達(dá)低于內(nèi)源性mhc的表達(dá)，但是未報(bào)導(dǎo)生存率/nk殺傷率以及nk自殺率。pajot等，見前。在mhci類-缺陷β2微球蛋白敲除的小鼠中觀察到了cd8+t細(xì)胞數(shù)的一些改善(占總脾細(xì)胞數(shù)的2-3％，相比之下在β2ko小鼠中為0.6-1％)。然而，t細(xì)胞可變區(qū)針對(duì)bv5.1、bv5.2和bv11基因片段使用情況發(fā)生了改變。據(jù)報(bào)道cd8+和cd4+t細(xì)胞應(yīng)答僅限于針對(duì)免疫所述小鼠的適宜乙肝抗原。但是當(dāng)小鼠僅經(jīng)過(guò)兩種抗原中的一種抗原免疫時(shí)，至少兩只小鼠殺死了攜帶所述兩種抗原中任意一種的細(xì)胞。這可能是由于缺乏nk細(xì)胞抑制或缺乏nk細(xì)胞選擇性導(dǎo)致的。

如上文所述，針對(duì)人mhci和人β2微球蛋白轉(zhuǎn)基因的小鼠包含編碼嵌合mhci/β2微球蛋白的核苷酸序列，其中所述mhci和β2微球蛋白部分包含在單一多肽鏈中，從而使得mhciα鏈和β2微球蛋白彼此之間通過(guò)共價(jià)鍵連接以將其栓系在細(xì)胞表面上。本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N小鼠，所述小鼠在其基因組中包含兩個(gè)獨(dú)立的核苷酸序列，其中一個(gè)編碼人源或人源化mhci多肽，另一個(gè)編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽。本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N小鼠，其將表達(dá)更像天然存在的mhci復(fù)合物的mhci復(fù)合物，其中在β2微球蛋白與mhciα鏈非共價(jià)結(jié)合的兩個(gè)單獨(dú)的多肽鏈上提供mhciα鏈和β2微球蛋白。

因此，本公開提供了一種非人動(dòng)物，所述動(dòng)物在其基因組中包含：編碼人源或人源化mhci多肽的第一核苷酸序列，以及編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列。在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N非人動(dòng)物，所述動(dòng)物在其基因組中包含：(a)編碼人源/非人源嵌合mhci多肽的第一核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人部分包含人mhci的肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域或胞外結(jié)構(gòu)域(例如hla-a、hla-b或hla-c；例如hla-a2)，以及(b)編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列。

所述第一核苷酸序列可以位于內(nèi)源性非人源mhci基因座，以使得所述動(dòng)物在其基因組的mhci基因座包含內(nèi)源性mhci基因的全部或部分(例如編碼肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域或胞外結(jié)構(gòu)域的部分)被相應(yīng)的人mhci序列取代。因此，所述動(dòng)物可以在內(nèi)源性mhci基因座包含編碼人mhci(例如hla-a、hla-b或hla-c；例如hla-a2)胞外結(jié)構(gòu)域以及內(nèi)源性非人源mhci(例如h-2k、h-2d等，例如h-2kb)跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在一個(gè)方面，所述動(dòng)物是小鼠，并且所述第一核苷酸序列包含編碼人hla-a2(例如hla-a2.1)胞外結(jié)構(gòu)域以及小鼠h-2k(例如h-2kb)跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。

所述第二核苷酸序列可以位于內(nèi)源性非人源β2微球蛋白基因座，以使得所述動(dòng)物在其基因組的β2微球蛋白基因座包含內(nèi)源性β2微球蛋白基因的全部或部分被相應(yīng)的人β2微球蛋白序列取代。所述第二核苷酸序列可以包含人β2微球蛋白基因外顯子2至外顯子4所示的核苷酸序列。或者，所述第二核苷酸序列可以包含人β2微球蛋白基因外顯子2、3和4所示的核苷酸序列。在這個(gè)實(shí)施方式中，核苷酸序列彼此之間可操作地連接。所述第二核苷酸序列可以進(jìn)一步包含非人β2微球蛋白外顯子1的序列。

在一個(gè)方面，所述動(dòng)物不表達(dá)來(lái)自內(nèi)源性非人源mhci基因座的功能性mhci(例如不表達(dá)內(nèi)源性mhci的肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域)，并且所述動(dòng)物不表達(dá)來(lái)自內(nèi)源性非人源β2微球蛋白基因座的功能性β2微球蛋白多肽。在一些方面，所述動(dòng)物針對(duì)包含編碼人源/非人源嵌合mhci多肽的核苷酸序列的mhci基因座以及包含編碼人源或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列的β2微球蛋白基因座是純合的。在其他方面，所述動(dòng)物針對(duì)包含編碼人源/非人源嵌合mhci多肽的核苷酸序列的mhci基因座以及包含編碼人源或人源化β2微球蛋白的核苷酸序列的β2微球蛋白基因座是雜合的。

優(yōu)選地，所述第一和第二核苷酸序列可操作地與內(nèi)源性表達(dá)調(diào)控元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子等)連接。

本申請(qǐng)包含的所述第一和第二核苷酸序列(及其編碼的多肽)的多種其他實(shí)施方式是根據(jù)說(shuō)明書所描述的實(shí)施方式易于理解的，例如涉及基因改造的mhci動(dòng)物和基因改造的β2微球蛋白動(dòng)物的章節(jié)所描述的那些。

在一個(gè)方面，本公開提供了一種小鼠，所述小鼠在其基因組中包含(a)編碼人源/小鼠嵌合mhci多肽(特別是hla-a2/h-2k多肽)的第一核苷酸序列，其中所述嵌合多肽的人部分包含人hla-a2的胞外結(jié)構(gòu)域和小鼠部分包含小鼠h-2k的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，以及(b)編碼人源或人源化β2微球蛋白多肽的第二核苷酸序列(例如，其中所述核苷酸序列包含人源β2微球蛋白基因外顯子2至外顯子4所示的核苷酸序列或人源β2微球蛋白基因外顯子2、3和4所示的核苷酸序列)，其中所述第一核苷酸序列位于內(nèi)源性h-2k基因座，以及所述第二序列位于內(nèi)源性β2微球蛋白基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠不表達(dá)來(lái)自其各自內(nèi)源性基因座的功能性h-2k和小鼠β2微球蛋白多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠表達(dá)人源/小鼠嵌合mhci多肽和人源或人源化β2微球蛋白多肽。

