一、技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從蘿卜籽中提取硫代葡萄糖苷酶的方法。
二、
背景技術(shù)：
蘿卜又名萊菔、土人參，為十字花科蘿卜屬二年或一年生蔬菜作物，普遍種植于我國(guó)低海拔地區(qū)。蘿卜富含其他蔬菜少有的蘿卜苷及其降解產(chǎn)物萊菔素，且種子含油量高，是提取油脂、天然色素及其他抗氧化活性物質(zhì)的好原料，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。具體地說(shuō)，蘿卜作為一種十字花科植物，其中普遍含有硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶(又稱黑芥子酶)，含量則因品種、部位及生長(zhǎng)階段等的差異而不同，而在種子中的含量最高。在硫代葡萄糖苷酶的作用下，硫代葡萄糖苷水解生成的萊菔素具有抗氧化、抗菌除草、抗細(xì)胞突變等強(qiáng)烈的生物學(xué)活性，并且對(duì)肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前胃癌有明顯的阻斷作用，是一種具有市場(chǎng)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的天然活性物質(zhì)。
現(xiàn)有對(duì)于硫代葡萄糖苷的提取及其酶解條件的研究已不勝枚舉，然而對(duì)于水解硫代葡萄糖苷生成萊菔素的關(guān)鍵酶——硫代葡萄糖苷酶的提取卻鮮有報(bào)道。硫代葡萄糖苷酶是以蛋白復(fù)合體的形式長(zhǎng)久存在于細(xì)胞中，是一種非常穩(wěn)定的胞內(nèi)酶。雖然硫代葡萄糖苷在無(wú)酶作用下也會(huì)發(fā)生降解，但其降解產(chǎn)物十分復(fù)雜，而在硫代葡萄糖苷酶的特異性催化作用下則可以專一性地生成萊菔素，故該酶的提取直接影響到后期制備萊菔素的效率。因此，研發(fā)一種行之有效的從蘿卜籽中提取硫代葡萄糖苷酶的方法，將具有可觀的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。
現(xiàn)有提取硫代葡萄糖苷酶的方法，如申請(qǐng)?zhí)枮?01510121728.4，名稱為“辣根中黑芥子酶的提取工藝”的發(fā)明專利，公開(kāi)的黑芥子酶的提取方法為：以新鮮辣根為原料，首先將其切成薄片，加入磷酸鹽緩沖液打漿，然后通過(guò)水浴攪拌、紗布過(guò)濾除去濾渣、離心得到粗酶液，最后向粗酶液中加入乙醇自然沉淀過(guò)夜并離心得到黑芥子酶提取物。該方法的主要缺點(diǎn)是：①磷酸鹽緩沖液雖然ph變化比較小，但其容易與常見(jiàn)的鈣、鎂等離子形成沉淀而降低緩沖效果，而提取的底物又是成分復(fù)雜的天然植物，故其緩沖作用會(huì)受到干擾；②在提取過(guò)程中沒(méi)有加入具有保護(hù)性的試劑來(lái)維持酶的活力，則在提取過(guò)程中，酶分子可能受到外界環(huán)境變化的影響而變性，從而使提取到的酶活力發(fā)生損耗；③僅僅通過(guò)乙醇作為沉淀劑而得到酶提取物，缺少進(jìn)一步的分離純化步驟，所得產(chǎn)品中雜質(zhì)含量較高。又如2007公開(kāi)的劉月萍撰寫(xiě)的碩士論文《黑芥子酶提取分離、性質(zhì)及固定化研究》，該論文介紹了制備黑芥子酶的工藝是：利用西蘭花種子作為原料，經(jīng)過(guò)tris-hcl緩沖液抽提、乙醇沉淀的提取步驟后，先用deae-sepharase離子交換柱層析純化，再用superdextm-200凝膠過(guò)濾柱層析純化，從而得到較純的黑芥子酶。該方法的主要缺點(diǎn)是：①?zèng)]有對(duì)種子中含有的大量脂質(zhì)進(jìn)行脫脂處理，使得提取酶的過(guò)程受到干擾，最終得到的酶活力不高；②在沉淀黑芥子酶的時(shí)候加入2倍體積的乙醇，離心分離之后卻沒(méi)有對(duì)乙醇進(jìn)行回用，造成乙醇損失，生產(chǎn)成本高；③后期的兩套柱層析系統(tǒng)操作復(fù)雜，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，生產(chǎn)量小，且成本高，不適合于規(guī)?；a(chǎn)和工業(yè)化應(yīng)用。
三、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有提取硫代葡萄糖苷酶方法的不足，提供一種從蘿卜籽中提取硫代葡萄糖苷酶的方法，具有使用常規(guī)工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備，生產(chǎn)條件溫和，操作方便，分離效率高，產(chǎn)品純度高，硫代葡萄糖苷酶質(zhì)量高等特點(diǎn)。
本發(fā)明的原理是：蘿卜籽中含有大量的油脂，其包裹在蘿卜籽粉表面將會(huì)阻礙硫代葡萄糖苷酶的提取，而蘿卜籽在自然萌芽的過(guò)程中會(huì)逐漸消耗油脂以提供生長(zhǎng)動(dòng)力，故可采取使其萌芽的天然方式對(duì)蘿卜籽進(jìn)行脫脂處理，這樣既能脫除油脂，又可避免其他脫脂方式對(duì)酶的不利影響；硫代葡萄糖苷酶是一種胞內(nèi)酶，采用勻漿機(jī)在高轉(zhuǎn)速下將細(xì)胞破碎的方法可使硫代葡萄糖苷酶游離出來(lái)；硫代葡萄糖苷酶是蛋白質(zhì)，可溶于一定ph值的緩沖溶液中，以穩(wěn)定、緩沖能力強(qiáng)且干擾小的tris-hcl作為緩沖溶液，可將硫代葡萄糖苷酶提取出來(lái)；甘油是一種滲透性保護(hù)劑，其親水的羥基可以幫助酶分子穩(wěn)定其必需的空間構(gòu)象，從而減小酶活力的損耗；乙醇是一種能與水互溶的有機(jī)溶劑，能使水溶液的介電常數(shù)降低，增加相反電荷基團(tuán)之間的吸引力，從而促進(jìn)酶蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀；殼寡糖修飾棉纖維是殼寡糖與棉纖維以共價(jià)鍵穩(wěn)固連接的新型材料，其特點(diǎn)是表面修飾的殼寡糖含有大量的氨基，因而具有很強(qiáng)的抗菌性，同時(shí)還帶有一定量的正電荷，可與硫代葡萄糖苷酶蛋白表面的負(fù)電荷產(chǎn)生靜電吸附作用，從而將硫代葡萄糖苷酶與其他電荷性質(zhì)不同的粒子分離開(kāi)來(lái)；超濾是以壓力為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)，基于超濾膜孔徑，可實(shí)現(xiàn)大分子與小分子分離，硫代葡萄糖苷酶提取液中的其他雜質(zhì)蛋白與硫代葡萄糖苷酶分子量不同，通過(guò)超濾即可實(shí)現(xiàn)兩者的有效分離；由于凍干時(shí)水結(jié)冰體積增大，致使酶蛋白活性部位中一些由弱分子力連接的鍵遭到破壞，從而使活性損失，而蔗糖屬于親水性物質(zhì)，形成氫鍵能力較強(qiáng)，能替代酶蛋白表面水分子的羥基，與蛋白質(zhì)中的極性基團(tuán)形成氫鍵，使得酶蛋白的活性部位變化不大，從而避免酶蛋白由于發(fā)生相變所造成的機(jī)械損傷；乙醇的沸點(diǎn)僅為78℃，而在真空條件下，其沸點(diǎn)更低，因此，控制體系的真空度，可在較低溫度下完全蒸發(fā)該溶劑，從而制得回收乙醇。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下途徑實(shí)現(xiàn)的：一種從蘿卜籽中提取硫代葡萄糖苷酶的方法，以新鮮蘿卜籽為原料，經(jīng)過(guò)制備天然脫脂蘿卜籽粉，制備tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液，制備硫代葡萄糖苷酶提取液，裝配固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，制備富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，制備硫代葡萄糖苷酶分離液，制備硫代葡萄糖苷酶濃縮液，制備硫代葡萄糖苷酶凍干粉，制備回收乙醇等步驟，制備出比活力為40.35～45.65u/mg、收得率為0.4～0.6‰的硫代葡萄糖苷酶。其具體工藝步驟如下：
(1)制備天然脫脂蘿卜籽粉
取新鮮蘿卜籽，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8～12％的次氯酸鈉溶液浸泡10～15min，再用無(wú)菌水漂洗3～5次，每次1～5min，然后置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿上，放入溫度為20～30℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，直至蘿卜籽發(fā)芽。收集發(fā)芽的蘿卜籽并將芽剪除，余下的種子部分再置于30～40℃的烘箱內(nèi)干燥。待其干燥后用中藥粉碎機(jī)粉碎，再用80～160目的分樣篩進(jìn)行篩分，分別收集過(guò)篩者和未過(guò)篩者。對(duì)于未過(guò)篩的蘿卜籽粉，返回粉碎機(jī)進(jìn)行再次粉碎；對(duì)于過(guò)篩的蘿卜籽粉，即為天然脫脂蘿卜籽粉，用于第(3)步制備硫代葡萄糖苷酶提取液。
(2)制備tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液
先按照tris的質(zhì)量與純凈水的體積之比為0.24∶1(kg/l)的比例，將稱量好的tris在攪拌下用純凈水溶解，配制成tris濃度為為0.2mol/l的溶液，即制備出tris溶液。再按照tris的質(zhì)量與濃鹽酸的體積之比為1∶0.50～0.58(kg/l)的比例，將濃鹽酸與制備出的tris溶液混合均勻，即制備出ph為7.4～7.6的tris-hcl緩沖溶液。再按照體積百分含量為4～6％的比例，向tris-hcl緩沖溶液中加入甘油作為提取過(guò)程中酶的保護(hù)劑，即制備出tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶提取液。
(3)制備硫代葡萄糖苷酶提取液
第(2)步完成后，按照天然脫脂蘿卜籽粉的質(zhì)量與tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液的體積之比為1∶5～6(kg/l)的比例，將天然脫脂蘿卜籽粉加入到tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液中，用勻漿機(jī)在8000～12000r/min的速度下高速粉碎，對(duì)收集的粉碎分散液，置于常溫下攪拌30～40min，之后用7～9層紗布過(guò)濾并收集濾液。對(duì)收集的濾液，用蠕動(dòng)泵泵入管式離心機(jī)中，在10000～20000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15～25min并收集上清液。對(duì)收集的上清液，于4℃冰箱中放置2～3h，然后在攪拌下向其中緩慢加入2～3倍體積的95％乙醇，加完后再置于4℃冰箱中放置2～3h，然后再次泵入管式離心機(jī)中，在10000～20000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15～25min，分別收集沉淀和上清液。對(duì)收集的上清液，用于第(9)步制備回收乙醇；對(duì)收集的沉淀，即為硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀，按照其質(zhì)量與tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液的體積之比為1∶5～6(kg/l)的比例，將沉淀溶于tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液中，即制備出硫代葡萄糖苷酶提取液，用于第(5)步制備富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床。
