本發(fā)明涉及生物領域。具體地，本發(fā)明涉及檢測dnag-四鏈體的化合物、方法及試劑盒。更具體地，本發(fā)明涉及化合物、檢測dnag-四鏈體的方法、試劑盒及化合物或試劑盒在檢測dnag-四鏈體中的用途。

背景技術：

g-四鏈體是由富含鳥嘌呤堿基的單鏈dna在一價陽離子(如k⁺和na⁺)的條件下通過分子間氫鍵作用形成的一種特殊的dna二級結構。g-四鏈體具有平行、反平行和(3+1)雜合型等多種不同的拓撲結構。更重要的是，g-四鏈體在生物體內(nèi)具有豐富的生物學功能。計算機模擬計算表明，在人體基因組中大約含有376000個可以形成g-四鏈體的序列，它們主要位于端粒和一些重要的原癌基因(包括c-myc、vegf、k-ras、bcl-2、c-kit等)的啟動子區(qū)。dnag-四鏈體在調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄、復制和重組以及保持端粒穩(wěn)定性方面具有重要作用。

然而，目前檢測dnag-四鏈體的方法仍有待改進。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題至少之一。為此，本發(fā)明提出了化合物、檢測dnag-四鏈體的方法、試劑盒及化合物或試劑盒在檢測dnag-四鏈體中的用途。本發(fā)明的化合物具有良好的生物相容性，細胞毒性小，對dnag-四鏈體結構具有較高的選擇性，適用于細胞(尤其是活細胞)內(nèi)dnag-四鏈體的檢測，檢測的準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好且操作簡便。

需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

目前，大多探針基本上都無法用于活細胞內(nèi)dnag-四鏈體結構的檢測。體內(nèi)g-四鏈體的識別和檢測存在三個關鍵性的問題：(1)g-四鏈體靶點是結構特異性并非序列特異性的，使得傳統(tǒng)的核酸檢測方法無法使用，需要使用具有結構特異性的檢測手段；(2)g-四鏈體并非單獨存在，而是嵌在基因組dna的雙螺旋二級結構之間，因此該檢測方法必須僅能識別g-四鏈體結構而不響應雙螺旋結構；(3)g-四鏈體序列在整個基因組中的含量甚微，幾乎被淹沒在基因組dna雙螺旋結構的“海洋”中。

目前對細胞內(nèi)dnag-四鏈體的檢測主要基于特異性抗體的免疫熒光分析方法和少數(shù)小分子熒光探針兩類方法：

(1)免疫熒光分析技術：該方法是利用生物學技術合成或篩選能夠與g-四鏈體結構特異性結合的抗體，然后通過免疫熒光分子來檢測g-四鏈體結構。采用抗體檢測細胞內(nèi)dnag-四鏈體的存在，具有特異性好、靈敏度高的優(yōu)點。但這種特異性抗體的篩選難度大、成本高，不容易獲得；另外抗體本身是蛋白質(zhì)大分子，不易通過活細胞的細胞膜，因此在使用時需要對細胞進行固定和通透等處理才能使抗體進入細胞核。這些方面的缺陷極大地限制了基于抗體的免疫熒光分析方法在活細胞中檢測dnag-四鏈體中的用途。

(2)少數(shù)小分子熒光探針：該方法是在傳統(tǒng)g-四鏈體特異性地有機小分子基礎上進行性能的優(yōu)化和改善，重新設計和開發(fā)新型的熒光小分子探針以實現(xiàn)在活細胞內(nèi)檢測g-四鏈體結構。一般這類熒光小分子需要具備幾點特征：1)具有良好的生物相容性，能夠進入活細胞的細胞核，而且細胞毒性很??；2)對細胞內(nèi)的dnag-四鏈體結構沒有穩(wěn)定和誘導作用；3)對dnag-四鏈體結構具有較高的選擇性和靈敏度，而對單鏈或雙鏈dna沒有響應；4)該小分子與dnag-四鏈體結合之后熒光強度顯著增加或者熒光壽命顯著延長。目前已經(jīng)被報道的這類探針的代表是daota-m2，該小分子探針能夠進入活細胞細胞核，而且在體外與dnag-四鏈體作用的熒光壽命明顯比單鏈或雙鏈dna更長，因此被用于活細胞內(nèi)dnag-四鏈體的檢測。但該探針只能通過熒光壽命的手段來檢測dnag-四鏈體，因為它與g-四鏈體、rna、單鏈dna和雙鏈dna作用的熒光強度差異不大。熒光壽命的方法對儀器設備具有較高的要求，而且獲取數(shù)據(jù)需要較長時間，不方便對活細胞內(nèi)dnag-四鏈體結構進行實時、可視化檢測。