如下述實(shí)施例所述，與僅針對(duì)mhci人源化的動(dòng)物相比，共表達(dá)人源或人源化mhci和β2微球蛋白的基因改造的動(dòng)物顯示出在細(xì)胞表面嵌合mhci類的表達(dá)增加。在一些實(shí)施方式中，與缺乏人源或人源化β2微球蛋白時(shí)人源或人源化mhci的表達(dá)相比，人源或人源化mhci和β2微球蛋白的共表達(dá)使得人源或人源化mhci在細(xì)胞表面表達(dá)的增加超過(guò)約10％，例如超過(guò)約20％，例如超過(guò)約50％或以上，例如約70％。

本公開還提供了一種制備基因改造的非人動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如大鼠或小鼠)的方法，其基因組包含本申請(qǐng)所述的第一和第二核苷酸序列。所述方法通常包括生成第一基因改造的非人動(dòng)物，其基因組包含本申請(qǐng)所述的第一核苷酸序列(即人源或人源化mhci序列)，生成第二基因改造的非人動(dòng)物，其基因組包含本申請(qǐng)所述的第二核苷酸序列(即人源或人源化β2微球蛋白序列)，以及將所述第一和第二動(dòng)物交配以獲得其基因組含有這兩種核苷酸序列的子代。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一和第二動(dòng)物分別針對(duì)所述第一和第二核苷酸序列是雜合的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一和第二動(dòng)物分別針對(duì)所述第一和第二核苷酸序列是純合的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一和第二動(dòng)物通過(guò)分別使用所述第一和第二核苷酸序列取代內(nèi)源性非人源基因座產(chǎn)生。在一個(gè)方面，所述第一和第二動(dòng)物通過(guò)利用技術(shù)生成構(gòu)建體并通過(guò)法將攜帶這種構(gòu)建體的目的es細(xì)胞克隆引入胚胎(例如嚙齒動(dòng)物胚胎，例如小鼠或大鼠胚胎)生成。

基因修飾動(dòng)物的用途

在多種實(shí)施方式中，本申請(qǐng)所述的基因修飾的非人動(dòng)物生成在細(xì)胞表面具有人源或人源化mhci和/或β2微球蛋白的apc，并且作為結(jié)果以人樣方式作為針對(duì)ctl的表位遞呈來(lái)源于胞質(zhì)蛋白的肽，因?yàn)閺?fù)合物基本上所有的組分均是人源或人源化的。本發(fā)明基因修飾的非人動(dòng)物可以用于在人源化動(dòng)物中研究人免疫系統(tǒng)的功能；用于鑒定激發(fā)免疫應(yīng)答(例如t細(xì)胞表位，例如獨(dú)特的人癌表位)的抗原和抗原表位，例如用于開發(fā)疫苗；用于鑒定針對(duì)人病原體或癌抗原的高親和性t細(xì)胞(即在具有高親合力的人mhci復(fù)合物背景下與抗原結(jié)合的t細(xì)胞)，例如用于適應(yīng)性t細(xì)胞治療；用于評(píng)估疫苗候選物和其他疫苗策略；用于研究人自身免疫；用于研究人感染性疾??；以及設(shè)計(jì)基于人mhc表達(dá)的其他更好的治療策略。

mhci復(fù)合物與肽結(jié)合并將其遞呈至細(xì)胞表面。在這種復(fù)合物背景下一旦被遞呈至表面，所述肽被t細(xì)胞識(shí)別。例如，當(dāng)所述肽來(lái)源于病原體或其他所關(guān)注的抗原(例如腫瘤抗原)時(shí)，t細(xì)胞識(shí)別能夠造成t細(xì)胞活化，巨噬細(xì)胞殺死攜帶所遞呈肽序列的細(xì)胞以及b細(xì)胞激活與所遞呈的序列結(jié)合的抗體。

t細(xì)胞通過(guò)肽結(jié)合mhci類胞外結(jié)構(gòu)域和t細(xì)胞的cd8胞外結(jié)構(gòu)域與表達(dá)mhci復(fù)合物的細(xì)胞相互作用。cd8+t細(xì)胞遇到具有適合與mhci類分子結(jié)合的抗原的apc將形成細(xì)胞毒性t細(xì)胞。因此，在mhci類背景下以高親合力與t細(xì)胞受體結(jié)合的抗原在對(duì)人類疾病治療的研發(fā)中具有潛在的重要意義。然而，在小鼠mhci背景下的抗原遞呈僅與人類疾病略微相關(guān)，因?yàn)槿撕托∈髆hc復(fù)合物識(shí)別不同的抗原，例如小鼠mhci與人mhci可能不識(shí)別相同抗原或可能遞呈不同表位。因此，針對(duì)人類病理學(xué)的大部分相關(guān)數(shù)據(jù)是通過(guò)對(duì)人mhci遞呈的抗原表位的研究中獲得的。

