本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人tnf-α蛋白的新型純化方法。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子(tnf)主要由活化的巨噬細(xì)胞、nk細(xì)胞及t淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。1985年shalaby把巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的tnf命名為tnf-α，把t淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴毒素(lymphotoxin，lt)命名為tnf-β。tnf-α的生物學(xué)活性占tnf總活性的70％～95％，因此目前常說(shuō)的tnf多指tnf-α。
tnf-α功能主要為殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞、提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力、抗病毒與抗寄生蟲(chóng)感染、促進(jìn)髓樣白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化等，tnf-α是動(dòng)物體細(xì)胞免疫過(guò)程非常重要的一個(gè)引子，對(duì)動(dòng)物體抗腫瘤、抗感染等過(guò)程發(fā)揮重要作用。
目前已有的針對(duì)tnf-α的純化方法大多存在純化方法單一，產(chǎn)物純度不高，活性損失過(guò)多等問(wèn)題，現(xiàn)有的方法大多是針對(duì)單體形式的tnf-α進(jìn)行純化，而對(duì)多聚體形式的tnf-α幾乎不能得到或者得率極低，然而多聚體形式的tnf-α具有比單體tnf-α更重要的天然活性。鑒于目前純化方法存在的局限性，本發(fā)明建立一種全新的純化方法，通過(guò)陽(yáng)離子/陰離子交換樹(shù)脂的搭配，得到pi在6～8之間的蛋白，首先就對(duì)tnf-α進(jìn)行了較高純度的純化，再配合疏水層析柱最終得到精度純化的tnf-α蛋白，最重要的是該發(fā)明建立的純化方法不僅能對(duì)tnf-α單體進(jìn)行純化，還可以對(duì)多聚體形式的tnf-α進(jìn)行精細(xì)純化，大大降低了純化產(chǎn)物的活性損失，對(duì)保證tnf-α天然活性具有極其重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人tnf-α蛋白的新型純化方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種人tnf-α蛋白的新型純化方法，將人tnf-α蛋白依次經(jīng)過(guò)離子柱、疏水層析柱進(jìn)行精細(xì)純化，所述離子柱為至少一個(gè)陰性離子柱和/或陽(yáng)性離子柱，且在兩次離子柱處理之間使用除鹽柱除鹽處理。
優(yōu)選地，所述方法是將人tnf-α蛋白依次經(jīng)過(guò)sp(sulfopropyl)柱、除鹽柱、q(quaternaryammonium)柱和hic(hydrophobicinteractionchromatography)柱進(jìn)行精細(xì)純化。
優(yōu)選地，所述經(jīng)sp柱的純化處理包括以下步驟：
(1)樣品稀釋：將處理后的tnf-α蛋白上清液經(jīng)結(jié)合緩沖液a稀釋到適當(dāng)濃度；
(2)柱平衡：用去離子水洗滌sp柱，再使用結(jié)合緩沖液a進(jìn)行平衡；
(3)上樣：將稀釋后的樣品向平衡后的sp柱中加載，上樣流速控制在0.6～1cv/min；
(4)洗滌：用3～5個(gè)cv的結(jié)合緩沖液a繼續(xù)沖洗sp柱，使未結(jié)合的組分充分被沖洗下來(lái)；
(5)洗雜：用3～5個(gè)cv的洗雜緩沖液a洗滌sp柱，使結(jié)合不緊密的非目的蛋白盡可能的洗脫下來(lái)；
(6)洗脫：用2～3個(gè)cv的洗脫緩沖液a洗滌sp柱，使結(jié)合的蛋白充分的洗脫下來(lái)，收集洗脫液并保存。
優(yōu)選地，所述除鹽柱處理包括以下步驟：
(1)柱平衡：用去離子水洗滌除鹽柱，再使用結(jié)合緩沖液b平衡；
(2)上樣：取不超過(guò)除鹽柱柱體積20％的、經(jīng)過(guò)sp柱純化處理后得到的洗脫液，上樣至平衡后的除鹽柱中；
(3)洗滌：使用上樣量1.5～3倍體積的結(jié)合緩沖液b沖洗除鹽柱，收集洗滌液；
(4)洗雜：再使用2～3cv的結(jié)合緩沖液b沖洗除鹽柱，舍棄洗滌液；
(5)將步驟(3)得到的洗滌液重新上樣，重復(fù)步驟(3)～(4)，直至樣品全部脫鹽。
優(yōu)選地，所述經(jīng)q柱的純化處理包括以下步驟：
(1)樣品稀釋：將除鹽后的tnf-α樣品經(jīng)結(jié)合緩沖液b稀釋到適當(dāng)濃度，調(diào)ph＝8.5；
(2)柱平衡：用去離子水洗滌q柱，再使用結(jié)合緩沖液b平衡；
(3)上樣：將稀釋后的樣品向平衡后的q柱中加載，上樣流速控制在0.6～1cv/min；
(4)洗滌：用3～5個(gè)cv的結(jié)合緩沖液b繼續(xù)沖洗q柱，使未結(jié)合的組分充分被沖洗下來(lái)；
(5)洗雜：用3～5個(gè)cv的洗雜緩沖液b洗滌q柱，使結(jié)合不緊密的非目的蛋白盡可能的洗脫下來(lái)；
(6)洗脫：用2～2.5個(gè)cv的洗脫緩沖液b洗滌q柱，使結(jié)合的蛋白充分的洗脫下來(lái)，收集洗脫液并保存。
優(yōu)選地，所述經(jīng)hic柱的純化處理包括以下步驟：
(1)上樣前處理：將經(jīng)q柱處理后的樣品離心、去除沉淀；
(2)柱平衡：用去離子水洗滌hic柱，再使用柱平衡緩沖液平衡；
(3)上樣：將去除沉淀后的樣品向平衡后的hic柱中加載，上樣流速控制在0.5～1cv/min，收集流穿液；
(4)洗滌：上樣結(jié)束后，用3～5個(gè)cv的柱平衡緩沖液繼續(xù)沖洗hic柱，以充分沖洗掉未結(jié)合的蛋白樣品和雜質(zhì)；
(5)洗雜：用3～5個(gè)cv的洗雜緩沖液c洗滌加載樣品后的hic柱，收集洗脫液；
(6)洗脫：用2～3個(gè)cv的洗脫緩沖液c洗滌hic柱，使結(jié)合的蛋白充分的洗脫下來(lái)，收集洗脫液并保存。
更進(jìn)一步地，所述sp柱的
結(jié)合緩沖液a為20mm、ph＝5.5的檸檬酸鹽緩沖液，
洗雜緩沖液a為用結(jié)合緩沖液a配制的含0.1mnacl的緩沖液，
洗脫緩沖液a為用結(jié)合緩沖液a配制的含0.5mnacl的緩沖液，
洗柱緩沖液a為用結(jié)合緩沖液a配制的含1.0mnacl的緩沖液。
更進(jìn)一步地，所述除鹽柱或hic柱的
結(jié)合緩沖液b為20mm、ph＝8.5的tris-hcl緩沖液，
洗雜緩沖液b為用結(jié)合緩沖液b配制的含0.05mnacl的緩沖液，
洗脫緩沖液b為用結(jié)合緩沖液b配制的含0.12mnacl的緩沖液，
洗柱緩沖液b為用結(jié)合緩沖液b配制的含1.0mnacl的緩沖液。
更進(jìn)一步地，所述hic柱的
洗滌緩沖液為20mm、ph＝8.0的tris-hcl緩沖液，
柱平衡緩沖液為ph＝8.0用洗滌緩沖液配制的含1.5m硫酸銨的緩沖液，
洗雜緩沖液c為ph＝8.0用洗滌緩沖液配制的含0.51m硫酸銨的緩沖液，
洗脫緩沖液c為20mm、ph＝8.0的tris-hcl緩沖液，
樣品稀釋緩沖液為ph＝8.0用洗滌緩沖液配制的含3.0m硫酸銨的緩沖液。
優(yōu)選地，所述tnf-α蛋白來(lái)源于pcdna6.1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)過(guò)克隆篩選和懸浮馴化后獲得的懸浮培養(yǎng)穩(wěn)定細(xì)胞株發(fā)酵后收集細(xì)胞上清液而來(lái)。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明在于提供一種方便、快捷、可實(shí)驗(yàn)大批量樣本處理的tnf-α蛋白純化方法。該發(fā)明基于aktaexplorer全自動(dòng)蛋白純化系統(tǒng)，操作簡(jiǎn)便，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)樣品的自動(dòng)加載上樣、自動(dòng)洗滌、在線監(jiān)測(cè)、實(shí)時(shí)觀察等，能夠及時(shí)的根據(jù)樣品情況和后續(xù)對(duì)純化樣本的要求來(lái)調(diào)整純化過(guò)程。最終該發(fā)明確定了一套針對(duì)tnf-α的精度純化方法，經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換柱、除鹽柱、陰離子交換柱、疏水層析柱的分步純化后，獲得目的蛋白的純度可達(dá)到95％，最終蛋白純化得率可達(dá)到70％左右。