有鑒于此，發(fā)明人經(jīng)過大量實驗，設計合成了一種化合物，該化合物可以作為小分子熒光探針，利用該探針在溶液體系中使用識別和區(qū)分dnag-四鏈體和其他的寡聚核苷酸構型(如單鏈dna、雙鏈dna、rna和i-motif等)，并實現(xiàn)了利用該探針在染色體和活細胞水平標記dnag-四鏈體結構，通過熒光強度檢測手段確定dnag-四鏈體含量。本發(fā)明的化合物具有良好的生物相容性，細胞毒性小，對dnag-四鏈體結構具有較高的選擇性，適用于細胞(尤其是活細胞)內(nèi)dnag-四鏈體的檢測，檢測的準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好且操作簡便。

為此，在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種化合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述化合物其為式(i)所示的化合物或式(i)所示化合物的鹽：

r為c2～6烷基或者苯基；

r’為氫、c1～6烷基、c1～6烷氧基、氨基、鹵素、苯基、c1～6雜環(huán)基或者c1～6雜芳基；

x為c、o、s、se或te原子，

其中，所述烷基、苯基、烷氧基、氨基、雜環(huán)基或者雜芳基均可任選地被一個或者多個選自烷基、磺酸基或者烷氧基的基團所取代。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該化合物能夠作為dnag-四鏈體識別探針，該探針具有良好的生物相容性，細胞毒性小，對dnag-四鏈體結構具有較高的選擇性，能夠進入活細胞的細胞核，與活細胞內(nèi)dnag-四鏈體作用，可用于細胞(尤其是活細胞)內(nèi)dnag-四鏈體的可視化檢測。另外，該化合物的水溶液穩(wěn)定性好，可長時間儲存，能很好保證用途測試效果。而且，利用該化合物檢測的準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好且操作簡便。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述化合物還可以進一步具有下列附加技術特征：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述r為c2～6烷基或者苯基，所述烷基可任選地被一個或者多個選自烷基的基團所取代。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述雜環(huán)基或者雜芳基中雜原子分別獨立地為n、s或者o原子。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述化合物具有式(2)所示的結構：

其中，所述y為陰離子，優(yōu)選鹵素陰離子。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述化合物具有下列之一的結構：