(4)裝配固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床
按照專利號(hào)為201510028848.x介紹的方法制備出殼寡糖修飾棉纖維，將該殼寡糖修飾棉纖維分散于2～3倍體積的純凈水中潤(rùn)濕，再裝填于內(nèi)徑為100～300mm、高度為400～800mm的自制不銹鋼固定化吸附反應(yīng)床中，其中殼寡糖修飾棉纖維的裝填高度為300～600mm，即裝配出固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床。
(5)制備富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床
第(3)步和第(4)步完成后，先向第(4)步裝配出的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床中泵入tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液，該緩沖保護(hù)溶液泵入流速為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的1～3倍/h(bv/h)，泵入時(shí)間為1～2h。緩沖保護(hù)溶液泵入完成后，按照裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積與第(3)步制備的硫代葡萄糖苷酶提取液體積之比為1∶4～6(l/l)的比例，將硫代葡萄糖苷酶提取液泵入固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床中，泵入硫代葡萄糖苷酶提取液的流速為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的1～2倍/h(bv/h)。泵入完成后，分別收集脫去硫代葡萄糖苷酶的經(jīng)床流出液和吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，對(duì)收集的脫去硫代葡萄糖苷酶的經(jīng)床流出液，用于下批次溶解硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀而制備硫代葡萄糖苷酶提取液；對(duì)收集的吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，即為富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶分離液。
(6)制備硫代葡萄糖苷酶分離液
首先制備出ph為8.0～9.0的稀na2co3溶液。再按照體積百分含量為4～6％的比例，向稀na2co3溶液中加入甘油，即制備出na2co3-甘油溶液。第(5)步完成后，對(duì)第(5)步收集的富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，泵入na2co3-甘油溶液進(jìn)行洗滌，泵入的na2co3-甘油溶液的體積為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的2～4倍，泵入na2co3-甘油溶液的流速為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的2～4倍/小時(shí)。洗滌完成后，分別收集洗滌后的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床和經(jīng)床洗滌液。對(duì)收集的洗滌后的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，即為再生固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，可用于制備下批次吸附硫代葡萄糖苷酶；對(duì)收集的經(jīng)床洗滌液，即為硫代葡萄糖苷酶分離液，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶濃縮液。
(7)制備硫代葡萄糖苷酶濃縮液
第(6)步完成后，將第(6)步制備的硫代葡萄糖苷酶提取液泵入截留分子量為50000～100000da的超濾器中，在表壓為0.2～0.5mpa下進(jìn)行第一次超濾，直至第一次超濾截留液與第一次超濾濾過(guò)液體積之比(l/l)為1∶7～9時(shí)止。分別收集第一次超濾濾過(guò)液和第一次超濾截留液，對(duì)收集的第一次超濾截留液，主要含大分子的多糖，可用于制備蘿卜籽多糖；對(duì)收集的第一次超濾濾過(guò)液，用純凈水稀釋至原體積，再次泵入截留分子量為10000～20000da的超濾器中進(jìn)行第二次超濾，第二次超濾的表壓及停止第二次超濾時(shí)第二次超濾截留液與第二次超濾濾過(guò)液體積之比均與第一次超濾相同。第二次超濾完成后，分別收集第二次超濾濾過(guò)液和第二次超濾截留液。對(duì)收集的第二次超濾濾過(guò)液，可用于稀釋下批次的第一次超濾濾過(guò)液；對(duì)收集的第二次超濾截留液，即為出硫代葡萄糖苷酶濃縮液，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶凍干粉。
(8)制備硫代葡萄糖苷酶凍干粉
第(7)步完成后，按照蔗糖溶液的體積與硫代葡萄糖苷酶濃縮液體積之比為1∶20～25(l/l)的比例，向第(7)步制備的硫代葡萄糖苷酶濃縮液中加入濃度為80～120mmol/l的蔗糖溶液作為冷凍干燥保護(hù)劑。然后置于-40～-20℃冰箱中預(yù)凍8～12h，再取出放置于真空冷凍干燥機(jī)中，在真空度為30～50pa、溫度為-50～-40℃的條件下冷凍干燥24～36h，即制備出硫代葡萄糖苷酶凍干粉，其比活力為40.35～45.65u/mg、收得率為0.4～0.6‰。
(9)制備回收乙醇
第(3)步完成后，將第(3)步第二次離心收集的上清液泵入低溫高真空溶劑回收裝置，在溫度為30～45℃、真空度為0.1～3kpa的條件下回收乙醇，直至無(wú)乙醇味時(shí)止，即制備出回收乙醇，可用于再次配制乙醇體積百分濃度為95％的水溶液。