具體實(shí)施方式
為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，以下實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明而非對(duì)其加以限定。
1、sp柱純化tnf-a蛋白——結(jié)合pka>6.0的蛋白(spff90μm5ml)
1.1蛋白來(lái)源：tnf-a重組蛋白來(lái)源于pcdna6.1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞上清，收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液采用10000g，4℃，10min離心處理，收上清。再用0.45μm的濾器過(guò)濾一次，充分除去培養(yǎng)液中的細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。
1.2緩沖液配制
(1)結(jié)合緩沖液：
ph＝5.5檸檬酸鹽緩沖液20mm1lpka＝5.4
檸檬酸(m＝210.14)1.344g
檸檬酸鈉(m＝294.12)4g
(2)洗雜緩沖液：用結(jié)合緩沖液配制成含nacl終濃度為0.1m的緩沖液作為洗雜緩沖液，ph＝5.5。
(3)洗脫緩沖液：用結(jié)合緩沖液配制成含nacl終濃度為0.5m的緩沖液作為洗脫緩沖液，ph＝5.5。
(4)洗柱緩沖液：用結(jié)合緩沖液配制成含nacl終濃度為1m的緩沖液作為洗柱緩沖液，ph＝5.5。
(5)清潔及平衡柱緩沖液：0.5mnaoh溶液可用于柱子的徹底洗滌。20％乙醇(含0.2m乙酸鈉)用于離子柱的保存。
1.3tnf-a蛋白sp柱純化步驟
(1)處理后的di上清用起始緩沖液進(jìn)行10倍比稀釋(為了降低樣品起始離子強(qiáng)度)，調(diào)ph＝5.5。
(2)平衡sp柱：用5-10個(gè)柱體積(cv)的去離子水洗滌sp柱，然后再用5-10個(gè)cv的起始緩沖液沖洗sp柱。本發(fā)明使用的是aktaexplorer系統(tǒng)，應(yīng)沖洗直到基線、ph、電導(dǎo)穩(wěn)定時(shí)，即所有的未被結(jié)合的分子都被沖洗出分離柱。
(3)上樣：將處理后的樣品用aktaexplorer系統(tǒng)向sp柱加載。流速控制在0.6-1cv/min，即上樣流速控制在3-5ml/min。
(4)洗滌：用3-5個(gè)cv以上的起始緩沖液繼續(xù)沖洗分離柱，使未結(jié)合的組分充分被沖洗下來(lái)。沖洗至aktaexplorer系統(tǒng)軟件顯示基線一平，穩(wěn)定為止。
(5)洗雜：用3-5個(gè)cv以上的含有0.1mnacl的洗雜緩沖液洗滌sp柱，使結(jié)合不緊密的非目的蛋白盡可能的洗脫下來(lái)。
(6)洗脫：用2-3個(gè)cv的含有0.5mnacl的洗脫緩沖液洗滌sp柱，使結(jié)合的蛋白盡充分的洗脫下來(lái)。在洗脫過(guò)程中可對(duì)洗脫液分步收集，分別測(cè)定od值，以掌握目的蛋白的洗脫曲線。更換成洗脫液后，起始第1-1.5ml的洗脫液可以不收集。
(7)sp柱的清潔：在目的蛋白被充分洗脫下來(lái)后，應(yīng)對(duì)使用過(guò)的sp柱進(jìn)行清潔，以除去結(jié)合在柱子上的其他物質(zhì)，確保柱子中殘留的蛋白質(zhì)及其他成分被徹底清除。
(8)柱子的保存：清洗后的sp柱再用3-5cv的去離子水沖洗，然后再用含0.2m乙酸鈉的20％乙醇填充柱子，放4℃存放。
(9)純化樣品的保存：純化后洗脫獲得的目的蛋白測(cè)定其濃度后，可適當(dāng)加入一些蛋白保護(hù)成分，按照后續(xù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃情況，將蛋白分裝成適當(dāng)體積大小，放置于-80℃，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
2、q柱純化tnf-a蛋白——結(jié)合pka<8.0的蛋白(q-hp34μm5ml)
2.1緩沖液配制
(1)結(jié)合緩沖液：