或者

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種檢測dnag-四鏈體的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：使細胞與前面所述化合物進行接觸；以及對所述接觸后的細胞進行觀察，以便確定所述細胞中dnag-四鏈體含量。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該化合物具有良好的生物相容性，細胞毒性小，對dnag-四鏈體結構具有較高的選擇性，適用于細胞(尤其是活細胞)內(nèi)dnag-四鏈體的檢測。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測dnag-四鏈體的方法準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好且操作簡便。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將所述接觸后細胞的細胞核進行染色定位處理；以及基于所述細胞核內(nèi)的熒光強度和熒光亮點的數(shù)目，以便確定所述細胞中dnag-四鏈體含量。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測dnag-四鏈體的方法進一步具有較強的準確性、較高的靈敏度、較好的穩(wěn)定性或者較簡便的操作。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述細胞為活細胞。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測dnag-四鏈體的方法進一步具有較強的準確性、較高的靈敏度、較好的穩(wěn)定性或者較簡便的操作。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述接觸是將所述細胞與所述化合物進行共培養(yǎng)1～48小時。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測dnag-四鏈體的方法進一步具有較強的準確性、較高的靈敏度、較好的穩(wěn)定性或者較簡便的操作。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述染色處理是利用59染色劑進行的。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測dnag-四鏈體的方法進一步具有較強的準確性、較高的靈敏度、較好的穩(wěn)定性或者較簡便的操作。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述熒光強度的測定是利用激光共聚焦儀器進行的，其中，所述激光共聚焦儀器中包括：所述化合物的檢測通道以及所述染色劑的檢測通道，所述化合物檢測通道的激發(fā)波長為405nm，收集波長范圍為425～525nm；所述染色劑檢測通道的激發(fā)波長為635nm，收集波長范圍為650～750nm。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測dnag-四鏈體的方法進一步具有較強的準確性、較高的靈敏度、較好的穩(wěn)定性或者較簡便的操作。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述試劑盒包括前面所描述的化合物。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實施例的試劑盒能夠有效地檢測dnag-四鏈體，且檢測結果的準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好以及操作簡便。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了前面所述化合物或試劑盒在檢測dnag-四鏈體中的用途。由此，利用該化合物或者試劑盒能夠有效地檢測dnag-四鏈體，且檢測結果的準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好以及操作簡便。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的檢測dnag-四鏈體的方法的流程示意圖；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的顯示了imt探針標記活細胞hela細胞的顯微鏡圖(放大倍數(shù)100倍)，其中(a)imt分子與細胞核染料59共同與hela細胞孵育，標尺：20μm，左側圖為細胞核，右側圖為細胞；(b)只有細胞核染料59與hela細胞一起孵育，標尺：20μm，左側圖為細胞核，右側圖為細胞；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的顯示了imt探針標記活細胞huvec細胞的顯微鏡圖(放大倍數(shù)100倍)，其中(a)imt分子與細胞核染料59共同與huvec細胞孵育，標尺：20μm，左側圖為細胞核，右側圖為細胞；(b)只有細胞核染料59與huvec細胞一起孵育，標尺為20μm，左側圖為細胞核，右側圖為細胞；以及

圖4～9分別顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的活細胞hela細胞的顯微鏡圖(放大倍數(shù)100倍)。

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

需要說明的是，術語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。進一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。

本發(fā)明提出了化合物、檢測dnag-四鏈體的方法、試劑盒及化合物或試劑盒在檢測dnag-四鏈體中的用途，下面將分別對其進行詳細描述。

化合物

在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種化合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該化合物其為式(i)所示的化合物或式(i)所示化合物的鹽：

r為c2～6烷基或者苯基；

r’為氫、c1～6烷基、c1～6烷氧基、氨基、鹵素、苯基、c1～6雜環(huán)基或者c1～6雜芳基；

x為c、o、s、se或te原子，

其中，所述烷基、苯基、烷氧基、氨基、雜環(huán)基或者雜芳基均可任選地被一個或者多個選自烷基、磺酸基或者烷氧基的基團所取代。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該化合物能夠作為dnag-四鏈體識別探針，該探針具有良好的生物相容性，細胞毒性小，對dnag-四鏈體結構具有較高的選擇性，能夠進入活細胞的細胞核，與活細胞內(nèi)dnag-四鏈體作用，產(chǎn)生可檢測信號，可用于細胞(尤其是活細胞)內(nèi)dnag-四鏈體的可視化檢測，例如熒光強度檢測。另外，該化合物的水溶液穩(wěn)定性好，可長時間儲存，能很好保證用途測試效果。而且，利用該化合物檢測的準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好且操作簡便。然而，其他化合物的檢測效果不佳。