本發(fā)明采用上述技術(shù)方案后，主要有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明方法以新鮮蘿卜籽為原料，制備出比活力為40.35～45.65u/mg、收得率為0.4～0.6‰的硫代葡萄糖苷酶，產(chǎn)品質(zhì)量符合市場(chǎng)要求；所用生產(chǎn)設(shè)備均為工業(yè)化設(shè)備，生產(chǎn)條件易實(shí)施，操作方便，適合規(guī)模化生產(chǎn)。
2、本發(fā)明方法采用蘿卜籽自然萌芽的方式對(duì)其進(jìn)行脫脂處理，相比于傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取法，具有操作方便，條件溫和，無(wú)毒害作用的特點(diǎn)，且更有利于保持酶的穩(wěn)定。
3、本發(fā)明在提取過(guò)程中加入了甘油作為保護(hù)劑，在制備凍干粉時(shí)又加入了蔗糖溶液作為保護(hù)劑，最大限度地穩(wěn)定了酶蛋白分子的構(gòu)象，保持了酶的活力。
4、本發(fā)明方法以殼寡糖修飾棉纖維這一具有抗菌性質(zhì)的新型材料為載體，利用靜電作用對(duì)硫代葡萄糖苷酶進(jìn)行吸附，并裝配出固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，有效分離出了高活力的硫代葡萄糖苷酶。
5、本發(fā)明方法用超濾膜分離技術(shù)對(duì)提取液進(jìn)行濃縮，使用溶劑低溫回收真空系統(tǒng)回收乙醇，能耗和乙醇損耗均低，顯著降低了生產(chǎn)成本。
6、本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品硫代葡萄糖苷酶凍干粉可廣泛應(yīng)用于固定化酶及制備萊菔素等領(lǐng)域中。
四、具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1
(1)制備天然脫脂蘿卜籽粉
取新鮮蘿卜籽，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的次氯酸鈉溶液浸泡10min，再用無(wú)菌水漂洗3次，每次1min，然后置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿上，放入溫度為20℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，直至蘿卜籽發(fā)芽。收集發(fā)芽的蘿卜籽并將芽剪除，余下的種子部分再置于30℃的烘箱內(nèi)干燥。待其干燥后用中藥粉碎機(jī)粉碎，再用80目的分樣篩進(jìn)行篩分，分別收集過(guò)篩者和未過(guò)篩者。對(duì)于未過(guò)篩的蘿卜籽粉，返回粉碎機(jī)進(jìn)行再次粉碎；對(duì)于過(guò)篩的蘿卜籽粉，即為天然脫脂蘿卜籽粉，用于第(3)步制備硫代葡萄糖苷酶提取液。
(2)制備tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液
先按照tris的質(zhì)量與純凈水的體積之比為0.24∶1(kg/l)的比例，將稱量好的tris在攪拌下用純凈水溶解，配制成tris濃度為為0.2mol/l的溶液，即制備出tris溶液。再按照tris的質(zhì)量與濃鹽酸的體積之比為1∶0.50(kg/l)的比例，將濃鹽酸與制備出的tris溶液混合均勻，即制備出ph為7.6的tris-hcl緩沖溶液。再按照體積百分含量為4％的比例，向tris-hcl緩沖溶液中加入甘油作為提取過(guò)程中酶的保護(hù)劑，即制備出tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶提取液。
(3)制備硫代葡萄糖苷酶提取液
第(2)步完成后，按照天然脫脂蘿卜籽粉的質(zhì)量與tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液的體積之比為1∶5(kg/l)的比例，將天然脫脂蘿卜籽粉加入到tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液中，用勻漿機(jī)在8000r/min的速度下高速粉碎，對(duì)收集的粉碎分散液，置于常溫下攪拌30min，之后用7層紗布過(guò)濾并收集濾液。對(duì)收集的濾液，用蠕動(dòng)泵泵入管式離心機(jī)中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min并收集上清液。對(duì)收集的上清液，于4℃冰箱中放置2h，然后在攪拌下向其中緩慢加入2倍體積的95％乙醇，加完后再置于4℃冰箱中放置2h，然后再次泵入管式離心機(jī)中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min，分別收集沉淀和上清液。對(duì)收集的上清液，用于第(9)步制備回收乙醇；對(duì)收集的沉淀，即為硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀，按照其質(zhì)量與tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液的體積之比為1∶5(kg/l)的比例，將沉淀溶于tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液中，即制備出硫代葡萄糖苷酶提取液，用于第(5)步制備富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床。
(4)裝配固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床