因此，在多種實(shí)施方式中，本發(fā)明的基因改造的動(dòng)物除了其他方面以外在評(píng)估抗原在人體內(nèi)啟動(dòng)免疫應(yīng)答的能力方面是有用的，并且用于生成多樣抗原以及鑒定可以用于人用疫苗研發(fā)中的特定抗原。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N在具有某種肽序列的人中確定抗原性的方法，所述方法包括將如本申請(qǐng)所述的基因修飾的非人動(dòng)物與包含所述肽序列的分子接觸，使所述非人動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且檢測(cè)非人動(dòng)物中與本申請(qǐng)所述的人源/非人源嵌合mhci或人源化的mhci復(fù)合物(包含人源/非人源嵌合mhci和人源或人源化β2微球蛋白)遞呈的所述肽序列結(jié)合的細(xì)胞。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N確定是否某種肽將在人體內(nèi)激發(fā)細(xì)胞免疫的方法，所述方法包括將如本申請(qǐng)所述的基因修飾的非人動(dòng)物與所述肽接觸，使所述非人動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且檢測(cè)非人動(dòng)物中通過(guò)本申請(qǐng)所述的人源/非人源嵌合mhci類分子與所述肽的序列結(jié)合的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，接觸后的所述非人動(dòng)物包含與所述肽結(jié)合的mhci類-限制性的cd8+細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)。在一個(gè)實(shí)施方式中，ctl殺死攜帶所述肽的細(xì)胞。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N用于鑒定人ctl表位的方法，所述方法包括將如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物與包含預(yù)測(cè)ctl表位的抗原接觸，使所述非人動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從所述非人動(dòng)物中分離與所述表位結(jié)合的mhci類-限制性的cd8+ctl，并且鑒定與mhci類-限制性的cd8+ctl結(jié)合的表位。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N鑒定hlai類-限制性的肽的方法，所述肽通過(guò)人細(xì)胞遞呈和通過(guò)人淋巴細(xì)胞(例如人t細(xì)胞)結(jié)合結(jié)果將對(duì)攜帶所述肽的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，所述方法包括將如本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物(或其表達(dá)mhci類的細(xì)胞)與包含所關(guān)注肽的分子接觸，分離表達(dá)與所關(guān)注的肽結(jié)合的人源/非人源嵌合i類分子的非人動(dòng)物細(xì)胞，將所述細(xì)胞與能夠產(chǎn)生hlai類-限制性的細(xì)胞毒性的人淋巴細(xì)胞接觸，并且檢測(cè)肽誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N鑒定在人體內(nèi)生成細(xì)胞毒性t細(xì)胞應(yīng)答的抗原的方法，所述方法包括將預(yù)測(cè)抗原與如本申請(qǐng)所述的小鼠接觸，使所述小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且鑒定與hla-a-限制性的分子結(jié)合的抗原。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原包括細(xì)菌或病毒表面或包膜蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原包括人腫瘤細(xì)胞表面上的抗原。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原包括假定供人體內(nèi)使用的疫苗。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原包括在人體內(nèi)產(chǎn)生抗體的人表位。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原包括產(chǎn)生靶向表位/mhci復(fù)合物的高親和性ctl的人表位。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N確定是否預(yù)測(cè)抗原含有某一表位的方法，所述表位暴露于人免疫系統(tǒng)后產(chǎn)生hla-a-限制性的免疫應(yīng)答(例如hla-a2-限制性的應(yīng)答)，所述方法包括將如本申請(qǐng)所述的小鼠與預(yù)測(cè)抗原接觸并且測(cè)定小鼠中的抗原特異性hla-a-限制性的(例如hla-a2-限制性的)免疫應(yīng)答。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述預(yù)測(cè)抗原選自生物藥品或其片段、非自身蛋白、非自身細(xì)胞的表面抗原、腫瘤細(xì)胞的表面抗原、細(xì)菌或酵母或真菌細(xì)胞的表面抗原、病毒的表面抗原或包膜蛋白。

此外，本申請(qǐng)所述的基因改造的非人動(dòng)物可以用于鑒定t細(xì)胞受體，例如高親合力t細(xì)胞受體，其識(shí)別所關(guān)注的抗原，例如腫瘤或其他疾病抗原。所述方法可以包括：將本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物與抗原接觸，使所述非人動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答，從所述非人動(dòng)物中分離包含與由人源或人源化mhci遞呈的抗原結(jié)合的t細(xì)胞受體的t細(xì)胞，以及確定所述t細(xì)胞受體的序列。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N鑒定對(duì)人腫瘤抗原具有高親和性的t細(xì)胞受體可變結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括將包含人源化mhciα1、α2和α3結(jié)構(gòu)域(例如hla-a2α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域)的小鼠與人腫瘤抗原接觸；使所述小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答；以及從所述小鼠中分離編碼t細(xì)胞受體可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列，其中所述t細(xì)胞受體可變結(jié)構(gòu)域與人腫瘤抗原結(jié)合的kd不高于約1納摩。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠進(jìn)一步在內(nèi)源性小鼠t細(xì)胞受體可變區(qū)基因座包含多個(gè)未經(jīng)重排的人t細(xì)胞受體可變基因片段的取代，其中所述未經(jīng)重排的人t細(xì)胞受體可變區(qū)基因片段與編碼包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的人-小鼠嵌合t細(xì)胞受體的基因重組。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含人cd8轉(zhuǎn)基因，并且所述小鼠表達(dá)功能性的人cd8蛋白。

對(duì)腫瘤抗原具有高親合力的t細(xì)胞受體用于基于細(xì)胞的治療。已通過(guò)將人t細(xì)胞與hla-a2接觸制備針對(duì)人腫瘤抗原具有高親合力的t細(xì)胞群，所述hla-a2已經(jīng)過(guò)突變使得cd8與α3亞基的結(jié)合最小化，以僅選擇那些對(duì)腫瘤抗原具有極高親合力的t細(xì)胞(即盡管cd8不能與α3結(jié)合但識(shí)別所述抗原的t細(xì)胞克隆)。參見pittet等，(2003)α3domainmutantsofpeptide/mhcclassimultimersallowtheselectiveisolationofhighaviditytumor-reactivecd8tcells,j.immunol.171:1844-1849。所述非人動(dòng)物和非人動(dòng)物細(xì)胞用于鑒定與同t細(xì)胞受體高親合力地結(jié)合的人hlai類形成復(fù)合物或活化的攜帶t細(xì)胞受體的淋巴細(xì)胞的肽。