需要說明的是，一個連接鍵連接到中心的環(huán)上形成的環(huán)體系(如式a所示)代表連接鍵可以在b環(huán)上任何可連接的位置與分子其余部分相連。式a代表b環(huán)上任何可能連接的位置均可與分子其余部分相連。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，r為c2～6烷基或者苯基，烷基可任選地被一個或者多個選自烷基的基團所取代。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，該化合物具有式(2)所示的結構，其中，所述y為陰離子，優(yōu)選鹵素陰離子。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當r為烷基或者苯基時，式(1)所示化合物為陽離子，引入陰離子y(亦稱作反離子)，以保證式(1)所示化合物的鹽(式(2)所示化合物)呈電中性，為離子型化合物。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，r為苯基，苯基被烷基所取代；或者r為烷基，烷基被磺酸基所取代時，式(1)所示化合物呈電中性，無需反離子存在。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，雜環(huán)基或者雜芳基中雜原子分別獨立地為n、s或者o原子。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，該化合物具有下列之一的結構。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，相比于其他化合物，下述化合物能夠較好地識別和區(qū)分dnag-四鏈體和其他的寡聚核苷酸構型(如單鏈dna、雙鏈dna、rna和i-motif等)，并實現(xiàn)了利用該化合物在染色體和活細胞水平標記dnag-四鏈體結構，并實現(xiàn)可視化檢測。本發(fā)明的化合物具有良好的生物相容性，細胞毒性小，對dnag-四鏈體結構具有較高的選擇性，適用于細胞(尤其是活細胞)內(nèi)dnag-四鏈體的檢測，檢測的準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好且操作簡便。

檢測dnag-四鏈體的方法

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種檢測dnag-四鏈體的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，參見圖1，該方法包括：s100接觸以及s200確定dnag-四鏈體含量。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測dnag-四鏈體的方法準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好且操作簡便。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：

s100接觸

在該步驟中，使細胞與前面所描述的化合物進行接觸。

需要說明的是，對于接觸方式不作嚴格限定，可以根據(jù)實際需要進行選擇。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，接觸是將細胞與化合物進行共孵育1～48小時。具體地，將化合物加入至含有細胞的培養(yǎng)皿中進行共孵育。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在此條件下能夠使得化合物與細胞內(nèi)的dnag-四鏈體發(fā)生特異性結合，便于后續(xù)檢測。

s200確定dnag-四鏈體含量

在該步驟中，對所述接觸后的細胞進行觀察，以便確定所述細胞中dnag-四鏈體含量。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將細胞與化合物接觸后，化合物可以進入細胞核，與細胞核的dnag-四鏈體結合，使得該化合物產(chǎn)生可檢測信號。通過儀器檢測該信號，從而能夠確定細胞中dnag-四鏈體含量。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法進一步包括：將所述接觸后細胞的細胞核進行染色定位處理；以及基于所述細胞核內(nèi)的熒光強度和熒光亮點的數(shù)目，以便確定所述細胞中dnag-四鏈體含量。dnag-四鏈體存在于細胞核，通過對細胞核進行染色定位，便于快速找到細胞核，進而檢測到結合有dnag-四鏈體的化合物產(chǎn)生的信號，從而能夠快速且準確地確定dnag-四鏈體含量。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，熒光強度的測定是利用激光共聚焦儀器進行的，其中，激光共聚焦儀器中包括：化合物的檢測通道以及染色劑的檢測通道，化合物檢測通道的激發(fā)波長為405nm，收集波長范圍為425～525nm；染色劑檢測通道的激發(fā)波長為635nm，收集波長范圍為650～750nm。激光共聚焦顯微鏡可以用來觀察不同的熒光探針分子在細胞內(nèi)的染色情況，由于化合物在425～525nm波長處能夠產(chǎn)生光信號，所以通過化合物檢測通道產(chǎn)生的光信號，確定dnag-四鏈體含量。若預先對接觸后的細胞進行染色定位處理，那么染色劑在650～750nm波長處能夠產(chǎn)生光信號，且該光信號與化合物所產(chǎn)生的光信號可以明顯區(qū)分，不會相互重疊，進而通過染色劑檢測通道產(chǎn)生的光信號快速找到細胞核，再通過化合物檢測通道產(chǎn)生的光信號確定dnag-四鏈體含量。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測dnag-四鏈體的方法進一步具有較強的準確性、較高的靈敏度、較好的穩(wěn)定性或者較簡便的操作。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該化合物具有良好的生物相容性，細胞毒性小，對dnag-四鏈體結構具有較高的選擇性，適用于細胞(尤其是活細胞)內(nèi)dnag-四鏈體的檢測。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測dnag-四鏈體的方法準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好且操作簡便。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，細胞為活細胞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術中大多數(shù)檢測dnag-四鏈體的探針都僅能夠檢測死細胞(固定細胞)，無法檢測活細胞中dnag-四鏈體。本發(fā)明的化合物不僅能夠與死細胞中的dnag-四鏈體發(fā)生特異性結合，還可以與活細胞中的dnag-四鏈體特異性結合。由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測dnag-四鏈體的方法準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好且操作簡便。