按照專利號(hào)為201510028848.x介紹的方法制備出殼寡糖修飾棉纖維，將該殼寡糖修飾棉纖維分散于2倍體積的純凈水中潤(rùn)濕，再裝填于內(nèi)徑為100mm、高度為400mm的自制不銹鋼固定化吸附反應(yīng)床中，其中殼寡糖修飾棉纖維的裝填高度為300mm，即裝配出固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床。
(5)制備富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床
第(3)步和第(4)步完成后，先向第(4)步裝配出的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床中泵入tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液，該緩沖保護(hù)溶液泵入流速為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的1倍/h(bv/h)，泵入時(shí)間為1h。緩沖保護(hù)溶液泵入完成后，按照裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積與第(3)步制備的硫代葡萄糖苷酶提取液體積之比為1∶4(l/l)的比例，將硫代葡萄糖苷酶提取液泵入固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床中，泵入硫代葡萄糖苷酶提取液的流速為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的1倍/h(bv/h)。泵入完成后，分別收集脫去硫代葡萄糖苷酶的經(jīng)床流出液和吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，對(duì)收集的脫去硫代葡萄糖苷酶的經(jīng)床流出液，用于下批次溶解硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀而制備硫代葡萄糖苷酶提取液；對(duì)收集的吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，即為富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶分離液。
(6)制備硫代葡萄糖苷酶分離液
首先制備出ph為8.0的稀na2co3溶液。再按照體積百分含量為4％的比例，向稀na2co3溶液中加入甘油，即制備出na2co3-甘油溶液。第(5)步完成后，對(duì)第(5)步收集的富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，泵入na2co3-甘油溶液進(jìn)行洗滌，泵入的na2co3-甘油溶液的體積為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的2倍，泵入na2co3-甘油溶液的流速為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的2倍/h。洗滌完成后，分別收集洗滌后的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床和經(jīng)床洗滌液。對(duì)收集的洗滌后的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，即為再生固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，可用于制備下批次吸附硫代葡萄糖苷酶；對(duì)收集的經(jīng)床洗滌液，即為硫代葡萄糖苷酶分離液，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶濃縮液。
(7)制備硫代葡萄糖苷酶濃縮液
第(6)步完成后，將第(6)步制備的硫代葡萄糖苷酶提取液泵入截留分子量為50000da的超濾器中，在表壓為0.2mpa下進(jìn)行第一次超濾，直至第一次超濾截留液與第一次超濾濾過(guò)液體積之比(l/l)為1∶7時(shí)止。分別收集第一次超濾濾過(guò)液和第一次超濾截留液，對(duì)收集的第一次超濾截留液，主要含大分子的多糖，可用于制備蘿卜籽多糖；對(duì)收集的第一次超濾濾過(guò)液，用純凈水稀釋至原體積，再次泵入截留分子量為10000da的超濾器中進(jìn)行第二次超濾，第二次超濾的表壓及停止第二次超濾時(shí)第二次超濾截留液與第二次超濾濾過(guò)液體積之比均與第一次超濾相同。第二次超濾完成后，分別收集第二次超濾濾過(guò)液和第二次超濾截留液。對(duì)收集的第二次超濾濾過(guò)液，可用于稀釋下批次的第一次超濾濾過(guò)液；對(duì)收集的第二次超濾截留液，即為出硫代葡萄糖苷酶濃縮液，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶凍干粉。
(8)制備硫代葡萄糖苷酶凍干粉
第(7)步完成后，按照蔗糖溶液的體積與硫代葡萄糖苷酶濃縮液體積之比為1∶20(l/l)的比例，向第(7)步制備的硫代葡萄糖苷酶濃縮液中加入濃度為80mmol/l的蔗糖溶液作為冷凍干燥保護(hù)劑。然后置于-40℃冰箱中預(yù)凍8h，再取出放置于真空冷凍干燥機(jī)中，在真空度為30pa、溫度為-50℃的條件下冷凍干燥24h，即制備出硫代葡萄糖苷酶凍干粉，其比活力為40.35u/mg、收得率為0.4‰。
(9)制備回收乙醇
第(3)步完成后，將第(3)步第二次離心收集的上清液泵入低溫高真空溶劑回收裝置，在溫度為30℃、真空度為0.1kpa的條件下回收乙醇，直至無(wú)乙醇味時(shí)止，即制備出回收乙醇，可用于再次配制乙醇體積百分濃度為95％的水溶液。
實(shí)施例2
(1)制備天然脫脂蘿卜籽粉