可以采用本領(lǐng)域公知的任何適宜方法檢測(cè)與t細(xì)胞結(jié)合或活化t細(xì)胞的抗原/hlai類。肽-特異性apc-t細(xì)胞的結(jié)合和活化是可檢測(cè)的。例如，據(jù)報(bào)道t細(xì)胞與表達(dá)hla-a2的抗原遞呈細(xì)胞的結(jié)合導(dǎo)致pip2在免疫突觸中的蓄積，然而交聯(lián)的mhci類分子則不會(huì)。參見fooksman等，(2009)cuttingedge:phosphatidylinositol4,5-bisphosphateconcentrationattheapcsideoftheimmunologicalsynapseisrequiredforeffectortcellfunction,j.immunol.182:5179-5182。

攜帶tcr的淋巴細(xì)胞與表達(dá)i類的apc相互作用的功能性后果也是可檢測(cè)的，并且其包括通過(guò)所述淋巴細(xì)胞的細(xì)胞殺傷。例如，據(jù)報(bào)道hla-a2α2亞基的接觸點(diǎn)通過(guò)cd8+ctl產(chǎn)生不依賴于fas的殺傷信號(hào)。當(dāng)在已知(來(lái)自晶體學(xué)研究)與cd8接觸的hla-a2分子的表位上接觸(通過(guò)抗體)時(shí)，表達(dá)hla-a2-的jurkat細(xì)胞凋亡，其對(duì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域不具有任何顯著的依賴性。參見pettersen等，(1998)thetcr-bindingregionofthehlaclassiα2domainsignalsrapidfas-independentcelldeath:adirectpathwayfortcell-mediatedkillingoftargetcells？j.immunol.160:4343-4352。據(jù)推測(cè)由hla-a2α2與cd8+ctl的cd8接觸誘導(dǎo)的迅速殺傷作用可能主要是由于這種不依賴于fas的hla-a2-介導(dǎo)的通路導(dǎo)致的(同上.)，因?yàn)槠洳煌诓灰蕾噒cr的α3結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的殺傷作用——其自身能夠誘導(dǎo)凋亡(參見woodle等，(1997)anti-humanclassimhcantibodiesinduceapoptosisbyapathwaythatisdistinctfromthefasantigen-mediatedpathway,j.immunol.158:2156-2164)。

還可以通過(guò)t細(xì)胞增殖檢測(cè)測(cè)定在mhci背景下t細(xì)胞與apc展示的肽之間相互作用的后果?；蛘撸淇梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)通常與免疫應(yīng)答的活化相關(guān)的細(xì)胞因子的釋放確定。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用ifnγelispot對(duì)cd8+t細(xì)胞的活化進(jìn)行監(jiān)測(cè)和定量。

如本申請(qǐng)所述，在本申請(qǐng)所述的基因修飾的非人動(dòng)物中由于cd8與mhci的種屬特異性結(jié)合可以阻止cd8+t細(xì)胞的活化。對(duì)于種屬特異性cd8相互作用是理想的實(shí)施方式而言，如本申請(qǐng)所述的基因修飾動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠)的細(xì)胞與人細(xì)胞接觸(例如在體外)，例如人攜帶cd8的細(xì)胞，例如人t細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，如本申請(qǐng)所述的小鼠表達(dá)mhci類的細(xì)胞在體外與包含人cd8和t細(xì)胞受體的t細(xì)胞接觸。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，所述t細(xì)胞是人t細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠表達(dá)mhci類的細(xì)胞包含與人源/小鼠嵌合mhci或者人源化mhci復(fù)合物(其包括人β2微球蛋白)結(jié)合的肽，所述t細(xì)胞是人t細(xì)胞，并且測(cè)定t細(xì)胞與展示所述肽的小鼠細(xì)胞結(jié)合的能力。在一個(gè)實(shí)施方式中，測(cè)定通過(guò)展示所述肽的小鼠細(xì)胞對(duì)人t細(xì)胞的活化。在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N通過(guò)展示所述肽的細(xì)胞檢測(cè)人t細(xì)胞活化的體外方法，所述方法包括將如本申請(qǐng)所述的小鼠或小鼠細(xì)胞與所關(guān)注的抗原接觸，將來(lái)自所述小鼠的細(xì)胞或所述小鼠細(xì)胞(假定其攜帶來(lái)源于與人源或人源化mhci形成復(fù)合物的抗原的肽)與人t細(xì)胞接觸，并且測(cè)定人t細(xì)胞的活化情況。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法用于鑒定人病原體或人腫瘤的t細(xì)胞表位。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法用于鑒定疫苗的表位。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N確定由假定的人體治療造成的t細(xì)胞活化的方法，所述方法包括將如本申請(qǐng)所述的基因修飾動(dòng)物與假定的人體治療接觸(或者例如將來(lái)源于這種動(dòng)物的表達(dá)人源或人源化mhci的細(xì)胞與假定治療的肽序列接觸)，將來(lái)源于基因修飾動(dòng)物的展示人源或人源化mhci/肽復(fù)合物的細(xì)胞與包含能夠與所述基因修飾動(dòng)物的細(xì)胞結(jié)合的人t細(xì)胞受體和cd8的t細(xì)胞接觸，以及檢測(cè)被基因修飾動(dòng)物展示所述肽的細(xì)胞誘導(dǎo)的人t細(xì)胞的活化情況。

在多種實(shí)施方式中，使用包含人cd8序列的t細(xì)胞例如人t細(xì)胞或包含編碼人cd8的轉(zhuǎn)基因的非人動(dòng)物t細(xì)胞制備與來(lái)自如本申請(qǐng)所述動(dòng)物的表達(dá)人源或人源化mhci類的細(xì)胞形成的復(fù)合物。人cd8的轉(zhuǎn)基因小鼠是本領(lǐng)域公知的。tishon等，(2000)trangenicmiceexpressinghumanhlaandcd8moleculesgeneratehla-restrictedmeaslesviruscytotoxictlymphocytesofthesamespecificityashumanswithnaturalmeaslesvirusinfection,virology275(2):286-293；laface等，(1995)humancd8transgeneregulationofhlarecognitionbymurinetcells,j.exp.med.182:1315-1325。