需要說明的是，對于染色處理所需要的染色劑的種類不作嚴格限定，可以根據(jù)實際需要進行選擇，只要能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞核進行染色，使其便于后續(xù)檢測中觀察即可。根據(jù)本發(fā)明的實施例，染色處理是利用59染色劑進行的。59染色劑是一種可用于染活細胞細胞核的染料，因為其激發(fā)波長和發(fā)射波長范圍可以與本發(fā)明的化合物區(qū)分開來，所以選擇用其來染活細胞細胞核，從而提高檢測結果的準確性。

試劑盒

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒包括前面所描述的化合物。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實施例的試劑盒能夠有效地檢測dnag-四鏈體，且檢測結果的準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好以及操作簡便。

本領域技術人員能夠理解的是，前面針對化合物所描述的特征和優(yōu)點，同樣適用于該試劑盒，在此不再贅述。

用途

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了前面化合物或試劑盒在檢測dnag-四鏈體中的用途。由此，利用該化合物或者試劑盒能夠有效地檢測dnag-四鏈體，且檢測結果的準確性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好以及操作簡便。

本領域技術人員能夠理解的是，前面針對化合物和試劑盒所描述的特征和優(yōu)點，同樣適用于該化合物或試劑盒在檢測dnag-四鏈體中的用途，在此不再贅述。

下面將結合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

在該實施例中，按照下列方法合成式(3)所示化合物(簡稱imt)：

1)合成t1化合物

將1.396g(8.5mmol)2-氨基-6-甲基苯并噻唑和2.73g(12.75mmol)4-甲基苯磺酸異丙酯加入到密封管中150℃加熱反應13h。得到的粗產(chǎn)物用乙酸乙酯懸浮，然后用乙醚清洗兩次。得到的固體沉淀物通過丙酮重結晶進行進一步分離純化，最終得到1.2g灰白色的t1化合物，產(chǎn)率40％。t1化合物的¹h-nmr(400mhz,dmso)δ9.88(2h,s)7.80-7.78(2hd)7.48-7.46(2hd)7.35-7.33(2hd)7.11-7.09(2hd)2.38(3hs)2.28(3hs)1.60-1.59(6hd)；esi-ms正離子峰在m/z＝207.0位置,計算的結果是[m+]＝207.3，實驗和計算結果基本是一致的。

2)合成t2化合物

向47ml質(zhì)量分數(shù)50％的koh溶液和50ml乙二醇的混合溶液中加入1.3gt1化合物，反應混合物在氮氣保護的環(huán)境中200℃加熱回流24h，然后在空氣中繼續(xù)攪拌反應24h。反應混合物冷卻至室溫，用飽和的nh4cl溶液稀釋，接著用ch2cl2進行萃取。得到的有機相用na2so4來干燥，然后過濾。過濾得到的液體旋干，得到的產(chǎn)物通過硅膠色譜柱進行進一步分離純化，梯度分離的條件是乙酸乙酯在石油醚中的比例是0％～2％，得到472.9mg黃色油狀t2化合物，產(chǎn)率77.1％。t2化合物的¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.05-7.01(4h,t)6.53-6.51(2hd)3.57-3.54(2hm)2.41(6hs)1.12-1.11(12hd)；esi-ms正離子峰在m/z＝361.3位置，計算的結果是[m+]＝361.6，實驗和計算結果基本是一致的。

3)合成t3化合物：

將107.1mg的步驟二得到的t2化合物和4.7ml干燥的乙醇在0℃的冰水浴中攪拌15min，然后加入224mg的nabh4固體?；旌衔镌谑覝叵聰嚢璺磻?h。將反應混合體系旋干，將剩余的殘留物用乙酸乙酯懸浮，傾倒入冷水中。有機層用水洗，然后用na2so4干燥。最后，過濾除去na2so4，溶劑旋蒸干，得到107mg粗產(chǎn)物t3化合物。esi-ms正離子峰在m/z＝181.0位置，計算的結果是[m+]＝181.1，實驗和計算結果基本是一致的。