取新鮮蘿卜籽，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的次氯酸鈉溶液浸泡12min，再用無(wú)菌水漂洗4次，每次3min，然后置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿上，放入溫度為25℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，直至蘿卜籽發(fā)芽。收集發(fā)芽的蘿卜籽并將芽剪除，余下的種子部分再置于35℃的烘箱內(nèi)干燥。待其干燥后用中藥粉碎機(jī)粉碎，再用120目的分樣篩進(jìn)行篩分，分別收集過(guò)篩者和未過(guò)篩者。對(duì)于未過(guò)篩的蘿卜籽粉，返回粉碎機(jī)進(jìn)行再次粉碎；對(duì)于過(guò)篩的蘿卜籽粉，即為天然脫脂蘿卜籽粉，用于第(3)步制備硫代葡萄糖苷酶提取液。
(2)制備tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液
先按照tris的質(zhì)量與純凈水的體積之比為0.24∶1(kg/l)的比例，將稱量好的tris在攪拌下用純凈水溶解，配制成tris濃度為為0.2mol/l的溶液，即制備出tris溶液。再按照tris的質(zhì)量與濃鹽酸的體積之比為1∶0.54(kg/l)的比例，將濃鹽酸與制備出的tris溶液混合均勻，即制備出ph為7.5的tris-hcl緩沖溶液。再按照體積百分含量為5％的比例，向tris-hcl緩沖溶液中加入甘油作為提取過(guò)程中酶的保護(hù)劑，即制備出tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶提取液。
(3)制備硫代葡萄糖苷酶提取液
第(2)步完成后，按照天然脫脂蘿卜籽粉的質(zhì)量與tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液的體積之比為1∶5.5(kg/l)的比例，將天然脫脂蘿卜籽粉加入到tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液中，用勻漿機(jī)在10000r/min的速度下高速粉碎，對(duì)收集的粉碎分散液，置于常溫下攪拌35min，之后用8層紗布過(guò)濾并收集濾液。對(duì)收集的濾液，用蠕動(dòng)泵泵入管式離心機(jī)中，在15000r/min的轉(zhuǎn)速下離心20min并收集上清液。對(duì)收集的上清液，于4℃冰箱中放置2.5h，然后在攪拌下向其中緩慢加入2.5倍體積的95％乙醇，加完后再置于4℃冰箱中放置2.5h，然后再次泵入管式離心機(jī)中，在15000r/min的轉(zhuǎn)速下離心20min，分別收集沉淀和上清液。對(duì)收集的上清液，用于第(9)步制備回收乙醇；對(duì)收集的沉淀，即為硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀，按照其質(zhì)量與tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液的體積之比為1∶5.5(kg/l)的比例，將沉淀溶于tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液中，即制備出硫代葡萄糖苷酶提取液，用于第(5)步制備富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床。
(4)裝配固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床
按照專利號(hào)為201510028848.x介紹的方法制備出殼寡糖修飾棉纖維，將該殼寡糖修飾棉纖維分散于2.5倍體積的純凈水中潤(rùn)濕，再裝填于內(nèi)徑為200mm、高度為600mm的自制不銹鋼固定化吸附反應(yīng)床中，其中殼寡糖修飾棉纖維的裝填高度為450mm，即裝配出固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床。
(5)制備富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床
第(3)步和第(4)步完成后，先向第(4)步裝配出的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床中泵入tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液，該緩沖保護(hù)溶液泵入流速為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的2倍/h(bv/h)，泵入時(shí)間為1.5h。緩沖保護(hù)溶液泵入完成后，按照裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積與第(3)步制備的硫代葡萄糖苷酶提取液體積之比為1∶5(l/l)的比例，將硫代葡萄糖苷酶提取液泵入固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床中，泵入硫代葡萄糖苷酶提取液的流速為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的1.5倍/h(bv/h)。泵入完成后，分別收集脫去硫代葡萄糖苷酶的經(jīng)床流出液和吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，對(duì)收集的脫去硫代葡萄糖苷酶的經(jīng)床流出液，用于下批次溶解硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀而制備硫代葡萄糖苷酶提取液；對(duì)收集的吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，即為富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶分離液。
(6)制備硫代葡萄糖苷酶分離液