除了能夠鑒定人病原體或腫瘤的抗原和抗原表位以外，本發(fā)明的基因修飾動(dòng)物還用于鑒定與人自身免疫性疾病相關(guān)的自身抗原，例如i型糖尿病、多發(fā)性硬化癥等。例如，takaki等((2006)hla-a*0201-restrictedtcellsfromhumanizednodmicerecognizeautoantigensofpotentialclinicalrelevancetotype1diabetes,j.immunol.176:3257-65)描述了利用攜帶hla/β2微球蛋白單鏈的nod小鼠鑒定1型糖尿病的自身抗原。本發(fā)明的基因修飾動(dòng)物還用于研究人自身免疫性疾病的不同方面。因?yàn)橐恍┒鄳B(tài)性的人mhci等位基因已知與某些疾病的進(jìn)展相關(guān)，例如自身免疫性疾病(例如格雷夫斯氏病、重癥肌無(wú)力、牛皮癬等；參見bakker等，(2006)ahigh-resolutionhlaandsnphaplotypemapfordiseaseassociationstudiesintheextendedhumanmhc,naturegenetics38:1166-72和supplementaryinformationandinternationalmhcandautoimmunitygeneticsnetwork(2009)mappingofmultiplesusceptibilityvariantswithinthemhcregionfor7immune-mediateddiseases,proc.natl.acad.sci.usa106:18680-85，其均通過(guò)引用并入本申請(qǐng))，包含包括這種等位基因的人源化mhci基因座的本發(fā)明的基因修飾動(dòng)物可以作為自身免疫性疾病模型。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述疾病的等位基因是hla-b27，并且所述疾病是強(qiáng)直性脊柱炎或反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎；因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，用于研究這些疾病的動(dòng)物包含人源或人源化hla-b27。

涉及mhci復(fù)合物的細(xì)胞免疫的其他方面是本領(lǐng)域公知的；因此，本申請(qǐng)所述的基因改造的非人動(dòng)物可以用于研究免疫生物學(xué)的這些方面。例如，在體內(nèi)tcr與mhci類的結(jié)合受到其他因素的調(diào)節(jié)。白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體亞家族b成員(lilrb1或lir-1)在mhci類-限制性的ctl上表達(dá)并且通過(guò)與apc上mhci類分子的α3亞基上的特定決定簇結(jié)合下調(diào)t細(xì)胞的刺激作用。結(jié)構(gòu)研究顯示lir-1與cd8的結(jié)合位點(diǎn)重疊，這表明抑制性的lir-1與刺激性的cd8競(jìng)爭(zhēng)性與mhci類分子結(jié)合。willcox等，(2003)crystalstructureofhla-a2boundtolir-1,ahostandviralmajorhistocompatibilitycomplexreceptor,natureimmunology4(9):913-919；shirioshi等，(2003)humaninhibitoryreceptorsig-liketranscript2(ilt2)andilt4competewithcd8formhcclassibindingandbindpreferentiallytohla-g,proc.natl.acad.sci.usa100(15):8856-8861。lir-1通過(guò)其(細(xì)胞內(nèi))免疫受體酪氨酸抑制基序(itim)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性信號(hào)。在nk細(xì)胞中，研究表明缺乏itim(通常無(wú)法抑制)的kir(抑制性殺傷細(xì)胞ig樣受體)能夠在lir-1存在的情況下抑制與mhci類分子的α3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合(假設(shè)通過(guò)lir-1itim)(參見kirwin等，(2005)killercellig-likereceptor-dependentsignalingbyig-liketranscript2(ilt2/cd85j/lilrb1/lir-1)j.immunol.175:5006-5015)，這表明與mhci類結(jié)合的lir-1與kir之間是協(xié)同作用的，從而在調(diào)節(jié)nk細(xì)胞抑制的hlaα3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合中發(fā)揮作用。

如上文所述，mhc分子與不表達(dá)tcr的細(xì)胞相互作用。這些細(xì)胞是nk細(xì)胞。nk細(xì)胞是細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(不同于ctl或細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞)，其在細(xì)胞免疫應(yīng)答特別是先天免疫中發(fā)揮核心作用。nk細(xì)胞是針對(duì)微生物、病毒和其他非自身(例如腫瘤)實(shí)體入侵的第一道防線。nk細(xì)胞通過(guò)表面受體被激活或抑制，并且其表達(dá)cd8但不表達(dá)tcr。nk細(xì)胞能夠與表達(dá)mhci類的細(xì)胞相互作用，但是該相互作用是通過(guò)cd8-結(jié)合α3結(jié)構(gòu)域而非tcr-結(jié)合、肽攜帶的α1和α2結(jié)構(gòu)域。nk細(xì)胞的主要功能是破壞缺乏充足mhci表面蛋白的細(xì)胞。

在自然殺傷(nk)細(xì)胞表面的交聯(lián)mhci類分子使得細(xì)胞內(nèi)酪氨酸磷酸化、mhci類分子從免疫突觸遷移和腫瘤細(xì)胞殺傷下調(diào)。rubio等，(2004)cross-linkingofmhcclassimoleculesonhumannkcellsinhibitsnkcellfunction,segregatesmhcifromthenkcellsynapse,andinducesintracellularphosphotyrosines,j.leukocytebiol.76:116-124。

nk細(xì)胞中的mhci類的另一個(gè)功能顯然是防止自殺。nk細(xì)胞攜帶活化受體2b4和2b4的配體cd48；mhci類可能與2b4結(jié)合并阻止cd48對(duì)其的活化。betser-cohen(2010)theassociationofmhcclassiproteinswiththe2b4receptorinhibitsself-killingofhumannkcells,j.immunol.184:2761-2768。

因此，本申請(qǐng)所述的基因改造的非人動(dòng)物能夠用于研究這些非-tcr或非-ctl介導(dǎo)的過(guò)程以及設(shè)計(jì)用于其調(diào)節(jié)的方法。