ph＝8.5tris-hcl緩沖液20mm1lpka＝8.06
tris(m＝121.6)2.42g濃鹽酸1.6ml
(2)洗雜緩沖液：用結(jié)合緩沖液配制成含nacl終濃度為0.05m的緩沖液作為雜緩沖液，ph＝8.5。
(3)洗脫緩沖液：用結(jié)合緩沖液配制成含nacl終濃度為0.12m的緩沖液作為洗脫緩沖液，ph＝8.5。
(4)洗柱緩沖液：用結(jié)合緩沖液配制成含nacl終濃度為1m的緩沖液作為洗柱緩沖液，ph＝8.5。
(5)清潔及平衡柱緩沖液：0.5mnaoh溶液用于清洗層析柱。20％乙醇(含0.2m乙酸鈉)用于離子柱的保存。
2.2tnf-a蛋白sp柱后樣品，除鹽柱除鹽處理
(1)tnf-a蛋白sp柱后樣品需要進(jìn)行除鹽處理。
(2)平衡除鹽柱：除鹽柱使用g-25除鹽柱，先用去離子水沖洗除鹽柱3-5cv，再用q柱上樣緩沖液平衡除鹽柱。
(3)上樣：本發(fā)明采用上樣1ml，然后用q柱上樣緩沖液沖洗2ml，收集洗滌液；然后再用2-3cv的上樣緩沖液沖洗除鹽柱，以確保除盡除鹽柱中的鹽分，重復(fù)步驟(3)，直至樣品全部脫鹽。
(4)除鹽過(guò)程相當(dāng)于對(duì)樣品進(jìn)行2倍比稀釋，最終除鹽后的樣品濃度大約為起始濃度的40％左右，總回收率大約為80％。
(5)樣品除鹽后，對(duì)除鹽柱用去離子水徹底清洗后再用20％乙醇保存。
2.3、tnf-a蛋白q柱純化步驟
(1)除鹽后的tnf-a樣品用起始緩沖液再進(jìn)行10倍比稀釋，調(diào)ph＝8.5。
(2)平衡q柱：用5-10個(gè)柱體積(cv)的去離子水洗滌q柱，然后再用5-10個(gè)cv的起始緩沖液沖洗q柱。直到akta系統(tǒng)中基線、ph、電導(dǎo)穩(wěn)定時(shí)，即所有的未被結(jié)合的分子都被沖洗出分離柱。
(3)上樣：將除鹽柱處理后的樣品用aktaexplorer系統(tǒng)向q柱加載。流速控制在0.6-1cv/min，即上樣流速控制在3-5ml/min。
(4)洗滌：用3-5個(gè)cv以上的起始緩沖液繼續(xù)沖洗分離柱，使未結(jié)合的組分充分被沖洗下來(lái)。使用akta系統(tǒng)沖洗至基線，電導(dǎo)等穩(wěn)定為止。
(5)洗雜：用3-5個(gè)cv以上的<0.05mnacl的洗雜緩沖液洗滌q柱。
(6)洗脫：用2-2.5個(gè)cv的含有0.12mnacl的洗脫緩沖液洗滌q柱，使結(jié)合的蛋白盡充分的洗脫下來(lái)。在洗脫過(guò)程中可對(duì)洗脫液分步收集，分別測(cè)定od值，以掌握目的蛋白的洗脫曲線。
(7)q柱的清潔：在目的蛋白被充分洗脫下來(lái)后，應(yīng)對(duì)使用過(guò)的q柱進(jìn)行清潔，以除去結(jié)合在柱子上的其他物質(zhì)。使用3-5cv的含有1mnacl的洗脫緩沖液洗滌q柱。
(8)柱子的保存：清洗后的q柱再用3-5cv的去離子水沖洗，然后再用含0.2m乙酸鈉的20％乙醇填充柱子，于4℃存放。
(9)純化樣品的保存：純化后洗脫獲得的目的蛋白測(cè)定其濃度后，可適當(dāng)加入一些蛋白保護(hù)成分，按照后續(xù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃情況，將蛋白分裝成適當(dāng)體積大小，放置于-80℃，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
q柱純化起到對(duì)目的tnf-a蛋白中度純化的作用，純化產(chǎn)物中目的蛋白純度較sp柱有較大程度的提高，目的蛋白純度約占總蛋白的90％以上。兩步離子柱純化獲得的蛋白質(zhì)理論上應(yīng)為6.0<pka<8.0之間的組分。
3、hic柱純化tnf-a蛋白——蛋白精細(xì)純化(hicbutylhp34μm1ml)
疏水柱純化蛋白的原理與離子柱不同的是，該種填料不是以蛋白所帶電荷作為選擇條件的，而是以蛋白自身氨基酸組成及空間結(jié)構(gòu)決定的蛋白自身的疏水性物理性質(zhì)來(lái)對(duì)混合蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離的。
3.1本發(fā)明采用丁基(butyl-hp)高分辨率柱子作為hic純化用柱子。
3.2緩沖液配制
(1)洗滌緩沖液b：
ph＝8.0tris-hcl緩沖液20mm1lpka＝8.06
tris(m＝121.6)2.42g濃鹽酸1.6ml