首先制備出ph為8.5的稀na2co3溶液。再按照體積百分含量為5％的比例，向稀na2co3溶液中加入甘油，即制備出na2co3-甘油溶液。第(5)步完成后，對(duì)第(5)步收集的富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，泵入na2co3-甘油溶液進(jìn)行洗滌，泵入的na2co3-甘油溶液的體積為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的3倍，泵入na2co3-甘油溶液的流速為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的3倍/h。洗滌完成后，分別收集洗滌后的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床和經(jīng)床洗滌液。對(duì)收集的洗滌后的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，即為再生固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，可用于制備下批次吸附硫代葡萄糖苷酶；對(duì)收集的經(jīng)床洗滌液，即為硫代葡萄糖苷酶分離液，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶濃縮液。
(7)制備硫代葡萄糖苷酶濃縮液
第(6)步完成后，將第(6)步制備的硫代葡萄糖苷酶提取液泵入截留分子量為80000da的超濾器中，在表壓為0.45mpa下進(jìn)行第一次超濾，直至第一次超濾截留液與第一次超濾濾過(guò)液體積之比(l/l)為1∶8時(shí)止。分別收集第一次超濾濾過(guò)液和第一次超濾截留液，對(duì)收集的第一次超濾截留液，主要含大分子的多糖，可用于制備蘿卜籽多糖；對(duì)收集的第一次超濾濾過(guò)液，用純凈水稀釋至原體積，再次泵入截留分子量為20000da的超濾器中進(jìn)行第二次超濾，第二次超濾的表壓及停止第二次超濾時(shí)第二次超濾截留液與第二次超濾濾過(guò)液體積之比均與第一次超濾相同。第二次超濾完成后，分別收集第二次超濾濾過(guò)液和第二次超濾截留液。對(duì)收集的第二次超濾濾過(guò)液，可用于稀釋下批次的第一次超濾濾過(guò)液；對(duì)收集的第二次超濾截留液，即為出硫代葡萄糖苷酶濃縮液，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶凍干粉。
(8)制備硫代葡萄糖苷酶凍干粉
第(7)步完成后，按照蔗糖溶液的體積與硫代葡萄糖苷酶濃縮液體積之比為1∶22(l/l)的比例，向第(7)步制備的硫代葡萄糖苷酶濃縮液中加入濃度為100mmol/l的蔗糖溶液作為冷凍干燥保護(hù)劑。然后置于-30℃冰箱中預(yù)凍10h，再取出放置于真空冷凍干燥機(jī)中，在真空度為40pa、溫度為-45℃的條件下冷凍干燥30h，即制備出硫代葡萄糖苷酶凍干粉，其比活力為43.21u/mg、收得率為0.5‰。
(9)制備回收乙醇
第(3)步完成后，將第(3)步第二次離心收集的上清液泵入低溫高真空溶劑回收裝置，在溫度為38℃、真空度為1.5kpa的條件下回收乙醇，直至無(wú)乙醇味時(shí)止，即制備出回收乙醇，可用于再次配制乙醇體積百分濃度為95％的水溶液。
實(shí)施例3
(1)制備天然脫脂蘿卜籽粉
取新鮮蘿卜籽，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12％的次氯酸鈉溶液浸泡15min，再用無(wú)菌水漂洗5次，每次5min，然后置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿上，放入溫度為30℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，直至蘿卜籽發(fā)芽。收集發(fā)芽的蘿卜籽并將芽剪除，余下的種子部分再置于40℃的烘箱內(nèi)干燥。待其干燥后用中藥粉碎機(jī)粉碎，再用160目的分樣篩進(jìn)行篩分，分別收集過(guò)篩者和未過(guò)篩者。對(duì)于未過(guò)篩的蘿卜籽粉，返回粉碎機(jī)進(jìn)行再次粉碎；對(duì)于過(guò)篩的蘿卜籽粉，即為天然脫脂蘿卜籽粉，用于第(3)步制備硫代葡萄糖苷酶提取液。
(2)制備tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液
先按照tris的質(zhì)量與純凈水的體積之比為0.24∶1(kg/l)的比例，將稱量好的tris在攪拌下用純凈水溶解，配制成tris濃度為為0.2mol/l的溶液，即制備出tris溶液。再按照tris的質(zhì)量與濃鹽酸的體積之比為1∶0.58(kg/l)的比例，將濃鹽酸與制備出的tris溶液混合均勻，即制備出ph為7.4的tris-hcl緩沖溶液。再按照體積百分含量為6％的比例，向tris-hcl緩沖溶液中加入甘油作為提取過(guò)程中酶的保護(hù)劑，即制備出tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶提取液。
(3)制備硫代葡萄糖苷酶提取液
第(2)步完成后，按照天然脫脂蘿卜籽粉的質(zhì)量與tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液的體積之比為1∶6(kg/l)的比例，將天然脫脂蘿卜籽粉加入到tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液中，用勻漿機(jī)在12000r/min的速度下高速粉碎，對(duì)收集的粉碎分散液，置于常溫下攪拌40min，之后用9層紗布過(guò)濾并收集濾液。對(duì)收集的濾液，用蠕動(dòng)泵泵入管式離心機(jī)中，在20000r/min的轉(zhuǎn)速下離心25min并收集上清液。對(duì)收集的上清液，于4℃冰箱中放置3h，然后在攪拌下向其中緩慢加入3倍體積的95％乙醇，加完后再置于4℃冰箱中放置3h，然后再次泵入管式離心機(jī)中，在20000r/min的轉(zhuǎn)速下離心25min，分別收集沉淀和上清液。對(duì)收集的上清液，用于第(9)步制備回收乙醇；對(duì)收集的沉淀，即為硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀，按照其質(zhì)量與tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液的體積之比為1∶6(kg/l)的比例，將沉淀溶于tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液中，即制備出硫代葡萄糖苷酶提取液，用于第(5)步制備富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床。