4)合成式(3)所示化合物：

向185mgt3化合物和8.2ml干燥的mecn混合體系中加入388mg(2.11mmol)的4-二甲氨基苯甲酰氯，混合物在室溫下攪拌反應18h。反應混合體系用是水稀釋，產(chǎn)物用ch2cl2萃取。有機層用na2so4干燥，然后過濾除去na2so4。將濾液旋干，得到的產(chǎn)物通過硅膠色譜柱進行進一步分離純化，梯度分離的條件是甲醇在ch2cl2中的比例是0％～4％，得到15mg黃色粉末狀式(3)所示化合物，產(chǎn)率4.3％。式(3)所示化合物的¹h-nmr(400mhz,cdod)δ8.30-8.28(h,d)8.00(1hs)7.19-7.17(3hd)6.96-6.94(2hd)3.12(6hs)2.54(3h,s)1.84-1.82(6hd)；esi-ms正離子峰在m/z＝311.2位置,計算的結果是[m+]＝311.16，實驗和計算結果基本是一致的。

實施例2

在該實施例中，按照下列方法對活細胞系hela的dnag-四鏈體結構進行檢測。

1)活細胞培養(yǎng)

宮頸癌(hela)細胞在包含10％胎牛血清(fbs)和1％100u/ml雙抗的dmem培養(yǎng)基、在5％co2、37℃條件下培養(yǎng)48h。

2)配制探針溶液

將合成的imt分子溶在甲醇中配成1m母液，然后用水稀釋成500μm的探針溶液。

3)對活細胞進行染色

細胞在共聚焦培養(yǎng)皿中生長24h，加入2μm的探針溶液與細胞共同培養(yǎng)2h。除去細胞培養(yǎng)液，用pbs(ph7.4)緩沖液溶液洗滌細胞三次，然后用59細胞核染料對細胞核進行共染。

圖2顯示了imt探針標記活細胞hela細胞的染色結果。可以看出，圖(a)中imt標記的細胞核中出現(xiàn)均勻的熒光亮點，而對照的圖(b)中沒有加imt，細胞核中沒有熒光亮點，說明imt在細胞核中特異性地與dnag-四鏈體作用，產(chǎn)生可檢測信號。

4)激光共聚焦顯微鏡觀察

在型號為olympusfv1000-ix81的激光共聚焦儀器觀察細胞染色情況，在100×油鏡下使用。第一個通道：imt探針分子通道，激發(fā)波長405nm，收集波長范圍425～525nm；第二個通道：59細胞核染料通道，激發(fā)波長635nm，收集波長范圍650～750nm。

第一個通道觀察到是imt探針分子的染色結果，第二個通道觀察到的是活細胞細胞核染料59的染色結果。第一個通道觀察到了均勻的熒光亮點，代表的是探針分子imt與細胞核內(nèi)dnag-四鏈體作用的結果；第二個通道內(nèi)位置標記處的是細胞核的位置。

基于細胞核內(nèi)熒光強度和熒光亮點數(shù)量的，以便對細胞內(nèi)dnag-四鏈體含量進行定性分析。

實施例3

在該實施例中對活細胞系人類臍帶血內(nèi)皮細胞(huvec)中的dnag-四鏈體結構進行檢測。

1)活細胞培養(yǎng)

huvec在包含10％胎牛血清(fbs)和1％100u/ml雙抗的dmem培養(yǎng)基、在5％co2、37℃條件下培養(yǎng)48h。

2)配制探針溶液

將合成的imt分子溶在甲醇中配成1m母液，然后用水稀釋成500μm的探針溶液。

3)對活細胞進行染色

細胞在共聚焦培養(yǎng)皿中生長12h，加入10μm的imt分子與細胞共同培養(yǎng)48h。除去細胞培養(yǎng)液，用pbs(ph7.4)緩沖液溶液洗滌細胞三次，然后用59細胞核染料對細胞核進行共染。