實(shí)施例

本申請(qǐng)將通過(guò)下述的非限制性實(shí)施例對(duì)所述發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明。這些實(shí)施例被列出以輔助闡述本發(fā)明，但并非旨在且不應(yīng)被解釋為以任何方式限制其范圍。所述實(shí)施例不包括對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員公知的常規(guī)方法(分子克隆技術(shù)等)的描述。除非另有明示，否則份為重量份，分子量是平均分子量，溫度以攝氏度表示且壓力為處于或接近大氣壓。

實(shí)施例1：基因修飾hla-a2小鼠的構(gòu)建和表征

實(shí)施例1:1：hla-a2/h-2k在mg87細(xì)胞中的表達(dá)。

使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)制備含有hla-a2/h-2k嵌合基因序列(圖4a)的病毒構(gòu)建體，以分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞中人源/小鼠嵌合mhci的表達(dá)情況。

簡(jiǎn)言之，使用編碼α鏈α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域的外顯子序列制備人源hla-a/小鼠h-2k嵌合病毒構(gòu)建體并將其克隆至小鼠h-2k基因跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域編碼序列的框架中(圖4a，pmig-hla-a2/h2k)。如圖4所示，所述構(gòu)建體含有ires-gfp受體序列，其能夠用于確定是否所述構(gòu)建體能夠在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)。

在人胚腎293(293t)細(xì)胞中制備和擴(kuò)增含有上文所述嵌合構(gòu)建體的病毒。將293t細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中并使其生長(zhǎng)至95％融合。使用25μgpmig-hla-a2/h2k、pmig-人hla-a2或pmig-人源化β2微球蛋白以及5μgpmdg(包膜質(zhì)粒)、15μgpcl-eco(無(wú)包裝信號(hào)ψ的包裝構(gòu)建體)、1mlopti-mem(invitrogen)制備dna轉(zhuǎn)染混合物。將1ml已事先混合在一起并在室溫下孵育5分鐘的該dna混合物加入含80μllipofectamine-2000(invitrogen)的1mlopti-mem中。將lipofectamine/dna混合物在室溫下繼續(xù)孵育20分鐘，然后加入10cm培養(yǎng)皿中，并將該培養(yǎng)皿在37℃下孵育。24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)基并將10ml新鮮的r10(rpmi1640+10％fbs)培養(yǎng)基加入細(xì)胞中。重復(fù)更換兩次該培養(yǎng)基?？傆?jì)4天后，將所收集的培養(yǎng)基混合，離心并使用無(wú)菌濾器過(guò)濾以除去細(xì)胞碎片。

使用上述制備的擴(kuò)增病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)mg87(小鼠成纖維細(xì)胞)細(xì)胞。使用pbs洗滌一次來(lái)自單一t-75培養(yǎng)瓶的mg87細(xì)胞。將3ml0.25％胰酶+edta加入細(xì)胞中并在室溫下孵育3分鐘。將7mld10(高葡萄糖dmem；10％胎牛血清)加入細(xì)胞/胰酶混合物中并轉(zhuǎn)移至15ml試管中1300rpm離心5分鐘。離心細(xì)胞后，吸出培養(yǎng)基并將細(xì)胞重懸于5mld10中。計(jì)數(shù)細(xì)胞并以～3.0x10⁵個(gè)細(xì)胞每孔接種于6孔板中。將pmig-人hla-a2或pmig-hla-a2/h-2k單獨(dú)或與pmig-人源化β2微球蛋白病毒一并加入孔中，使用未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞作為對(duì)照。將細(xì)胞在37℃5％co2條件下孵育2天。制備細(xì)胞用于針對(duì)在存在或不存在β2微球蛋白的條件下hla-a2表達(dá)的facs分析(使用抗-hla-a2抗體，克隆bb7.2)。

圖(圖4b)以及匯總圖中數(shù)據(jù)的表(圖4c)中的結(jié)果表明與人源化β2微球蛋白共轉(zhuǎn)染增加人hla-a2或人源/非人源嵌合hla-a2/h-2k的表達(dá)，如曲線向右側(cè)遷移所示。

實(shí)施例1.2：改造嵌合hla-a2/h-2k基因座。

利用使用技術(shù)的來(lái)自人和小鼠細(xì)菌人工染色體(bac)dna的獨(dú)特靶向載體將小鼠h-2k基因一步人源化(參見例如美國(guó)專利號(hào)6,586,251和valenzuela等，(2003)high-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis.nat.biotech.21(6):652-659)。通過(guò)同源重組用編碼人hla-a基因α1、α2和α3亞基的人基因組dna取代編碼小鼠h-2k基因α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域與的基因組dna對(duì)來(lái)自小鼠bac克隆rp23-173k21(invitrogen)的dna進(jìn)行修飾(圖5)。

簡(jiǎn)言之，在單一靶向事件中使用編碼人hla-a*0201基因α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域的人基因組dna取代編碼小鼠h-2k基因α1、α2和α3亞基的基因組序列，所述單一事件使用靶向載體，其包含在兩側(cè)具有l(wèi)oxp位點(diǎn)的潮霉素表達(dá)盒，所述潮霉素表達(dá)盒具有5’小鼠同源臂，其包含包括5’非翻譯區(qū)的小鼠h-2k基因座的5’序列(utr；5’同源臂如seqidno:1所示)，以及3’小鼠同源臂，其包含小鼠h-2kα3編碼序列的3’基因組序列(3’同源臂如seqidno:2所示)。