(4)裝配固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床
按照專利號(hào)為201510028848.x介紹的方法制備出殼寡糖修飾棉纖維，將該殼寡糖修飾棉纖維分散于3倍體積的純凈水中潤(rùn)濕，再裝填于內(nèi)徑為300mm、高度為800mm的自制不銹鋼固定化吸附反應(yīng)床中，其中殼寡糖修飾棉纖維的裝填高度為600mm，即裝配出固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床。
(5)制備富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床
第(3)步和第(4)步完成后，先向第(4)步裝配出的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床中泵入tris-hcl-甘油緩沖保護(hù)溶液，該緩沖保護(hù)溶液泵入流速為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的3倍/h(bv/h)，泵入時(shí)間為2h。緩沖保護(hù)溶液泵入完成后，按照裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積與第(3)步制備的硫代葡萄糖苷酶提取液體積之比為1∶6(l/l)的比例，將硫代葡萄糖苷酶提取液泵入固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床中，泵入硫代葡萄糖苷酶提取液的流速為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的2倍/h(bv/h)。泵入完成后，分別收集脫去硫代葡萄糖苷酶的經(jīng)床流出液和吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，對(duì)收集的脫去硫代葡萄糖苷酶的經(jīng)床流出液，用于下批次溶解硫代葡萄糖苷酶乙醇沉淀而制備硫代葡萄糖苷酶提取液；對(duì)收集的吸附硫代葡萄糖苷酶的固定床，即為富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶分離液。
(6)制備硫代葡萄糖苷酶分離液
首先制備出ph為9.0的稀na2co3溶液。再按照體積百分含量為6％的比例，向稀na2co3溶液中加入甘油，即制備出na2co3-甘油溶液。第(5)步完成后，對(duì)第(5)步收集的富集硫代葡萄糖苷酶的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，泵入na2co3-甘油溶液進(jìn)行洗滌，泵入的na2co3-甘油溶液的體積為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的4倍，泵入na2co3-甘油溶液的流速為裝配的殼寡糖修飾棉纖維床層體積的4倍/小時(shí)。洗滌完成后，分別收集洗滌后的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床和經(jīng)床洗滌液。對(duì)收集的洗滌后的固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，即為再生固定化殼寡糖修飾棉纖維吸附反應(yīng)床，可用于制備下批次吸附硫代葡萄糖苷酶；對(duì)收集的經(jīng)床洗滌液，即為硫代葡萄糖苷酶分離液，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶濃縮液。
(7)制備硫代葡萄糖苷酶濃縮液
第(6)步完成后，將第(6)步制備的硫代葡萄糖苷酶提取液泵入截留分子量為100000da的超濾器中，在表壓為0.5mpa下進(jìn)行第一次超濾，直至第一次超濾截留液與第一次超濾濾過(guò)液體積之比(l/l)為1∶9時(shí)止。分別收集第一次超濾濾過(guò)液和第一次超濾截留液，對(duì)收集的第一次超濾截留液，主要含大分子的多糖，可用于制備蘿卜籽多糖；對(duì)收集的第一次超濾濾過(guò)液，用純凈水稀釋至原體積，再次泵入截留分子量為20000da的超濾器中進(jìn)行第二次超濾，第二次超濾的表壓及停止第二次超濾時(shí)第二次超濾截留液與第二次超濾濾過(guò)液體積之比均與第一次超濾相同。第二次超濾完成后，分別收集第二次超濾濾過(guò)液和第二次超濾截留液。對(duì)收集的第二次超濾濾過(guò)液，可用于稀釋下批次的第一次超濾濾過(guò)液；對(duì)收集的第二次超濾截留液，即為出硫代葡萄糖苷酶濃縮液，用于下步制備硫代葡萄糖苷酶凍干粉。
(8)制備硫代葡萄糖苷酶凍干粉
第(7)步完成后，按照蔗糖溶液的體積與硫代葡萄糖苷酶濃縮液體積之比為1∶25(l/l)的比例，向第(7)步制備的硫代葡萄糖苷酶濃縮液中加入濃度為120mmol/l的蔗糖溶液作為冷凍干燥保護(hù)劑。然后置于-20℃冰箱中預(yù)凍12h，再取出放置于真空冷凍干燥機(jī)中，在真空度為50pa、溫度為-40℃的條件下冷凍干燥36h，即制備出硫代葡萄糖苷酶凍干粉，其比活力為45.65u/mg、收得率為0.6‰。
(9)制備回收乙醇
第(3)步完成后，將第(3)步第二次離心收集的上清液泵入低溫高真空溶劑回收裝置，在溫度為45℃、真空度為3kpa的條件下回收乙醇，直至無(wú)乙醇味時(shí)止，即制備出回收乙醇，可用于再次配制乙醇體積百分濃度為95％的水溶液。