(2)柱平衡緩沖液a：用洗滌緩沖液配制成含硫酸銨終濃度為1.5m的緩沖液，調(diào)節(jié)ph＝8.0。
(3)洗雜緩沖液：用洗滌緩沖液配制成含硫酸銨(終濃度為0.51m)的洗雜緩沖液，調(diào)節(jié)ph＝8.0。
(4)洗脫緩沖液：直接用ph＝8.020mmtris-hcl的緩沖液，也就是洗滌緩沖液。
(5)樣品稀釋緩沖液：用洗滌緩沖液配制成含硫酸銨終濃度為3m的緩沖液，調(diào)節(jié)ph＝8.0。
(6)配制電導(dǎo)為83cs/cm的洗雜緩沖液，洗脫直接用tris-hcl：
3.3蛋白耐鹽濃度條件的確定
本發(fā)明使用硫酸銨作為疏水介質(zhì)，首先用不含硫酸銨的tris-hcl緩沖液對(duì)q柱洗脫下來(lái)的樣品進(jìn)行稀釋，然后用含3m硫酸銨的tris-hcl緩沖液緩慢滴入稀釋后的樣品溶液中。本發(fā)明將硫酸銨的終濃度定為1.5m，以此濃度為上樣硫酸銨濃度
3.4上樣前樣品的處理
上柱前還應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行處理，以除去沉淀物質(zhì)。用10000g，4℃，10min離心以去除沉淀。
3.5tnf-a蛋白hic純化步驟：
(1)柱子平衡：用去離子水沖盡原h(huán)ic柱中的20％乙醇保存液，再用3-5cv的柱平衡緩沖液沖洗3-5cv，平衡hic柱，直至aktaexplorer系統(tǒng)中基線平穩(wěn)。
(2)上樣：hic純化過(guò)程使上樣流速為1cv/min，即1ml/min，收集流穿液，以備檢測(cè)。
(3)洗滌：上樣結(jié)束后，再用3-5cv的柱平衡緩沖液，以充分沖洗掉未結(jié)合的蛋白樣品和雜質(zhì)。
(4)洗雜：用3-5cv的洗雜緩沖液洗滌加載樣品后的hic柱，收集洗脫液，以備檢測(cè)使用。
(5)洗脫：用2-3cv的洗脫緩沖液對(duì)tnf-a蛋白進(jìn)行洗脫。
(6)清潔柱子：目的蛋白洗脫后，再用3-5cv的去離子水對(duì)柱子進(jìn)行徹底清洗，然后將柱子用20％乙醇保存。
最終經(jīng)過(guò)sp-q-hic純化后獲得高純度的目的蛋白，純度可達(dá)95-98％以上，測(cè)定濃度后按照后續(xù)實(shí)驗(yàn)規(guī)劃，向蛋白溶液中加入適當(dāng)?shù)牡鞍妆Ｗo(hù)劑，分裝后凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
4、純化后蛋白的保存
純化后的目的蛋白測(cè)定濃度后，應(yīng)加入蛋白酶抑制劑，如pmsf、dta、胃蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶抑制劑等。另外根據(jù)需要還可以加入甘油或者防腐劑等蛋白保護(hù)劑；最后應(yīng)分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
5、純化柱的處理與保存
5.1離子交換樹(shù)脂反復(fù)使用多次后會(huì)出現(xiàn)阻力增大，柱壓升高，純化能力下降等現(xiàn)象，因此每次在純化結(jié)束后都要對(duì)離子交換柱進(jìn)行充分的洗滌和平衡。
5.2sp柱每次使用后經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚硪话銜?huì)恢復(fù)到初始狀態(tài)，但q柱隨著重復(fù)使用次數(shù)的增加，在柱子的頂部逐漸開(kāi)始變成棕色，其純化效果會(huì)逐漸降低。
5.3一般純化結(jié)束后可選擇使用100％離子強(qiáng)度的緩沖液或高ph或低ph緩沖液沖洗填料。
5.4使用完的離子交換樹(shù)脂應(yīng)保存在含有0.2m乙酸鈉的20％乙醇中，放置4℃保存。每次使用前可先用去離子水反復(fù)沖洗柱料5cv以上，以保證將乙醇洗凈。
5.5值得注意的是：每次樣品加載aktaexplorer系統(tǒng)前都要對(duì)系統(tǒng)各管路進(jìn)行充分的洗滌和平衡，使用后同樣進(jìn)行徹底的清洗，最終系統(tǒng)管路中加載入含20％乙醇的保護(hù)液。各層析柱的使用處理同akta系統(tǒng)一樣進(jìn)行。
以上所述實(shí)施方式僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍內(nèi)。