用于靶向內(nèi)源性h-2k基因座的最終構(gòu)建體從5’至3’包括：(1)5’同源臂，其包含～200bp包括5’utr的內(nèi)源性h-2k基因的小鼠5’基因組序列，(2)～1339bp人基因組序列，其包括hla-a*0201先導(dǎo)序列、hla-a*0201先導(dǎo)/α1內(nèi)含子、hla-a*0201α1外顯子、hla-a*0201α1-α2內(nèi)含子、hla-a*0201α2外顯子、～316bpα2-α3內(nèi)含子的5’端，(3)5’loxp位點(diǎn)，(4)潮霉素表達(dá)盒，(5)3’loxp位點(diǎn)，(6)～580bp人基因組序列，其包括～304bpα2-α3內(nèi)涵子的3’端、hla-a*0201α3外顯子和(7)3’同源臂，其包含～200bp包括小鼠h-2kα3與跨膜編碼序列之間的內(nèi)含子的小鼠基因組序列(參見圖5針對(duì)h-2k靶向載體的示意圖)。在靶向載體5’端小鼠/人序列接頭處140個(gè)核苷酸的序列如seqidno:3所示，在靶向載體3’端人/小鼠序列接頭處159個(gè)核苷酸的序列如seqidno:4所示。使用該靶向載體進(jìn)行同源重組得到了經(jīng)修飾的小鼠h-2k基因座，其含有與內(nèi)源性小鼠h-2k跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的編碼序列可操作地連接的編碼hla-a*0201基因α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域的人基因組dna，其在翻譯后將形成人源/小鼠嵌合mhci類蛋白。

使用目標(biāo)bacdna電穿孔小鼠f1h4es細(xì)胞以形成用于生成在有核細(xì)胞(例如t和b淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)表面表達(dá)的嵌合mhci類蛋白的小鼠的經(jīng)修飾的es細(xì)胞。通過(guò)定量taqman^tm檢測(cè)鑒定含有人hla序列插入的es細(xì)胞。設(shè)計(jì)特定的引物對(duì)和探針檢測(cè)人hla序列以及相關(guān)篩選基因表達(dá)盒(獲得等位基因goa)的插入以及內(nèi)源性小鼠序列的缺失(缺失等位基因loa)。表1中顯示了在定量pcr檢測(cè)中使用的各探針的名稱以及檢測(cè)部位。

表1：檢測(cè)基因型使用的探針

可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人源公知的方法除去篩選基因表達(dá)盒。例如，可以使用表達(dá)cre的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染攜帶人源/小鼠嵌合mhci類基因座的es細(xì)胞以除去插入含有人hla-a*0201基因序列的靶向構(gòu)建體引入的“l(fā)oxed”潮霉素表達(dá)盒(見圖5)。可以任選地通過(guò)與表達(dá)cre重組酶的小鼠交配除去潮霉素表達(dá)盒。任選地，所述潮霉素表達(dá)盒保留在小鼠中。

使用上文所述的靶向es細(xì)胞作為供體es細(xì)胞并通過(guò)法引入8-細(xì)胞階段的小鼠胚胎中(參見例如美國(guó)專利號(hào)7,294,754和poueymirou等，(2007)f0generationmicethatareessentiallyfullyderivedfromthedonorgene-targetedescellsallowingimmediatephenotypicanalysesnaturebiotech.25(1):91-99)。使用改良的等位基因檢測(cè)(valenzuela等，同上)對(duì)獨(dú)立地?cái)y帶嵌合mhci類基因的(f0小鼠完全來(lái)源于供體es細(xì)胞)進(jìn)行基因型鑒定，其檢測(cè)獨(dú)特的人hla-a*0201基因序列的存在情況。

實(shí)施例1.3：在基因修飾的小鼠中嵌合hla-a/h-2k的體內(nèi)表達(dá)

對(duì)攜帶實(shí)施例1.2中所述的基因修飾的h-2k基因座的雜合子小鼠進(jìn)行分析，以檢測(cè)在所述動(dòng)物的細(xì)胞中嵌合hla-a/h-2k蛋白的表達(dá)情況。

分別從野生型和hla-a/h-2k嵌合雜合子(a2/h2k)小鼠中收集血樣。使用藻紅蛋白(pe)偶聯(lián)的抗-hla-a抗體對(duì)細(xì)胞中的人hla-a2進(jìn)行染色，并且將細(xì)胞與異藻藍(lán)蛋白偶聯(lián)的抗-h-2kb抗體在4℃下接觸1小時(shí)。采用流式細(xì)胞術(shù)使用對(duì)hla-a和h-2kb具有特異性的抗體分析細(xì)胞的表達(dá)情況。圖6a顯示了在野生型和嵌合雜合子中h-2kb和hla-a2的表達(dá)情況，所述嵌合雜合子表達(dá)這兩種蛋白。圖6b顯示了在雜合子小鼠中h-2kb和嵌合hla-a2/h2k的表達(dá)情況。

實(shí)施例2：基因修飾β2微球蛋白小鼠的構(gòu)建和表征

實(shí)施例2.1：工程化人源化β2微球蛋白基因座。

利用使用技術(shù)的來(lái)自人和小鼠細(xì)菌人工染色體(bac)dna的獨(dú)特靶向載體將小鼠β2微球蛋白(β2m)基因一步人源化(參見例如美國(guó)專利號(hào)6,586,251和valenzuela等，同上)。

簡(jiǎn)言之，通過(guò)將含有來(lái)自rpci-23文庫(kù)(invitrogen)bac克隆89c24的小鼠β2m上游和下游同源臂細(xì)菌同源重組產(chǎn)生靶向載體。對(duì)小鼠同源臂進(jìn)行工程化改造，在外顯子2至非編碼的外顯子4下游約267個(gè)核苷酸范圍的翼側(cè)插入2.8kb人β2mdna片段(圖7)。將在重組酶識(shí)別位點(diǎn)(例如loxp位點(diǎn))翼側(cè)設(shè)置的藥物篩選基因表達(dá)盒(新霉素)工程化至靶向載體以用于隨后的選擇。將最終的靶向載體線性化并電穿孔至f1h4小鼠es細(xì)胞系(valenzuela等，同上)。

通過(guò)法將出去藥物表達(dá)盒(通過(guò)引入cre重組酶)的靶向es細(xì)胞克隆引入8-細(xì)胞階段的小鼠胚胎(參見例如美國(guó)專利號(hào)7,294,754和poueymirou等，同上)。使用改良的等位基因檢測(cè)(valenzuela等，同上)通過(guò)篩選小鼠等位基因的缺失和人等位基因的獲得鑒定攜帶人源化β2m基因的(f0小鼠完全來(lái)源于供體es細(xì)胞)。