圖3imt探針標記活細胞huvec細胞的染色結果?？梢钥闯?，圖(a)imt標記的細胞核中出現(xiàn)均勻的熒光亮點，而對照的圖(b)中沒有加imt，作用細胞核中沒有熒光亮點，說明imt在細胞核中特異性地與dnag-四鏈體作用。

4)激光共聚焦顯微鏡觀察

在型號為olympusfv1000-ix81的激光共聚焦儀器觀察細胞染色情況，在100×油鏡下使用。第一個通道：imt探針分子通道，激發(fā)波長405nm，收集波長范圍425-525nm；第二個通道：59細胞核染料通道，激發(fā)波長635nm，收集波長范圍650-750nm。

第一個通道觀察到是imt探針分子的染色結果，第二個通道觀察到的是活細胞細胞核染料59的染色結果。第一個通道觀察到了均勻的熒光亮點，代表的是探針分子imt與細胞核內(nèi)dnag-四鏈體作用的結果；第二個通道內(nèi)位置標記處的是細胞核的位置。

實施例4

在該實施例中，按照實施例2的方法對活細胞系hela的dnag-四鏈體結構進行檢測，區(qū)別在于，將imt替換為下式所示化合物，下式所示化合物的合成方式參照實施例1。

圖4顯示了上式所示化合物標記活細胞hela細胞的細胞核染色結果。可以看出，細胞核中出現(xiàn)均勻的熒光亮點，進而能夠通過該光信號確定細胞的dnag-四鏈體含量。

實施例5

在該實施例中，按照實施例2的方法對活細胞系hela的dnag-四鏈體結構進行檢測，區(qū)別在于，將imt替換為下式所示化合物，下式所示化合物的合成方式參照實施例1。

圖5顯示了上式所示化合物標記活細胞hela細胞的細胞核染色結果?？梢钥闯?，細胞核中出現(xiàn)均勻的熒光亮點，進而能夠通過該光信號確定細胞的dnag-四鏈體含量。

實施例6

在該實施例中，按照實施例2的方法對活細胞系hela的dnag-四鏈體結構進行檢測，區(qū)別在于，將imt替換為下式所示化合物，下式所示化合物的合成方式參照實施例1。

圖6顯示了上式所示化合物標記活細胞hela細胞的細胞核染色結果?？梢钥闯?，細胞核中出現(xiàn)均勻的熒光亮點，進而能夠通過該光信號確定細胞的dnag-四鏈體含量。

實施例7

在該實施例中，按照實施例2的方法對活細胞系hela的dnag-四鏈體結構進行檢測，區(qū)別在于，將imt替換為下式所示化合物，下式所示化合物的合成方式參照實施例1。

圖7顯示了上式所示化合物標記活細胞hela細胞的細胞核染色結果?？梢钥闯觯毎酥谐霈F(xiàn)均勻的熒光亮點，進而能夠通過該光信號確定細胞的dnag-四鏈體含量。

實施例8

在該實施例中，按照實施例2的方法對活細胞系hela的dnag-四鏈體結構進行檢測，區(qū)別在于，將imt替換為下式所示化合物，下式所示化合物的合成方式參照實施例1。

圖8顯示了上式所示化合物標記活細胞hela細胞的細胞核染色結果?？梢钥闯?，細胞核中出現(xiàn)均勻的熒光亮點，進而能夠通過該光信號確定細胞的dnag-四鏈體含量。

對比例1

在該對比例中，按照實施例2的方法對活細胞系hela的dnag-四鏈體結構進行檢測，區(qū)別在于，將imt替換為下式所示化合物，下式所示化合物的合成方式參照實施例1。

圖9顯示了上式所示化合物標記活細胞hela細胞的細胞核染色結果?？梢钥闯?，熒光標記主要集中在核仁上，即該化合物主要分散于核仁上，檢測的結果主要是核仁上的dnag-四鏈體含量。但是，dnag-四鏈體是均勻分布于細胞核內(nèi)，故利用該化合物無法準確地確定細胞內(nèi)的全部dnag-四鏈體含量，檢測結果偏低。本發(fā)明的化合物能夠均勻分散于細胞核內(nèi)，結合各處的dnag-四鏈體，從而能夠準確地確定細胞內(nèi)的dnag-四鏈體含量。

在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。