實(shí)施例2.2：人源化β2微球蛋白小鼠的表征

使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)針對(duì)人源化β2微球蛋白(β2m)基因是雜合子的小鼠的表達(dá)情況進(jìn)行評(píng)估(圖8和圖9)。

簡(jiǎn)言之，使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)從野生型、人源化β2m、人源化mhc(即人hla)i類以及β2m和mhci類雙人源化小鼠的組(每組n＝4)中分離血樣。使用ack裂解緩沖液(lonzawalkersville)處理每組中各只小鼠的血樣以除去紅細(xì)胞。使用熒光染料偶聯(lián)的抗-cd3(17a2)、抗-cd19(1d3)、抗-cd11b(m1/70)、抗-人hlai類和抗-人β2微球蛋白(2m2)抗體對(duì)其余細(xì)胞進(jìn)行染色。使用bd-facscanto^tm(bdbiosciences)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

對(duì)來(lái)自單一人源化和雙人源化動(dòng)物的細(xì)胞中人hlai類的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，而僅在來(lái)自雙人源化小鼠的細(xì)胞中對(duì)β2微球蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)(圖8)。與缺乏人β2m時(shí)人hlai類的表達(dá)相比，人β2m和人hlai類共表達(dá)使得人hlai類在細(xì)胞表面可檢測(cè)的量增加(圖9，平均熒光強(qiáng)度2370對(duì)比1387)。

實(shí)施例3：對(duì)來(lái)自表達(dá)hla-a2/h-2k和人源化β2微球蛋白的基因修飾小鼠的apc遞呈的flu和愛潑斯坦-巴爾病毒(ebv)肽的免疫應(yīng)答。

對(duì)來(lái)自若干人供體的pbmc進(jìn)行篩選，以確定hla-a2的表達(dá)及其產(chǎn)生針對(duì)flu和ebv肽的應(yīng)答的能力。選擇用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的單一供體。

使用反向選擇從所選擇供體的pbmc中分離人t細(xì)胞。從針對(duì)嵌合hla-a2/h-2k是雜合子和針對(duì)人源化β2-微球蛋白基因是雜合子的小鼠以及野生型小鼠中分離脾臟非-t細(xì)胞。將來(lái)自小鼠的約50,000個(gè)脾臟非-t細(xì)胞加入已使用抗人ifnγ抗體包被的elispot板中。加入flu肽(10微摩)或ebv肽的混合物(各5微摩)。加入polyic，25微克/孔，并將所述孔在37℃5％co2下孵育3小時(shí)。將人t細(xì)胞(50,000)和抗-人cd28加入脾臟非t細(xì)胞和所述肽中，并請(qǐng)將所述孔在37℃5％co2下孵育40小時(shí)，隨后進(jìn)行ifnγelispot檢測(cè)。

如圖10所示，當(dāng)由在其表面表達(dá)嵌合hla-a2/h-2k和人源化β2微球蛋白的小鼠apc遞呈時(shí)，人t細(xì)胞能夠產(chǎn)生針對(duì)flu和ebv多肽的應(yīng)答。

等同物

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠識(shí)別，或者能夠使用不超過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)確定本申請(qǐng)所述的發(fā)明的特定實(shí)施方式的多種等同物。這種等同物意圖被包含在下述權(quán)利要求中。

本申請(qǐng)通篇引用的非專利文件、專利申請(qǐng)和專利的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用整體并入本申請(qǐng)。

序列表

<110>瑞澤恩制藥公司

<120>制備主要組織相容性復(fù)合物基因修飾小鼠的方法

<130>0825a-wo

<150>61/552,582

<151>2011-10-28

<150>61/552,587

<151>2011-10-28

<150>61/700,908

<151>2012-09-14

<160>8

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>200

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>mhci目標(biāo)構(gòu)建體的5'同源臂

<400>1

ggattccccatctccacagtttcacttctgcacctaacctgggtcaggtccttctgtccg60

gacactgttgacgcgcagtcagctcttacccccattgggtggcgcgatcacccaagaacc120

aatcagtgtcgccgcggacgctggatataaagtccacgcagcccgcagaactcagaagtc180

gcgaatcgccgacaggtgcg200

<210>2

<211>200

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>mhci目標(biāo)構(gòu)建體的3'同源臂

<400>2

gtaaggagagtgtgggtgcagagctggggtcagggaaagctggagctttctgcagaccct60

gagctgctcagggctgagagctggggtcatgaccctcaccttcatttcttgtacctgtcc120

ttcccagagcctcctccatccactgtctccaacatggcgaccgttgctgttctggttgtc180

cttggagctgcaatagtcac200

<210>3

<211>149

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>人源/小鼠嵌合mhci基因座在小鼠/人序列5'端接頭處的序列

<400>3

agtgtcgccgcggacgctggatataaagtccacgcagcccgcagaactcagaagtcgcga60

atcgccgacaggtgcgatggccgtcatggcgccccgaaccctcgtcctgctactctcggg120

ggctctggccctgacccagacctgggcgg149

<210>4

<211>159

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>人源/小鼠嵌合mhci基因座在小鼠/人序列3'端接頭處的序列

<400>4

ggtggtgccttctggacaggagcagagatacacctgccatgtgcagcatgagggtttgcc60

caagcccctcaccctgagatggggtaaggagagtgtgggtgcagagctggggtcagggaa120

agctggagctttctgcagaccctgagctgctcagggctg159

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>檢測(cè)潮霉素表達(dá)盒的探針

<400>5

acgagcgggttcggcccattc21

<210>6

<211>27

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>檢測(cè)人hla-a2α2-α3內(nèi)含子的探針

<400>6

agtccttcagcctccactcaggtcagg27

<210>7

<211>25

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>檢測(cè)人hla-a2α2-外顯子的探針

<400>7

taccaccagtacgcctacgacggca25

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>檢測(cè)人hla-a2α2-α3內(nèi)含子的探針

<400>8

atcctgtaccagagagtg18